ESPECTROMETRÍA III

1-Espectrometría de luminiscencia
➢ Luminiscencia es todo fenómeno de emisión de luz que no está asociado a altas temperaturas.
➢ Es la luz fría en contraposición de la incandescente
➢ Hay moléculas que, además de calor, se desactivan emitiendo luz.
➢ Los fenómenos luminiscentes se clasifican en:
❖ Fotoluminiscencia ❖ Quimioluminiscencia
❖ Fluorescencia ❖ Bioluminiscencia
❖ Fosforescencia ❖ Electroquimioluminiscencia
➢ Los métodos se conocen como procedimientos luminiscentes moleculares
➢ FOTOLUMINISCENCIA: La fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que la excitación se consigue
mediante la absorción de fotones. Se diferencian en que la fluorescencia presenta una vida corta y en
la fosforescencia se mantiene durante un tiempo más largo, después de haber acabado la irradiación.
➢ En la mayoría de los casos, la emisión fotoluminiscente, es de mayor longitud de onda que la radiación
utilizada para su excitación, generalmente en el rango del visible.
➢ Los equipos que se utilizan se llaman fluorímetros o espectrofluorímetros. La lámpara es de arco de
xenón. Utilizan dos monocromadores. El detector se coloca en un ángulo de 90º con respecto al haz de
luz incidente. Las cubetas deben ser de cuarzo con las 4 caras transparentes y estar termostatizadas.
➢ Aplicaciones de la fotoluminiscencia
❖ Determinación de especies inorgánicas, orgánicas y bioquímicas
❖ Cromatografía.
❖ Análisis de gases
❖ Detección de sangre en ciencias forenses (luminol, hemasceína, etc.)
❖ Actualmente se utilizan Ac monoclonales marcados con marcadores fluorescentes para
detectar sustancias mediante reacciones Ag-Ac

2.1-Espectrometría de dispersión de la radiación: introducción

Cuando un haz de luz choca contra una suspensión de partículas, sufre una serie de fenómenos:

➢ Absorción ➢ Transmisión ➢ Reflexión ➢ Dispersión

La dispersión de la luz depende de una serie de factores:

➢ Tamaño de partícula
➢ PM y [ ] de partículas
➢ λ

➢ Distancia

Para medir la dispersión de la luz se utiliza la turbidimetría y la nefelometría

Aplicaciones: para determinar proteínas plasmáticas específicas como las apolipoproteínas,

ceruloplasmina, albúmina,
2.2- Turbidimetria
Es la medida de la disminución de la intensidad de un haz de luz incidente causado, no por la absorción,
sino por la dispersión que se origina cuando la luz pasa por una suspensión de partículas. La disminución
de la intensidad se puede medir como %T o como A

Se mide en la misma dirección que el haz de luz incidente.

Suele utilizarse cuando la [ ] de la suspensión es elevada o el tamaño de las partículas es grande.

Hay que tener cuidado con la sedimentación

2.3.- Nefelometria
Es la medida de la luz dispersada en ángulos diferentes al de incidencia, entre 15º y 90º, generalmente 90º.

Se mide en nefelómetros que tienen el sistema de detección situado en los ángulos dichos.

2.4- Aspectos prácticos

➢ Efecto matriz ➢ λ

2.5- Tipos de análisis

➢ Muchas determinaciones se basan en la detección de la luz tras enfrentar la sustancia a determinar
(Ag) a un Ac de alta afinidad, así se forma un complejo Ag-Ac que es una partícula en suspensión.
➢ A punto final: requiere blanco de reactivo. Para hacer la lectura debe transcurrir un tiempo hasta que
la formación de complejos Ag-Ac se estabilice y se produzca una dispersión constante
➢ De velocidad o cinético: no se necesita blanco. Se mide el incremento de la intensidad de la dispersión
en un intervalo de tiempo. Se mide en los primeros minutos, en el tiempo que tiene lugar el máximo
cambio de intensidad de luz dispersada.

3-REFRACTOMETRÍA DE LÍQUIDOS
La refracción es la desviación que experimentan los rayos luminosos al pasar de un medio transparente de
densidad determinada a otro cuya densidad es distinta de la del anterior.

La luz se propaga con velocidades diferentes dependiendo de la densidad del medio por el que lo hace:
cuanto mayor es la densidad de éste tanto más lenta es la propagación de la luz. Este cambio de velocidad
se manifiesta en un cambio de la dirección que es en lo que se basa este fenómeno. El ángulo de desvío se
denomina ángulo de refracción

El índice de refracción (IR) de un medio es la relación entre la velocidad de la luz en el vacío y la velocidad
de la luz a su paso por dicho medio. Su valor es directamente % a la [ ] de sustancias disueltas en el mismo,
por lo que midiendo la relación entre los dos índices de refracción podemos calcular la [ ] de sustancias en
el medio.

Hay muchos tipos de refractómetros y los más actuales leen digitalmente el IR y muestran los resultados
en una pantalla.

Aplicaciones: en la industria alimentaria para comprobar la pureza de ciertos alimentos, el contenido de

azucares de los zumos, etc. En el laboratorio clínico no se suelen utilizar aunque hay refractómetros
clínicos que miden proteínas totales en suero y densidad de orina.
4.1-Fotometría de reflectancia. (reflectometría). Química seca.

Introducción
Cuando un haz de luz incide sobre una superficie, la luz es reflejada por esta superficie, produciéndose a la
vez dos tipos de reflexión:

➢ Una reflexión especular

➢ Una reflexión difusa (reflectancia),

Dentro de la fase sólida, la luz sufre una serie de fenómenos de absorción y dispersión.

Este tipo de reflexión es de interés para las mediciones que se realizan con las técnicas de química seca.

4.2-Fotometría de reflectancia: Espectrofotómetro de reflexión

La fotometría de reflectancia implica la medida de la intensidad de la luz que es reflejada por una fase
sólida, tras iluminar ésta con un haz de luz de una longitud de onda, es absorbida por los productos de
interés.

Los espectrofotómetros de reflexión miden la reflectancia y la relacionan con la [] del analito de interés.

Sus componentes son:

➢ Fuente de luz
➢ Sistemas ópticos: consisten en combinaciones de lentes, espejos y filtros.
➢ Detector y procesador de datos
➢ Lectura: se puede hacer de dos formas

4.3-Espectrofotómetro de reflexión: tipos de lectura

Lectura sobre la superficie
La muestra se aplica sobre la superficie del reactivo, difunde y se produce la reacción. El color resultante se
determina midiendo la reflectancia sobre la superficie. Se emplea en sistemas que utilizan tiras reactivas.

Lectura por el reverso de la superficie

La muestra se aplica sobre la superficie del reactivo, difunde y se produce la reacción. La lectura se hace
por el reverso de la superficie de la muestra. Se usa en sistemas que utilizan reactivos multicapas o slides.

4.4-Fotometria de reflectancia: reactivos de química seca

Los reactivos se encuentran en fase sólida, de forma deshidratada: una de las diferencias fundamentales
con la fotometría de absorción. La muestra se sitúa sobre estos reactivos de fase solida (tiras reactivas,
reactivos multicapa). Todos los componentes necesarios para que se produzca la reacción se encuentran
impregnados en estas unidades, en las que tiene lugar la reacción y a partir de aquí la lectura.

Modo de empleo: la muestra que contiene el analito a determinar (suero, plasma, sangre total, orina) se
aplica sobre la superficie del reactivo en fase sólida, y a partir de esta difunde a la matriz, disolviendo los
componentes de reacción que contiene; cuando los reactivos se disuelven se produce la reacción, que se
cuantificara por fotometría de reflectancia.
Las tiras donde van los reactivos incorporan unos códigos magnéticos que incluyen toda la información
que el equipo requiere para el análisis.

4.5-Fotometría de reflectancia: sistemas reactivos

Tiras reactivas. Se utilizan para:

➢ análisis de orina
➢ autocontrol de la glucemia
➢ en sistemas de diagnóstico rápido en la consulta médica y a la cabecera del enfermo.

Consisten, básicamente en un soporte de plástico que sirve de soporte a una matriz de celulosa que
contiene los reactivos secos necesarios para que se produzca una reacción con el componente a estudiar.

4.5-Fotometría de reflectancia: sistemas reactivos

Películas multicapa o slides, constituidas por diferentes capas muy finas, a través de las cuales se van
produciendo todas las etapas necesarias para la determinación cuantitativa del analito. Tiene la apariencia
de una diapositiva y está constituido por cuatro capas (que incluyen todos los componentes del sistema):

➢ Capa difusora: sobre ella se deposita la muestra.

➢ Capa reactiva: contiene los reactivos en una o más capas y en condiciones muy controladas.
➢ Capa indicadora: Es la capa donde se forman los complejos coloreados que serán cuantificados por
espectrometría de reflexión.
➢ Capa soporte: es la base del slide, sobre la que se depositan las demás capas. Es una capa de un
material plástico transparente, ya que deja pasar la luz que permitirá la reacción.

4.6-Fotometría de reflectancia: ventajas y desventajas

Ventajas: El usuario solo necesita aplicar la muestra al reactivo en fase sólida para iniciar el análisis, que
tiene lugar en unos minutos No se precisa preparación previa de los reactivos. Son únicos para cada
parámetro y desechables. Tienen larga estabilidad. Son fáciles de almacenar.

Desventajas: Su costo es más elevado que el de la química convencional. No es práctico para laboratorios
con gran carga de trabajo, ya que por cada tira solo se puede realizar la determinación de un analito.