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Análisis Bioquímico

2. Técnicas utilizadas en el
laboratorio de bioquímica
clínica - II
DOCUMENTO1
 ÍNDICE
PRESENTACIÓN
CONOCIMIENTOS PREVIOS
OBJETIVOS
ESPECTROMETRÍA DE DISPERSIÓN DE LA RADIACIÓN........................
TURBIDIMETRIA .....................................................................................
NEFELOMETRÍA .....................................................................................
REFRACTOMETRÍA DE LÍQUIDOS ............................................................
QUÍMICA SECA ...........................................................................................
OSMOMETRÍA ............................................................................................
CROMATOGRAFÍA .....................................................................................
CROMATOGRAFÍA PLANA ....................................................................
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA.........................................................
CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC) .............
CROMATOGRAFÍA DE GASES ........................................................
AUTOMATIZACIÓN .....................................................................................
TIPOS DE ANALIZADORES
FASES ANALISIS EN LA AUTOMATIZACION ........................................
7. USO EFICIENTE DE LOS RECURSOS ...................................................
RESUMEN ...................................................................................................
RECAPITULACIÓN .....................................................................................
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................

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 PRESENTACIÓN

En las unidades I y II de este módulo vamos a estudiar la aplicación de las

principales técnicas utilizadas en el laboratorio de bioquímica clínica, como las
técnicas espectroscópicas, cromatográficas, etc. Por ello te recomendamos que
visites la página web de la Sociedad Española de medicina del laboratorio
http://www.seqc.es/

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 CONOCIMIENTOS PREVIOS
Para estudiar esta unidad necesitas conocer:
 Conceptos básicos de física https://es.wikipedia.org/wiki/Física
electromagnetismo, física atómica y molecular, óptica, electricidad, etc.
 Conceptos básicos de química https://es.wikipedia.org/wiki/Química y
biología https://es.wikipedia.org/wiki/Biología.

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 OBJETIVOS
En esta unidad se trata de ver…
 La espectrometría de dispersión de la radiación, características, ley de
dispersión de Rayleigh y aplicaciones clínicas.
 Turbidimetría y nefelometría, como espectrometrías de dispersión de la
radiación. Características, instrumentación de medida y aplicaciones
clínicas.
 Refractometría de líquidos, estudio del índice de refracción. Utilización
del refractómetro de Abbé como técnica de medida y aplicaciones
clínicas.
 Fotometría de reflectancia. Química seca, características. Tiras
reactivas, como se fabrican y su uso clínico. Uso del reflectómetro.
 Osmometría, características, instrumentación de medida y aplicaciones
químicas.
 Cromatografía, en qué consiste y como se clasifican, siguiendo
diferentes criterios: cromatografía de adsorción, de reparto, de
intercambio iónico, de exclusión, etc. Cromatografía plana en sus dos
vertientes cromatografía en papel y en capa fina. Cromatografía en
columna con el estudio de Cromatografía liquida de alta eficacia y
cromatografía de gases. Se verán instrumentos de medida y
aplicaciones clínicas.
 Automatización. Analizadores automáticos. Tipos de analizadores según
su función: analizadores de química clínica, hematológicos, medición de
gases en sangre, identificación bacteriana, etc. Aplicación en las
diferentes fases del proceso: preanalítica, analítica y postanalítica.
 Uso eficiente de los recursos.

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 ESPECTROMETRÍA DE
DISPERSIÓN DE LA RADIACIÓN
La dispersión https://es.wikipedia.org/wiki/Dispersión_(física) de la luz es un
fenómeno que se produce cuando al incidir un haz de luz sobre una partícula en
suspensión sucede la separación de las ondas de distinta frecuencia. La luz puede
sufrir procesos de dispersión parte de la luz se dispersa, absorción parte de la luz
se absorbe y reflexión parte de la luz se refleja.
La luz dispersada puede variar dependiendo de: el tamaño y peso molecular de
las partículas, de la longitud de onda de la luz incidente, de la distancia del
detector a la cubeta y de la concentración de partículas. Todos estos factores se
relacionan con la Ley de dispersión de Rayleigh.
La Ley de dispersión de Rayleigh
[Link:https://es.wikipedia.org/wiki/Dispersión_de_Rayleigh] enuncia:
 Cuando la longitud de onda es mucho mayor que el tamaño de la
partícula, la luz se dispersa de forma homogénea alrededor de la
partícula, con menor intensidad a 90º del haz incidente.
 Cuando la longitud de onda es del mismo tamaño que la partícula,
se genera una dispersión en la misma dirección que el haz de
incidencia, se proyecta más hacia delante que hacia atrás.
 Cuando la longitud de onda es significativamente menor que el
tamaño de la partícula, la dispersión de la luz es visiblemente hacia
adelante, es decir en la misma dirección que la luz incidente.

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En el laboratorio clínico se aplica este método de dispersión de la luz al estudio
de las interacciones antígeno-anticuerpo, ya que el tamaño normal de estos
complejos entra dentro del tamaño de longitud de onda se sitúa entre el
ultravioleta y el infrarrojo.
En el laboratorio clínico se utilizan dos técnicas de medida de la dispersión de
partículas suspendidas en líquidos:
 Turbidimetría.
 Nefelometría.

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 TURBIDIMETRÍA
La turbidimetría. Esta técnica mide la intensidad de un haz de luz incidente
cuando pasa a través de una suspensión de partículas. La turbidimetría se mide
a 0 grados del haz incidente, es decir, en su misma dirección puede
considerarse como una medida de la turbidez. En la solución existen partículas
que dispersan la luz en distintas direcciones según el tamaño de la partícula y
de la longitud de onda, a medida que aumenta el número de partículas en
suspensión llegara menos luz trasmitida, por lo que podemos decir que la luz
transmitida es inversamente proporcional al número de partículas en suspensión.

La turbidez es la propiedad óptica de una muestra que hace

que la radiación sea dispersada y absorbida más que
transmitida en línea recta a través de la muestra.

La turbidimetría tiene la ventaja de poder hacer una valoración cuantitativa sin

necesidad de separar el producto de la solución. El instrumento de medida es el
turbidímetro que es un fotómetro de filtro
En el laboratorio clínico es aplicable cuando hay una concentración alta de
partículas y se utiliza para el análisis de proteínas séricas, en microbiología para
la medición de las sensibilidades microbianas a los antibióticos, etc.

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 NEFELOMETRÍA
Con esta técnica se mide la luz dispersada. La luz dispersada aumenta en la
medida que aumente el nº de partículas, de lo que se deduce que la luz
dispersada es directamente proporcional al aumento de partículas en ángulos
distintos a la luz emitida, generalmente con ángulos que oscilan entre los 10º y
los 90º. El instrumento de medida es el nefelómetro que mide la luz a 90ºes
similar al fluorímetro.
.
El procedimiento generalmente es empírico y sólo se consideran 3 factores:
 La concentración: Cuanto mayor sea el número de partículas, mayor
es la dispersión.
 Tamaño de la partícula: Factores como el pH, la velocidad y orden de
la mezcla, concentración de los reactivos, duración del estado de
reposo y la fuerza iónica.
 Longitud de onda: Normalmente las muestras se iluminan con luz
blanca, pero si están coloreadas, se debe escoger una porción del
espectro electromagnético en la que la absorción del medio se reduzca
al mínimo.
.
En el laboratorio clínico se utiliza para la determinación de inmunoglobulinas,
proteínas plasmáticas distinguir células hemáticas por su tamaño o factor
reumatoide,

La sensibilidad del turbidímetro es menor que la que se

consigue con la nefelometría.

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 REFRACTOMETRÍA DE LÍQUIDOS
La refractometría es un método fisicoquímico que consiste en medir la
desviación de un haz de luz incidente, debida a la refracción, cuando atraviesa
desde un medio a otro con distinta densidad. El ángulo qué forma se llama
ángulo de refracción.
Se basa en la ley de Snell , que define el índice de refracción

(n) como el cociente entre el seno del ángulo de incidencia sen Ø1 y el seno del
ángulo de refracción sen Ø2 de la luz monocromática, al pasar de un medio
menos denso generalmente aire a un medio más denso.
El instrumento de medida utilizado en laboratorios clínicos es el refractómetro
de Abbé https://triplenlace.com/2012/11/13/refraccion-ii-como-funciona-un-
refractometro-de-abbe/, basado en la utilización de dos prismas. Entre los
prismas que se encuentra situada una delgada capa de la muestra problema.
Cuando el haz de luz atraviesa el primer prisma, la luz se dispersa, a
continuación pasa a través de la capa de muestra donde es refractada, pasando
seguidamente por el segundo prisma donde es refractado nuevamente, prisma
de iluminación y prisma de refracción. Las interfases luz-oscuridad ángulo limite
que se establece y se observa por medio de un visor, se relaciona con el índice
de refracción de la solución problema, que se compara con el valor del calibrador
de la solución conocida. Normalmente agua destilada por medio de una escala
que también esta calibrada y que muestra la densidad, el índice de refracción y
una escala de concentración de proteínas.

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Esta técnica se usa en laboratorio clínico para medir la densidad urinaria y de las
proteínas totales en suero.

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 FOTOMETRÍA DE REFLECTANCIA
Esta técnica se basa en el concepto de reflectancia. La reflectancia lumínica de
una superficie es la propiedad que tiene esta superficie para reflejar la luz. En la
espectrometría de reflectancia analizaremos el color. El color está en función de
las longitudes de onda que no absorbe, se reflejan que adquiere un elemento
que absorbe parte de una radiación.
El sistema de medida de la reflectancia es el reflectómetro. Este sistema está
constituido por la esfera de Ulbricht. La esfera contiene una fuente de luz
(lámpara de tungsteno, batería de diodos o lámpara de arco se xenón) de una
longitud de onda determinada que lanza un rayo que incide sobre la zona de
lectura de la tira y es reflejado por esta. Esta luz reflejada para a través de la
esfera hasta que se deriva hacia un monocromador, que selecciona la longitud
de onda que llega al detector y la amplifica. Esta señal es transformada en un
resultado numérico.
Los detectores comparan la intensidad de la luz emitida por el diodo emisor con
la de la luz reflejada. Mientras mayor sea la luz reflejada, menor será la
concentración del analito. Algunos sistemas solo pueden hacer determinaciones
colorimétricas, mientras que otros pueden realizar análisis enzimáticos. Las tiras
de análisis tienen un código magnético que contiene toda la información
identificación del analito, duración de la fase de reacción, longitud de onda
requerida, número de mediciones e intervalo entre ellas, cálculo de los
resultados y factores de conversión que puede requerir el equipo.

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 QUÍMICA SECA
la Química seca está basada en el principio de reflectancia y consiste en una
tira plástica al que se incorporan un soporte generalmente, fragmentos de matriz
celulósica, impregnados con los reactivos de la reacción y someterlos a un
tratamiento de secado. Estos reactivos cuando entran en contacto con el
solvente una muestra de orina, plasma, etc.) comienzan una reacción química
colorimétrica que conlleva la formación del color, el soporte adquirirá un
determinado color en función de la concentración del analito de la muestra.
Existen diferentes tipos de tiras reactivas dependiendo de lo que queramos
analizar, las más habituales son las de orina y sangre.

En una tira reactiva de sangre se utilizan, generalmente, para la medida de un

solo parámetro bioquímico como por ejemplo para la medición de la glucosa,
procedimiento muy utilizado en Centros de Atención Primaria y por pacientes
diabéticos
Las tiras reactivas de orina pueden ser de dos tipos: monoreactivo y multitest,
estas últimas llevaban incorporados varios reactivos en la misma tira. Pueden
realizar diferentes valoraciones como pH, cuerpos cetónicos, proteínas, glucosa,
etc.

Hay tiras de orina, que miden diferentes parámetros, como son las tira para el
diagnostico rápido de embarazo, determinación de drogas de abuso, etc.

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 Las tiras reactivas permite realizar una acercamiento
diagnostico preciso sin tener que retrasar la decisión
terapéutica.

La química seca tiene las siguientes ventajas:

 Obtención de resultados inmediatos,
 Fácil manejo,
 Estabilidad de los reactivos,
 Plena disponibilidad a cualquier hora.

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 OSMOMETRÍA
La ósmosis es un proceso fisicoquímico que consiste en el paso de un disolvente
[TOOLTIP: No del soluto] entre dos disoluciones de diferente concentración,
separadas por una membrana semipermeable, desde la disolución mas diluida a
la más concentrada. Entendemos por presión osmótica
https://es.wikipedia.org/wiki/Presión_osmótica a la presión necesaria para
detener el flujo de agua a través de la membrana semipermeable.

La palabra osmosis viene del griego, y está formada por osmos que significa
impulso y sis que significa acción]
La osmometría es la técnica que mide de la osmolalidad, como una de las
propiedades coligativas de las soluciones. Las propiedades coligativas de
una solución están en función únicamente de la concentración molal. Es decir de
la concentración de los solutos (cantidad de partículas de soluto por
concentración total de partículas). No se tiene en cuenta ni la naturaleza ni el
tipo de soluto.
Las propiedades coligativas que más intervienen en la práctica clínica son:

Osmolaridad = osmoles por litro de solución

Osmolalidad = osmoles por kilogramo de agua

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 Hueco osmolal es la diferencia existente entre la osmolalidad
medida y la osmolalidad calculada

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Presión de vapor
La presión de vapor. La presión de vapor depende de la temperatura (la
presión de vapor de un mismo liquido aumenta con la temperatura) y de
la naturaleza del liquido (a una misma temperatura, líquidos diferentes
muestran presiones diferentes). Cuanto más soluto añadimos a la
muestra, menor es la presión de vapor observada] se produce cuando
las moléculas de la fase gaseosa de un liquido chocan contra la fase
liquida ejerciendo una fuerza contra la superficie del liquido. Ambas
fases tienen que estar en equilibrio dinámico. La aplicación clínica de
este principio radica en que un aumento de la osmolalidad sérica
conlleva un descenso directamente proporcional en la presión del vapor.
Por lo que a mayor osmolalidad mayor descenso de presión de vapor

La técnica empleada en los laboratorios clínicos para medir el descenso

de la presión de vapor es la medida por el punto de rocío. Esta
medición se lleva a cabo mediante un sistema Peltier, que regulado
electrónicamente, hace enfriar un líquido hasta que su temperatura
desciende por debajo del punto de rocío. A continuación se va
aumentando la temperatura hasta llegar a una meseta, donde se
equilibran los fenómenos de condensación y evaporación. El
instrumento de medida registra ese punto de meseta y transforma la
señal eléctrica en una medida de osmolalidad, por medio de una curva
de calibración. Es un método poco utilizado en laboratorio, se emplea
básicamente para determinaciones de orina en pediatría por necesitar
poca cantidad de muestra.

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 Descenso crioscópico.
Hablamos de descenso crioscópico. Este descenso está en función de
la naturaleza del solvente y del soluto cuando al añadir a una solución
pura, de la que conocemos su punto de congelación, un soluto, se
produce un descenso del punto de congelación de la solución con soluto
con respecto a la solución sin original.
Para su medición, utilizamos un dispositivo con sistema Peltier
http://www.mundodigital.net/que-es-el-efecto-peltier/, que ultraenfría la
muestra por debajo del punto de congelación, posteriormente se va
calentando la muestra hasta que alcanza una meseta en la que las
interfases sólido / líquido se igualan. Se detecta electrónicamente por la
una termocúpula, se traduce mediante su comparación con un curva
de calibración, en un dato de osmolalidad.
Es el método que más se utiliza en laboratorio clínico.

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 Osmolaidad calculada.
La osmolalidad calculada
http://www.labtestsonline.es/tests/Osmolality.html?tab=3 es una técnica de
medida de la osmolalidad que utiliza los parámetros de las moléculas séricas
que tienen mayor peso (glucosa, cationes, urea), de forma que si se conocen
estos datos, se podrá calcular la osmolalidad. Se puede calcular de diferentes
maneras pero una de las fórmulas más sencilla es la que utiliza los valores del
sodio (Na+), la glucosa y la urea (todo en mg/dl):

Osmolalidad calculada= (Na+ x 2) + (glucosa /18) + (urea /6)

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 CROMATOGRAFÍA
La cromatografía http://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/inicio.htm es uno de los
principales métodos físicos de separación, en el que los componentes de una
mezcla que se tienen que separar se distribuyen entre dos fases. La muestra se
disuelve en una fase móvil (líquido o gas) que se hace pasar a través de una fase fija
inmiscible, que se mantiene fija en una columna o en una superficie sólida que actúa de
soporte , una fase estacional y otra fase móvil. Los componentes que son rete-
nidos con más fuerza por la fase estacionaria se mueven lentamente en la fase
móvil; por el contrario los componentes que se unen débilmente a la fase esta-
cionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad,
los componentes de la muestra se separan en bandas discriminadas que poste-
riormente pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.
La cromatografía se clasifican atendiendo a diferentes criterios:
 Según la interacción entre las sustancias que se quieren separa y la
fase estacionaria.
 Cromatografía de adsorción. En esta técnica los solutos se retienen
por adsorción superficial. Las interacciones entre las moléculas a separar y
el soporte son electroestáticas. La fase móvil es liquida y la fase
estacionaria es un soporte solido. Es poco usada en clínica.
 Cromatografía de reparto. Los componentes de la muestra se separan
por su diferente distribución en dos fases liquidas inmiscibles, una orgánica
y otra acuosa Esta cromatografía se realiza en papel y en capa fina.
 Cromatografía de intercambio iónico. Se realiza por la diferente
afinidad para el intercambio de iones de los componentes de la muestra. Se
compone de la fase estacionaria o intercambiador iónico y la fase móvil.
Los cambiadores iónicos (aniónico o catiónicos) contienen grupos cargados
de iones móviles de signo contrario. Los grupos con carga del soporte solido
determinan el tipo y la fuerza del intercambiador.
 Cromatografía de exclusión. En la cromatografía de exclusión la
separación de los componentes de la muestra se realiza en función de su
tamaño y su forma. También denominada cromatografía de afinidad o
de permeabilidad en gel (GPC).
 Según como esté dispuesta la fase estacionaria:
 Cromatografía plana.
 En papel.
 En capa fina
 Cromatografía en columna.
 Según la naturaleza de la fase móvil y la estacionaria:
 Cromatografía de gases.
 Gas – liquido
 Gas- solido
 Cromatografía de fluidos supercríticos.

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 CROMATOGRAFÍA PLANA
Son un conjunto de técnicas donde la fase estacionaria se encuentra en una
superficie plana y la fase móvil se desliza por adsorción o capilaridad.
Dependiendo del soporte empleado, puede ser cromatografía en papel o en
capa fina.

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL.
Pertenece al grupo de cromatografía de reparto. En la cromatografía en papel
https://lacienciaparatodos.wordpress.com/2009/03/25/experimento-
cromatografia-en-papel/ la fase estacionaria, generalmente liquida, esta adsorbi-
da por una tira de papel de filtro. La muestra se coloca en un extremo del papel
en forma de pequeñas gotas de una solución de la muestra. Los disolventes,
para la separación de sustancias polares se utilizan eluyentes con agua, para los
compuestos poco polares el eluyente debe ser no acuosos, empleados como
fase móvil, eluyente, se hace ascender por capilaridad. Cuando el disolvente
deja de ascender se retira el papel y se seca, el disolvente se evapora después
de cada aplicación, pudiendo ver las manchas de distinto color separadas.
El revelado de las manchas se suele hacer por fluorescencia. Se pulveriza una
sustancia fluorescente sobre el papel, y se ilumina con luz ultravioleta,
observando las manchas.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)

La cromatografía de capa fina es técnica de reparto líquido-líquido, en la que
resultan muy importantes las interacciones por adsorción se lleva a cabo
sumergiendo una placa puede ser de vidrio, aluminio a la que se adhiere la fase
estacionaria carbonato, gel de sílice, célulos, etc. formando una capa fina. Se
sumergen las placas en una cubeta con eluyente y la muestra se coloca sobre la
placa a escasos centímetros del eluyente, el cual ascenderá por capilaridad y
“transportará” los distintos componentes de la muestra a velocidades diferentes
consiguiendo así separarlos. Cuando el eluyente llega a la parte superior de la
placa, esta se saca de la cubeta, se seca, y los componentes separados de la
mezcla se visualizan por su color, por radiación ultravioleta o revelado con tintes
adecuados y posteriormente pueden cuantificarse por densimetría o ser eluídos
de la placa.

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Es una técnica más rápida y sensible que la cromatografía en papel y es muy
usada en laboratorio clínico para separar e identificar un amplio repertorio de
biomoléculas: lípidos, aminoácidos, azucares, proteínas y en general sustancias
de bajo peso molecular.

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 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Esta técnica consiste en deslizar una sustancia a través de una columna por la
adicción continua de una fase móvil. La fase estacionaria es un soporte sólido
absorbente. Las siguientes adiciones de fase móvil producen un descenso de
las moléculas de la muestra por la columna, debido a las transferencias entre la
fase móvil y la estacionaria.

El proceso de realización en esquema es el siguiente:

 Se rellena la columna con el adsorbente adecuado.
 Se añade fase móvil
 Comienza la separación de los componentes de la muestra, las sustancias
van quedando retenidas por el adsorbente.
 Se eluye el primer componente.
 Se eluye el segundo componente.

https://www.youtube.com/watch?v=rHeH3cOm_nI

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 CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA

En la cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC

https://es.wikipedia.org/wiki/Cromatografía_líquida_de_alta_eficacia se inyecta la
muestra, en la fase móvil que es transportada a través de una columna por el
flujo continuo a alta presión. La fase estacionaria está formada por partículas de
pequeño diámetro, contenidas en la columna. La velocidad a la que un analito se
mueve a través de la columna, en relación a los demás compuestos presentes
en la mezcla, está definida por el tiempo que permanece en la fase móvil. Por lo
que la separación en HPLC es el resultado de las interacciones específicas entre
las moléculas de la muestra en la fase móvil y en la fase estacionaria.
https://www.youtube.com/watch?v=QzySXjxkNlY

Este tipo de cromatografía se caracteriza por tener una alta sensibilidad y por
proporcionar determinaciones cuantitativas exactas. Es de gran utilidad para
preparar sustancias no volátiles o termolábiles. En la actualidad HPLC ha llegado
a ser una de las técnicas del laboratorio más importantes como herramienta
analítica para separar y detectar compuestos químicos. Dentro de los campos de
aplicación uno de los más importantes es el análisis de fármacos, identificación y
cuantificación de fármacos, también se utiliza para el análisis de esteroides y
separación de hormonas, en la separación de catecolaminas, separación y
cuantificación de aminoácidos, entre otras. Se puede utilizar como técnica
preparativa y analítica.
El cromatógrafo que se emplea en la HPLC, debido al pequeño diámetro de las
partículas que se utilizan en la fase estacionaria, precisa de diversos
componentes.

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 Bomba. Hay bombas de diferentes tipos, pero la más utilizada es la
bomba de dos pistones. Estos pistones actúan de forma reciproca,
desfasados un ángulo de 180º, de esta forma consiguen un impulso
constante a presiones ente 0 y 450 atmosferas. Las bombas son el
componente más sensible del cromatógrafo. Las bombas deben estar
libres de vibraciones que puedan afectar al flujo, ya que podría alterar la
detección de componentes.
 Inyector. Un inyector para HPLC consiste generalmente en una válvula
de inyección y un bucle. Su misión es evitar las interferencias en la
corriente del disolvente.
 Columna. La columna es el elemento principal en un cromatógrafo, por
ser el lugar donde se produce la separación de sustancias. Las
columnas suelen ser de acero inoxidable y en su interior presentan un
relleno que puede ser de dos tipos:
 Pelicular: formado por bolas de vidrio o de polímero no porosas.
Son esféricas, con un diámetro que puede oscilar entre 30 y 40
cm. Está recubierta por una fina capa de sílice o de una resina de
intercambio iónico.
 Partícula porosa. Este tipo de relleno está formado por micro
partículas porosas de sílice alúmina o resinas de intercambio con
un diámetro entre 3 y 10µm.
 Detector. Los detectores de un cromatógrafo de HPLC trabajan en
condiciones de flujo continuo, donde la muestra ya disuelta en la fase
móvil traspasa una celda de flujo donde es detectada. Al detector las
muestras llegan en cantidades muy pequeñas de ng hasta muy pocas
moléculas. Pueden ser de tres tipos: de absorbancia, son los más
usados, de índice de refracción o de fluorescencia.
 Registrador-integrador. El integrador nos permite conocer la
concentración exacta de cada una de las sustancias separadas, para
ello calcula el área bajo cada uno de los picos y utiliza patrones de
concentración conocida. Es el mecanismo que nos permite obtener un
cromatograma.

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26
 CROMATOGRAFÍA DE GASES

La cromatografía de gases es una técnica que se emplea para separar los

compuestos volátiles de una muestra. Puede ser cromatografía gas-líquido, fase
estacionaria líquida, y cromatografía gas-solido, fase estacionaria sólida. La
cromatografía gas- líquido se realiza en una columna que contiene un sólido
inerte que actúa como soporte. La fase móvil es un gas inerte, nitrógeno o helio,
que fluye por la columna a velocidad constante. La fase estacionaria está
constituida por un líquido que impregna el soporte. La cromatografía de gases
requiere compuestos volátiles.
https://www.youtube.com/watch?v=9nYpjtRx0Zs
Cromatógrafo de gases requiere de diversos componentes, para conseguir que
los diferentes compuestos se separan en función de su grado de volatilidad
punto de ebullición, peso molecular y su afinidad por la fase estacionaria. Entre
los detectores más utilizados caben mencionar el detector FID ionización de
llama que por su alta versatilidad, hace posible la detección de un elevado tipo
de compuestos:

Centrándonos en sus aplicaciones clínicas, se utiliza principalmente para:

 la detección fármacos en la orina,
 cuantificación de ácidos orgánicos en orina
 la determinación de monóxido de carbono en sangre.

La cromatografía combinada con la espectrometría se utiliza habitualmente en

medicina deportiva en los controles antidoping.

La combinación cromatógrafo de gases-espectrómetro de

masas se utiliza en laboratorio clínico para la cuantificación
de drogas de abuso.

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  Gas portador. Su elección depende del tipo de detector que se utilice.
Debe ser inerte y estar libre de impurezas y agua. Debe suministrase a
la presión adecuada. Los más usados son: nitrógeno, helio, dióxido de
carbono e hidrogeno.
 Sistema de inyección de la muestra. Hay que tener en cuenta que el
tamaño de la muestra, así como la forma de introducirla en la columna
pueden determinan la eficacia del proceso. Si utilizamos una inyección
lenta de muestras grades, obtendremos bandas anchas que nos indica
que no se ha producido un correcto proceso de separación. El sistema
más utilizado, por dar resultados correctos, es el de microjeringa
aplicada a la cabeza de la columna.
 Columna de desarrollo. Las columnas de desarrollo pueden ser de dos
tipos: de relleno y capilares, estas últimas son las más utilizadas por ser
más rápidas y efectivas.
 Sistema de detección. Las características que debe mostrar un
detector son: adecuada sensibilidad, buena estabilidad, amplio margen
de temperatura de trabajo, gran reproducibilidad, reducido tiempo de
respuesta, fácil manejo y no destruir la muestra. Hay diferentes tipos de
sistemas de detección: ionización de llama o llama de hidrógeno,
conductividad térmica, de captura electrónica, de emisión atómica, de
conductividad de Coulson y detector de ionización de argón. Los
sistemas de detección más utilizados son los de ionización de llama o
de llama de hidrógeno.

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 AUTOMATIZACIÓN
Actualmente, hasta finales de la década de los años 60 cuando Leonard Skegg
desarrolló el “autoanalizer”, los análisis clínicos se realizaban de manualmente,
empleando gran cantidad de tiempo y recursos, tanto en reactivos como en
consumo de muestras y mano de obra. Entre 1960 y 1970 aparecen los primeros
análisis secuenciales múltiples, precursores de los analizadores automáticos de
hoy en dia. Estos analizadores se han ido y perfeccionando y gracias a la
progresión de la tecnología y de la informática se han conseguido equipos que
realizan procesos en todas las fases analíticas, no podríamos concebir un
laboratorio sin el uso de analizadores automáticos integrados en plataformas
analíticas cada vez más completas. Con estos sistemas se busca una mejora en
el diagnóstico y seguimiento de las enfermedades así como incrementar la
productividad del laboratorio, así como disminuir de forma importante el tiempo
necesario para dar un resultado.
Los analizadores automáticos son máquinas diseñadas para medir diferentes
sustancias químicas y otras características en un número de muestras
biológicas, con una intervención mínima del técnico de laboratorio, para saber
algo más sobre estos analizadores automáticos dedica un poco de tiempo a ver
el siguiente video
https://www.youtube.com/watch?v=BWeU0iX2fkg

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 TIPOS DE ANALIZADORES
Los analizadores o equipos específicos más comunes en el laboratorio de
análisis clínicos son:

 Analizadores de química clínica: Estas máquinas procesan gran parte

de las muestras analizadas en un laboratorio clínico o en un hospital. Se
pueden hacer distintos tipos de pruebas: nivel de enzimas, niveles de
iones (sodio y potasio) y otros como indicadores de glucosa, albumina
sérica, creatinina, etc.
 Analizadores hematológicos: permiten el recuento celular de la serie
blanca, así como su fórmula leucocitaria
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003657.htm; los recuentos
de la serie roja, reticulocitos y plaquetas en sangre.
 Analizadores de hemostasia o coagulómetros: Se usan para evaluar
la capacidad del sistema de coagulación y miden el tiempo necesario
para que ocurra la formación de redes de fibrina bajo condiciones
cuidadosamente controladas.
 Equipos de medida de gases en sangre y cooximetría
https://es.wikipedia.org/wiki/Cooximetría: permiten medir parámetros
como el pH, las presiones de pCO2 y pO2, que ayudan al diagnóstico del
equilibrio acido – base, y el estado de oxigenación de los pacientes.
 Analizadores para la identificación bacteriana: Nos permiten identifi-
car una bacteria y en muchos casos determinan la concentración inhibi-
toria mínima (CIM)
https://es.wikipedia.org/wiki/Concentración_inhibitoria_mínima, para ve-
rificar el grado de resistencia frente a los antibióticos.

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FASES ANALISIS EN LA AUTOMATIZACION
La automatización en principio estaba centrada en la fase analítica del proceso,
pero en la actualidad abarca todas las fases, preanalitica, analítica y
postanalitica, lo que proporciona un seguimiento integral del proceso. Según las
diferentes fases del proceso la automatización cumple unos pasos y requisitos
diferentes. El proceso de automatización puede afectar a las distintas fases de
un análisis como podemos ver a continuación:

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FASE Preanalítica
La fase preanalítica, implica entre otros procesos.
 Identificación del paciente, por medio de etiquetas de código de barras].
Cualquier espécimen que llegue al laboratorio será reconocido mediante la
consulta al sistema informático del laboratorio donde nos indicara el tipo
de muestras y el número de pruebas que tendremos que realizar al
paciente.
 Manipulación de muestras. Esta parte del proceso se corresponde con la
clasificación y preparación de las muestras. En el caso de muestras
sanguíneas el sistema debe ser capaz de reconocer y diferenciar los
especímenes, sangre anticoagulada para la realización de hemograma,
sangre citratada para coagulación, sangre coagulada para procesar suero,
etc. para tratarlos y procesarlos adecuadamente.
 Clasificación de las muestras. Actualmente, los sistemas más
avanzados, reconocen el tipo de muestras, tamaño, volumen y color del
tapón de los tubos que contienen las muestras e identificando el
contenedor adecuado para la realización de los diferentes estudios.
 Alicuotado. Cuando se prescriben pruebas que no se realizan en ese
laboratorio, el analizador debe preparar las alícuotas correctamente y
etiquetarlas para su posterior envío a otro laboratorio preparado para ese
tipo de prueba.Una vez clasificadas las muestras se realiza la preparación
de las alícuotas de la muestra original. El analizador automático etiqueta
las muestras con un código de barras, que crea el propio instrumento, y
las clasifica sobre una rejilla.

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 Fase analítica.
En la fase analítica es donde los automatización esta más desarrollada y
los analizadores, si son completamente automatizados pueden combinar
distintos tipos de analizadores bioquímica, hematología, inmunoanálisis,
coagulación, etc. para organizar un sistema en cadena, lo que se
denomina laboratorio core. Los automatizadores deben posibilitar la
realización del trabajo habitual de forma continua, por lo que se debe
proveer la posibilidad de carga de los reactivos en operación para
aumentar la autonomía. También debe estar provistos de dispositivos de
reconocimiento de problemas en la muestra: volumen escaso,
coagulación de la muestra, existencia de burbujas en el espécimen, y
detectar problemas interferentes (lipidemia, ictericia, hemólisis). Las
muestras deben estar colocadas sobre un sistema individual o en
gradillas que permita la movilidad en cadena a lo largo de los diferentes
automatizadores. Este sistema nos permite realizar de manera casi
completa un perfil de petición de pruebas.

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Fase postanalítica.
Las funciones de los analizadores en la fase postanalitica consisten en:
 Efectuar pruebas reflejas, pruebas diagnósticas adicionales, para confirma
y/o completar un diagnostico clínico.
 Archivo de muestras. Debe archivar las muestras, conservadas en las
condiciones adecuadas, para poder realizar las pruebas adicionales que se
soliciten, incluso para su manipulación fuera del analizador.

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 USO EFICIENTE DE LOS
RECURSOS
Cuando trabajamos en un laboratorio de análisis clínicos o de anatomía
patológica tenemos que conseguir optimizar al máximo el funcionamiento del
equipo de trabajo y para ello es esencial conocer los recursos de los que
disponemos y hacer un buen uso de ellos. Con ello podemos garantizar:
 Que estamos realizando correctamente nuestro trabajo.
 Que valoramos lo que hacemos y lo hacemos con interés y sin
distracciones.
 Que estamos ahorrando. Tanto el material del laboratorio como los
equipos hemos de utilizarlos pensando en la economía del laboratorio.
 Debemos utilizar los recursos con responsabilidad para no tener que
repetirlos. Repetir un experimento supone un gasto de tiempo y de
dinero.
Para conseguir esto debemos:
 Conocer los procedimientos y protocolos de trabajo.
 Conocer las normas de seguridad e higiene del trabajo.
 Conocer la forma de usar correctamente los compuestos químicos.
 Conocer el buen funcionamiento del material del que disponemos.
 Conocer el funcionamiento de los equipos instrumentales antes de
usarlos.
 Utilizar con responsabilidad la instrumentación.
 Eliminar correctamente los residuos que generemos con el fin de no
dañar el medioambiente.
 Garantizar con nuestra forma de trabajar nuestra seguridad y la de
nuestros compañeros.

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 RESUMEN
1. La espectrometría en el laboratorio clínico se utilizan dos técnicas de medida de la
dispersión de partículas suspendidas en líquidos: la turbimetría y la nefelometría.
2. La turbimetría mide la intensidad de un haz de luz incidente cuando pasa a través
de una suspensión de partículas, se mide en la misma dirección del haz incidente
mediante el turbidímetro y se utiliza para el análisis de proteínas séricas y en
microbiología para la medición de las sensibilidades microbianas a los antibióticos,
etc.
3. La nefelometría mide la luz dispersada en ángulos distintos a la luz emitida, se mide
mediante el nefelómetro y se utiliza en laboratorio clínico para la determinación de
inmunoglobulinas, proteínas plasmáticas, factor reumatoide.
4. La Refractometría consiste en medir la desviación que un haz de luz incidente,
debida a la refracción, cuando atraviesa desde un medio a otro con distinta densidad.
Se basa en la ley de Snell, que define lo que es el índice de refracción. Su
instrumento de medida en el refractómetro de Abbé y se utiliza en laboratorio clínico
para medir la densidad urinaria y de las proteínas totales en suero.
5. La fotometría de reflectancia mide el color que adquiere un elemento que absorbe
parte de una radiación, que está en función de las longitudes de onda que no
absorbe, se reflejan. Basado en este fenómeno está la denominada Química seca y
las tiras reactivas. Las tiras reactivas nos permiten emitir un diagnostico rápido y
hacer un seguimiento de la enfermedad.
6. La osmometría es la técnica que mide de la osmolalidad como una de las
propiedades coligativas de las soluciones en la práctica clínica empleamos: la
presión del vapor, el descenso crioscópico y la osmolalidad calculada.
7. La cromatografía es uno de los principales métodos físicos de separación de
sustancias. Consiste en disolver la muestra en una fase móvil y hacerla pasar a
través de una fase fija inmiscible, dependiendo del tiempo que tarden en recorrer las
fases se efectuará la separación de los componentes.
8. La cromatografía en capa fina es más rápida y sensible que la cromatografía en
papel y es muy usada en laboratorio clínico para separar e identificar un amplio
repertorio de biomoléculas: lípidos, aminoácidos, azucares, proteínas y en general
sustancias de bajo peso molecular.
9. Dentro de la cromatografía en columna se encuentra la cromatografía liquida de
alta eficacia (HPLC), se diferencia por que la muestra se inyecta en la fase móvil y es
bombeada a alta presión en su paso por la columna. Se caracteriza por tener una alta
sensibilidad y por proporcionar determinaciones cuantitativas exactas de gran
cantidad de compuestos químicos está ampliamente extendiendo su uso en la clínica
sobre todo de fármacos y hormonas.
10. La cromatografía de gases se utiliza para la detección de fármacos en la orina,
cuantificación de ácidos orgánicos en orina y la determinación de monóxido de
carbono en sangre.
11. Los analizadores automáticos son máquinas diseñadas para medir diferentes
sustancias químicas y otras características en un número de muestras biológicas, con
una intervención mínima del técnico de laboratorio. Se emplean en todas las fases
del proceso analítico y hay modelos para cada tipo de laboratorio (bioquímico,
microbiología, etc.).

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 RECAPITULACIÓN
En este apartado se ha tratado:

 Espectrometría de dispersión de la radiación. Ley de Rayleigh.

 Turbimetría y nefelometría. Instrumento de medida y aplicaciones
clínicas.
 Refractometría de líquidos. Refractómetro de Abbé y aplicaciones
clínicas.
 Fotometría de reflectancia. Química seca. Tiras reactivas. Instrumento
de medida y aplicaciones clínicas.
 Osmometría, instrumentación de medida y aplicaciones químicas.
 Cromatografía. Clasificación y usos clínicos.
 Cromatografía en columna. Cromatografía liquida de lata eficacia y
cromatografía de gases. Instrumentos de medida y aplicaciones
clínicas.
 Automatización. Analizadores automáticos
 Uso eficiente de los recursos.

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 BIBLIOGRAFÍA
 Manual para Técnico Superior de Laboratorio Clínico y Biomédico.
F.J.Mérida y E.E. Moreno. Primera edición. Medica Panamericana, 2015
 Manual de Técnico Superior de Laboratorio de Análisis Clínicos. M.C.
Silva García, M. J. García Bermejo. Primera edición. MAD, 2014.
 Técnicas generales de laboratorio. F. Simón, M. I. Lorenzo, F. Gómez-
Aguado, B. Hernández. Editorial Altamar. Madrid 2015.
 Análisis Bioquímico. Posada Ayala M. Editorial Paraninfo. Madrid, 2015.

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