ESPECTROFOTOMETRIA

Mg. Giancarlo Alvarez

 CONCEPTO
• La espectrofotometría es la medida cuantitativa de las propiedades de
reflexión o transmisión de un material en función de la longitud de
onda. Es más específico que el término espectroscopia
electromagnética ya que la espectrofotometría trata con luz visible,
ultravioleta cercano e infrarrojo cercano.
 RESUMEN
• La espectrofotometría es una herramienta que depende del análisis
cuantitativo de las moléculas en función de la cantidad de luz
absorbida por los compuestos coloreados. La espectrofotometría
utiliza fotómetros, conocidos como espectrofotómetros, que pueden
medir la intensidad de un rayo de luz en función de su color (longitud
de onda). Las características importantes de los espectrofotómetros
son el ancho de banda espectral (el rango de colores que puede
transmitir a través de la muestra de prueba), el porcentaje de
transmisión de muestra, el rango logarítmico de absorción de muestra
y algunas veces un porcentaje de medición de reflectancia.
 RESUMEN
• Un espectrofotómetro se usa comúnmente para medir la transmitancia o la
reflectancia de soluciones, sólidos transparentes u opacos o gases. Aunque muchos
productos bioquímicos son coloreados, absorben luz visible y por lo tanto pueden
medirse mediante procedimientos colorimétricos, incluso los productos bioquímicos
incoloros a menudo se pueden convertir en compuestos coloreados adecuados para
reacciones cromogénicas formadoras de color para producir compuestos adecuados
para análisis colorimétricos.
• La absorción de la luz se debe a la interacción de la luz con los modos electrónicos y
vibratorios de las moleculas. Cada tipo de molécula tiene un conjunto individual de
niveles de energía asociados con la composición de sus enlaces químicos y núcleos y
así absorberá la luz de longitudes de onda o energías específicas, dando como
resultado propiedades espectrales únicas. Esto se basa en su composición específica
y distinta.
 RESUMEN
• Un ejemplo de un experimento en el que se usa espectrofotometría
es la determinación de la constante de equilibrio de una solución. Una
reacción química dentro de una solución puede ocurrir de forma
reversible o irreversible, donde los reactivos forman productos y los
productos se descomponen en reactivos. En algún momento, esta
reacción química alcanzará lo que se denomina punto de equilibrio.
Para determinar las concentraciones respectivas de reactivos y
productos en este punto, la transmitancia de la luz de la solución
puede probarse usando espectrofotometría. La cantidad de luz que
pasa a través de la solución es indicativa de la concentración de
ciertos químicos que no permiten el paso de la luz.
 USOS
• El uso de espectrofotómetros abarca diversos campos científicos, como la
física, la ciencia de los materiales, la química, la bioquímica y la biología
molecular. Son ampliamente utilizados en muchas industrias, incluidos los
semiconductores, la fabricación de láser y óptica, la impresión y el examen
forense, así como en laboratorios para el estudio de sustancias químicas. La
espectrofotometría se usa a menudo en mediciones de actividades
enzimáticas, determinaciones de concentraciones de proteínas,
determinaciones de constantes cinéticas enzimáticas y mediciones de
reacciones de unión a ligandos. En última instancia, un espectrofotómetro
puede determinar, dependiendo del control o la calibración, qué y cuanto
de una sustancia esta presente en una muestra a través de los cálculos de
las longitudes de onda observadas.
ESPECTRO ELECTROMAGNETICO
 HISTORIA
• Fue inventado por Arnold O. Beckman en 1940. Empezaría con la
invención del Modelo A, donde se utilizó un prisma de vidrio para
absorber la luz ultravioleta. Se encontró que esto no dio resultados
satisfactorios, por lo tanto, en el Modelo B, hubo un cambio de un
prisma de vidrio a uno de cuarzo que permitió mejores resultados de
absorbancia. A partir de ahí, el Modelo C nació con un ajuste a la
resolución de la longitud de onda. El último y más popular modelo se
convirtió en el Modelo D, que ahora se reconoce mejor como el
espectrofotómetro DU que contenía la caja del instrumento, la
lámpara de hidrógeno con un continuo ultravioleta y un mejor
monocromador. Fue producido desde 1941 hasta 1976.
 HISTORIA
• En palabras del Premio Nobel de Química Bruce Merrifield: era
"probablemente el instrumento más importante jamás desarrollado para el
avance de la biociencia".
• Una vez que se descontinuó en 1976, Hewlett-Packard creó el primer
espectrofotómetro de ensayo de diodos comercialmente disponible en 1979
conocido como HP 8450A. Los espectrofotómetros de ensayo de diodos
difieren del espectrofotómetro original creado por Beckman porque fue el
primer espectrofotómetro controlado por microprocesador de un solo haz
que escaneó múltiples longitudes de onda a la vez en segundos. Irradia la
muestra con luz policromática que absorbe la muestra en función de sus
propiedades. Luego se transmite de vuelta al enrutar la matriz de fotodiodos
que detecta la región de longitud de onda del espectro.
 DISEÑO
• Hay dos clases principales de dispositivos: haz simple y doble haz. Un
espectrofotómetro de doble haz compara la intensidad de la luz entre dos
trayectorias de luz, una ruta que contiene una muestra de referencia y la
otra la muestra de prueba. Un espectrofotómetro de haz simple mide la
intensidad de luz relativa del haz antes y después de insertar una muestra de
prueba. Aunque las mediciones de comparación de los instrumentos de
doble haz son más fáciles y más estables, los instrumentos de haz simple son
ópticamente más simples y compactos.
• La mayoría de los espectrofotómetros de infrarrojo medio modernos utilizan
una técnica de transformada de Fourier para adquirir la información
espectral. Esta técnica se llama espectroscopía infrarroja de transformada de
Fourier.
 DISEÑO
• Al realizar mediciones de transmisión, el espectrofotómetro compara
cuantitativamente la fracción de luz que pasa a través de una solución de
referencia y una solución de prueba, luego compara electrónicamente las
intensidades de las dos señales y calcula el porcentaje de transmisión de la
muestra en comparación con el estándar de referencia. La luz de la lámpara
fuente pasa a través de un monocromador, que difracta la luz en un "arcoíris"
de longitudes de onda a través de un prisma giratorio. El valor de transmitancia
o reflectancia para cada longitud de onda de la muestra de ensayo se compara
luego con los valores de transmisión o reflectancia de la muestra de referencia.
La mayoría de los instrumentos aplicarán una función logarítmica a la relación
de transmitancia lineal para calcular la “Absorbancia" de la muestra, un valor
que es proporcional a la "concentración" del químico que se mide.
 DISEÑO
• En un espectrofotómetro de matriz, la secuencia es la siguiente:

1. La fuente de luz se ilumina en la muestra y se enfoca en una rendija

2. La luz transmitida se refracta en un arco iris con la rejilla de reflexión
3. La luz resultante golpea el dispositivo fotodetector que compara la
intensidad del haz
4. Los circuitos electrónicos convierten las corrientes relativas en
porcentajes de transmisión lineal y/o valores de
absorbancia/concentración.
FUNCIONAMIENTO
 USOS EN LABORATORIO
• La espectrofotometría es una técnica importante utilizada en muchos
experimentos bioquímicos que implican aislamiento de ADN, ARN y proteínas,
cinética enzimática y análisis bioquímicos. Dado que las muestras en estas
aplicaciones no están disponibles en grandes cantidades, son especialmente
adecuadas para ser analizadas en esta técnica no destructiva. Una breve
explicación del procedimiento de espectrofotometría incluye comparar la
absorbancia de una muestra en blanco que no contiene un compuesto
coloreado con una muestra que contiene un compuesto coloreado. Esta
coloración puede lograrse mediante un colorante o mediante una reacción
enzimática. El espectrofotómetro se utiliza para medir compuestos coloreados
en la región visible de la luz (entre 350 nm y 800 nm), por lo que se puede
utilizar para encontrar más información sobre la sustancia que se estudia.
 USOS EN LABORATORIO
• En experimentos bioquímicos, se elige una propiedad química y/o física y
el procedimiento que se usa es específico de esa propiedad para obtener
más información sobre la muestra, como la cantidad, pureza, actividad
enzimática, etc. La espectrofotometría se puede usar para una serie de
técnicas tales como determinar la absorbancia de longitud de onda
óptima de las muestras, determinar el pH óptimo para la absorbancia de
las muestras, determinar las concentraciones de muestras desconocidas
y determinar la constante de equilibrio de varias muestras.
• Los datos espectrofotométricos también pueden usarse junto con la
ecuación de Beer-Lambert, para determinar diversas relaciones entre la
transmitancia y la concentración, y la absorbancia y la concentración.
 USOS EN LABORATORIO
• Debido a que un espectrofotómetro mide la longitud de onda de un
compuesto a través de su color, se puede agregar una sustancia de
unión de colorante para que pueda sufrir un cambio de color y
medirse. Es posible conocer las concentraciones de una mezcla de dos
componentes utilizando los espectros de absorción de las soluciones
estándar de cada componente. Se considera que es un instrumento
altamente preciso que también es muy sensible y por lo tanto,
extremadamente preciso, especialmente en la determinación del
cambio de color.
 LEY DE LAMBERT-BEER
• Imaginemos también que hacemos dos medidas:
• La primera medida DE la muestra será una disolución blanco que
contiene todos los componentes menos la muestra de interés (I ).
0

• La segunda medida se hará en presencia del analito (cromóforo) que

deseemos estudiar. En este caso la intensidad de luz que llega al
lector será (I).
• Existen dos maneras de expresar la relación entre I e Io. La relación
directa se denomina transmitancia (T), mientras que se denomina
absorbancia al logaritmo con signo cambiado de la transmitancia.
FORMULAS

A = C.ε.L