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bioquímica.
1. INTRODUCCIÓN A LA ESPECTROMETRÍA
En el laboratorio de bioquímica clínica se ha logrado automatizar la mayor parte de las determinaciones para dar
cobertura a la amplia demanda de este tipo de valoraciones. Muchas de las técnicas utilizadas están basadas en la luz
como fundamento de la técnica.
El objetivo principal de un laboratorio clínico es: determinar la concentración de alguna de las sustancias (analito,
componente o constituyente) que se hallan disueltas en algún líquido biológico.
• La luz es una radiación que se desplaza por el espacio en forma de ondas con las siguientes características:
La luz está formada por fotones. La energía de cada fotón es directamente proporcional a la frecuencia () e
inversamente relacionada con su longitud de onda (). A mayor longitud de onda menor será la cantidad de energía.
En el laboratorio clínico se trabaja en franja lumínica desde la luz ultravioleta (180nm) hasta el infrarrojo (800 nm).
Cuando se hace incidir un haz de luz en una solución con partículas en suspensión, parte de la luz se absorbe (luz
absorbida), otra parte se dispersa (luz dispersada) y el resto atraviesa la muestra continuando la trayectoria del haz
incidente (luz transmitida). Por tanto, pueden darse tres situaciones que son de interés en el laboratorio clínico:
Las técnicas que tienen como fundamento la luz va a proporcionar información tanto cualitativa como cuantitativa al
medir la intensidad de la luz absorbida, refractada, dispersada, transmitida o reflejada tras la interacción del haz de
luz con las sustancias de interés que se encontrarán en disolución.
Las técnicas espectroscópicas utilizan la Radiación Electro Magnética (REM) para llevar a cabo la espectrofotometría.
Basándose en la interacción de la energía radiante con la materia presente en la muestra o solución (átomos,
moléculas o iones).
Referido a una molécula o analito por determinar, se define como espectro de absorción o emisión según la radiación
electromagnética se absorba o se emita. Las radiaciones que engloba este espectro van desde los rayos gamma
(menor longitud de onda) hasta las ondas de radio (mayor longitud de onda).
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1.2. Ley de Lambert-Beer.
Cuando una luz atraviesa una sustancia, la intensidad del haz de luz
que sale es inferior a la inicial que incide sobre la muestra, debido a
que parte de la intensidad inicial es absorbida por la solución. A
mayor concentración de un determinado compuesto en una
solución, mayor es la absorción de la luz.
Cuando una luz atraviesa una muestra parte de esa luz va a ser
absorbida y parte transmitida.
Según la Lay de Lambert-Beer, hay una relación entre la absorción de luz de una solución y la concentración, siendo
esta relación directamente proporcional; a mayor absorbancia, mayor concentración y viceversa. La relación entre la
concentración y la absorbancia es lineal, mientras que, la relación entre el % de transmitancia y la concentración es
logarítmica.
• l= ancho de la capa de la sustancia atravesada (ancho de la cubeta). Cuanto más ancha sea la muestra
mayor es la absorbancia (directamente proporcional).
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Desviaciones de la Ley de L-B
• Fuente de luz: lámparas como fuente de energía, se utilizan lámparas halógenas o de tungsteno para
longitudes de onda a partir de 350nm y lámparas de hidrógeno o deuterio para el espectro ultravioleta.
• Rendija de entrada: el rayo de luz pasa sólo por ahí y pasa un único haz.
• Selector de longitud de onda: Se selecciona la longitud de onda a la que queremos que trabaje el aparato.
Éstos pueden ser:
o Monocromadores: varían la radiación de forma continua.
o Filtros de absorción: absorben solo longitudes de onda del espectro visible.
o Filtros de interferencia: consiguen un rango de radiación estrecha.
• Rendija de salida.
• Muestra. Normalmente se aloja en una cubeta, que suele ser de 1 cm de ancho y debe dejar pasar la luz a
través de ella. Para longitudes de onda inferiores a 320 nm se utilizan cubetas de cuarzo; para mayores
longitudes de onda se pueden usar cubetas de plástico, que son más baratas.
• Detector: convierte la luz que recibe en una señal eléctrica:
o Fotomultiplicadores: originan un flujo continuo de corriente eléctrica.
o Diodos: detectan varias longitudes de onda simultáneamente; son utiles para obtener espectros.
o Térmicos: miden el aumento de temperatura.
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• Registrador o sistema de lectura: traduce la información recibida (transmitancia) en información
interpretable para el técnico (absorbancia).
El mejor selector de longitud de onda es aquel que sea capaz de seleccionar una única longitud de onda: pero la
realidad es que ninguno lo consigue, sino que trabajan con un intervalo de longitudes de onda cercanas a la longitud
de onda con la que se quiere trabajar.
Así pues, aparece el término ancho de banda. El ancho de banda es el intervalo o rango de longitudes de ondas que
el selector de longitudes de onda deja pasar, cuanto más pequeño sea el ancho de banda, mejor hará su función el
selector. La longitud de onda nominal es la longitud de onda a la que queremos trabajar.
Por eso la luz nunca será monocromática, pero se le llama así porque siempre hay una longitud de onda que
predomina. Por ejemplo: si queremos trabajar a una longitud de onda nominal de 450 nm y el ancho de banda es
de 10 nm, el selector selecciona de 445nm a 455 nm, y la transmitancia que más se dé, será la de 450 nm.
Los selectores de longitud de onda, no seleccionan de forma continua (una longitud de onda), sino que de forma
discreta (“se va saltando” longitudes de ondas).
Un buen selector será por tanto el que tenga un ancho de banda pequeño y seleccione de forma discreta basándose
en ese ancho de banda.
Debe intentarse valorar la absorbancia a la longitud de onda de máxima absorción de la sustancia a determinar
para evitar errores. = Cada espectro de absorción es característico de cada sustancia. Hay ciertos factores que
pueden alterar la relación entre absorbancia y la concentración de la sustancia problema que deben conocerse:
• Parte de la energía que incide en la muestra puede ser absorbida por el solvente o la pared de la
cubeta.
• La luz que incide no es totalmente monocromática.
• Puede haber cierta dispersión de la energía.
Para controlar estos factores se realiza un blanco de todos los elementos que componen la disolución además de la
sustancia problema.
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Fundamento: mide la absorbancia o transmitancia de la muestra tras la incidencia del haz de luz sobre ella. Para
determinar la concentración de la sustancia se aplica la ley de Lambert- Beer.
Instrumentación: Actualmente los equipos cada vez están más automatizados, sin embargo, el esquema general
del aparataje es el común a todos los espectrofotómetros.
Esta técnica mide la intensidad de la luz emitida por las partículas, por lo que no es necesario transformar la
información recibida como pasaba en la absorción molecular (que se pasaba de la transmitancia a absorbancia). La
cantidad de luz emitida es proporcional a la cantidad de moléculas. = Moléculas que emiten luz
Hay moléculas que tienen la propiedad o capacidad de emitir luz una vez estimuladas por una fuente de energía. Por
lo tanto, necesitamos una fuente de luz y moléculas capaces de emitir energía para este tipo de espectrometría.
3.1. Fluorescencia
Fundamento: La molécula absorbe fotones procedentes de la fuente de energía y pasa a un estado más excitado;
cuando vuelve a su estado inicial o estado fundamental, emite esa energía en forma de luz, que puede ser
cuantificada. La energía emitida (luz visible), es algo menor que la incidente (luz no visible), por tanto, la longitud de
onda es algo mayor que la longitud de onda incidente. Es una técnica muy sensible, puede detectan moléculas que
están a muy baja concentración.
Para esta técnica son necesarios los fluorocromos. Un fluorocromo es una molécula capaz de emitir fluorescencia.
Los fluorocromos son los que emiten luz pues se excitas sus electrones. Sin fluorocromo no hay fluorescencia.
Instrumentación: Los aparatos usados se llaman fluorímetros. Para esta técnica, es necesario un selector de longitud
de onda antes (onda ultravioleta) y después de la cubeta (onda visible).
Aplicaciones: Se usa para determinar fármacos, marcadores de enfermedades, proteínas a partir de sus aminoácidos
aromáticos. Los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptófano) presentan fluorescencia.
3.2. Fosforescencia
Se diferencia con la fluorescencia en que la luz que se emite sale más retardada y es más permanente. No se usan
fluorocromos, sino sustancias fosforescentes.
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3.3. Quimioluminiscencia
En esta técnica la excitación de los electrones de una molécula se produce por una reacción química (oxidación) y
las moléculas excitadas emiten luz al volver a su estado fundamental. Las moléculas se llaman
electroquimioluminiscentes o luminiscentes. En esta técnica no hay fuente de luz es una reacción química la que
desencadena la emisión de luz.
Instrumentación: Tiene presente todos los componentes explicados anteriormente en espectrofotómetro de haz
simple. Pero, la fuente de luz usada en esta técnica es una lámpara de cátodo hueco o lámpara catódica (con sus
átomos en estado basal para que cuando se absorba la energía en la llama se exciten y cuanta más energía se absorba
(mas concentración de electrones hay) y menos llega al fotómetro), tiene unas longitudes de ondas muy
características, propias del material con el que estamos trabajando. Además, hay que añadir un atomizador, que se
localiza entre la fuente y el selector de onda y se encarga de proporcionar la temperatura suficiente para que la
muestra pase de estado líquido a gaseoso, convirtiéndose la muestra en una “nube de átomos”, en la que se
encuentra los átomos del material a determinar.
Como la lámpara emite longitudes de onda características del metal del que está formada, los únicos átomos que
absorberán luz serán aquellos de los que está formada la lámpara (que son además los que queremos estudiar).
Aplicaciones: técnica muy usada en el laboratorio para la determinación cuantitativa de metales pesados (Pb, Zn, Cu,
Fe). La mayoría de las veces no cumple la Ley de Lambert-Beer porque hay muchas interferencias.
Fundamento: consiste en la excitación térmica de los átomos utilizando una llama de una determinada longitud de
onda. Cuando los átomos vuelven a su estado basal, liberan energía de una longitud de onda característica de cada
elemento, que se puede cuantificar. La intensidad de la energía que emiten los átomos es directamente proporcional
a la cantidad de átomos excitados y, por tanto, a la concentración del elemento a valorar en la muestra.
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Instrumentación: los mismos aparatos que los que se usan en la absorción atómica, a excepción de la lámpara de
cátodo hueco.
Aplicaciones: se utiliza para determinar elementos químicos abundantes (Na, K, Mg, Li, etc.) en líquidos biológicos.
6. ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Técnica para determinar cualitativa y cuantitativamente una sustancia. Es rápida y específica y permite obtener el
espectro característico de una molécula que nos da información estructural de la molécula. Tiene una alta
sensibilidad pudiéndose detectar concentraciones muy pequeñas. Normalmente, se usa acoplada a un cromatógrafo
de gases o un cromatógrafo de líquidos.
Fundamento: Se basa en la ionización de la molécula de estudio, separando posteriormente los distintos iones que
la forman y así determinar la masa de dichos fragmentos. Se determina las relaciones masa/carga (m/z) de una
molécula. El espectro que se obtiene muestra la cantidad relativa de cada ion en los que se ha roto la molécula tras la
ionización.
Instrumentación:
• Fuente de ionización: convierte las moléculas problema en iones en estado gaseoso dentro de un sistema
de vacío para que los iones no interaccionen con ninguna otra molécula
• Analizador de masas: Los distintos iones se someten a un campo eléctrico creado por un cuádruplo
eléctrico, utiliza cuatro polos eléctricos que van cambiado de radiofrecuencia, o pueden ser sometidos a un
campo magnético. El uso de uno de estos métodos hace que obtengamos información del tiempo de vuelo
(va a depender de la masa y de la carga) de las moléculas, iones, hasta que colisionan con un detector
(normalmente es un multiplicador de electrones)
Aplicaciones: Cada vez se usa más, detecta moléculas de pequeño tamaño tanto en fluidos biológicos como en tejidos. También
detecta macromoléculas como lípidos, proteínas, etc. y microorganismos.
7. ESPECTROMETRÍA DE DISPERSIÓN
Para hablar de este tipo de espectrometría lo primero que hay que hablar es de la luz dispersada:
7.1. Turbidimetría:
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Fundamento: Las partículas suspendidas en un medio líquido generan turbidez que reduce la cantidad de luz que
puede atravesarla. A mayor turbidez menos luz puede ser transmitida (se mide la luz no bloqueada). Cuantas más
moléculas haya en la muestra y más grandes sean, mayor dispersión habrá. En esta técnica detectaremos el rayo de
luz que en la misma dirección que el rayo incidente. Los rayos que llegan al detector son los rayos que pasan
instantáneamente.
Aplicaciones: no es un método muy sensible, por lo que es utilizado para cuantificar concentraciones elevadas.
7.2. Nefelometría:
Fundamento: Determina la concentración de partículas mediante la medida de cantidad de luz dispersada en un
ángulo determinado. El ángulo del rayo dispersado depende de la naturaleza de las partículas en suspensión, por
lo que la nefelometría mide la luz dispersada en ese ángulo en concreto. EFECTO TYNDALL
Aplicaciones: normalmente se usa para mediar reacciones antígeno-anticuerpo, los cuales a reaccionar provocan
turbidez en la muestra (inmunoturbidimetría o inmunonefelometría). También, hay moléculas como las
lipoproteinas que provocan turbidez en la muestra e interfieren en la medida.
8. REFRACTOMETRÍA
Fundamento: está basada en el índice de refracción de la luz. Cuando la radiación electromagnética (luz) atraviesa
una sustancia, esta se desvía en función de la concentración de dicha sustancia. Cuando la luz se refracta cambia su
trayectoria y, además disminuye su velocidad al atravesar el medio.
Aplicaciones: En el laboratorio tiene mucho uso, para medir proteínas totales en suero,
aunque también se usa para calcular densidades (orina), cuanto más densa sea la solución
más refracta la luz.
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Aplicaciones: es muy usada, fácil de interpretar, y es posible la automatización. Se utiliza para determinar
componentes presentes en suero, plasma y otros líquidos biológicos. Por ejemplo: tira reactiva de orina.
Existe control de calidad interno, dentro del propio laboratorio y control de calidad externo (diferentes laboratorios
hacen determinaciones sobre unas muestras proporcionadas por laboratorios de referencias).
En el control de calidad son imprescindibles los líquidos de referencia. Estos líquidos suelen ser soluciones (suero,
plasma, disoluciones, etc.) de composición conocida que se utilizan para determinar la fiabilidad de un método de
análisis. Existen varios tipos:
✓ Patrón o estándar: es aquel líquido utilizado para obtener un resultado en un método analítico ya que el
analito tiene una concentración conocida. Me sirve para determinar la concentración de mi muestra.
✓ Calibrador: es un líquido con analitos de concentración conocida utilizado para calibrar los instrumentos de
medida. Lo que hace es ajustar la medida lo máximo posible a los valores esperados.
✓ Control: es un líquido biológico, normalmente suero o plasma, preparado comercialmente. Las
concentraciones de los analitos presentes son conocidas. Si los valores están dentro de la normalidad se
conocen como controles normales, y si están fuera de rango, se conocen como controles patológicos. Este
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tipo de líquidos se suelen procesar junto a las muestras para evaluar la validez de un resultado. Sirve para
determinar si un aparato funciona correctamente enfrentándose a un patrón.
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