Practica 8: preparación de medios de cultivo y siembra

Fecha inicio: 11/11/2020 Fecha fin: 19/11/2020

Objetivos

- Aprender a preparar medios de cultivo

- Practicar la siembra de microorganismos en los distintos medios preparados

partiendo de cultivos anteriores que pueden ser solidos o líquidos

- Aprender a realizar el agotamiento en estría y su utilidad

- Aprender a describir las características de colonias que nos han crecido

- Aprender a utilizar la lupa y conocer su utilidad.

- Practicar la tinción de Gram y comprender su utilidad.

- Conocer la composición de los medios de cultivos y su utilidad

Materiales

- Papel de filtro

- Placa calefactora

- Matraz Erlenmeyer

- Asa de siembra

- Autoclave

- Cintas de autoclave

- Agua destilada

- Matraz Erlenmeyer

- Placas Petri

- Tubos y tapones

- Gradilla

- Pesasustancias y espátula

- Peso

- Embudo

- Pipeta graduada 5 y 7 ml

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 - Algodón y papel albal

- Guante térmico

- Mechero Bunsen

- Tubos con colorantes (cristal violeta, lugol y safranina), decolorante(alcohol-acetona)

- Medio de caldo soja-triptona y agar nutritivo

Procedimientos

- Preparación de los medios de cultivo

➢ Pesar en un pesasustancias la cantidad calcula anteriormente

➢ Echar en un matraz Erlenmeyer el agua

➢ Echar el medio en el agua y mezclar

➢ Colocar el matraz en la placa calefactora y calentar hasta que hierva

➢ Poner el tapón y la cinta y autoclavar

➢ Pasarlo a los tubos y a las placas

- Siembra

- Si la siembra se va a realizar en un caldo, introducimos el asa de

siembra que contiene la muestra en el tubo y movemos el asa para
que caiga la muestra.

- Cerrar el tubo y flamear el asa

- Si la siembra se va a realizar en un agar inclinado, lo haremos con la

técnica de siembra por estría en superficie inclinada en tubo

- Introducimos el asa con la muestra en el tubo donde se encuentra el

agar, hasta casi el fondo, sin tocar el final.

- Realizar la siembra por la técnica en estría (zig-zag) hasta arriba.

- Cerrar el tubo y flamear el asa

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 - Si la muestra se va a realizar en una placa, vamos a realizar la
técnica de agotamiento por estría multiple.

- Primero, cogeremos la muestra con el asa de siembra, y la

extenderemos en forma de estría hasta que ocupe 1/3

- Flameamos el asa, giramos unos grados la placa y pinchamos en un

lado el asa para que enfríe, y volvemos a realizar la estría.
Empezaremos llevándonos un poco de lo que hemos sembrado
anteriormente

Si realizamos una siembra correctamente deberías obtener

Zona de descarga Zona intermedia

Zona de colonias aisladas

- Mas tarde, meter en las estufas de incubación correspondientes.

Resultados

CALCULOS

Agar inclinado en tubo

7 ml por tubo x 9 personas= 45ml, aproximadamente 50ml

23g-----------1L

x------------0,07L; x= 1,61 g de agar

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Agar en placa

20 ml por tubo x 9 personas= 180 ml, aproximadamente 200ml

23g-----------1L

x-------------0,02L; x=4,6g de agar

Caldo soja triptona

5ml por tubo x 9 personas= 45ml, aproximadamente 50ml

30,4g-------------1L

x-----------------0.05L; x= 1,52g de caldo soja triptona

SIEMBRA
He sembrado en la placa Micrococcus luteus a partir de la muestra en caldo con la técnica de
agotamiento en estría múltiple

He sembrado en agar inclinado Bacillus spp a partir de la placa con la técnica de siembra por
estría en superficie inclinada en tubo

He sembrado en caldo Serratia marcescens a partir del agar inclinado.

RESULTADOS DE LAS SIEMBRAS

La placa con Micrococcus luteus se mete en la estufa de 30ºC, el agar inclinado con Bacillus spp
en la estufa de 30º también y por último el caldo con Serratia marcescens ira en la estufa de
26ºC

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Descripción Imagen
Agar inclinado: el crecimiento se ha
realizado correctamente ya que se observa
progresión, aunque no se vea perfectamente
la estría.

En el caldo podemos ver que tiene aspecto

turbio, por lo que se observa que ha habido
crecimiento y al resuspenderlo lo hace de
forma homogénea, por lo que parece que ha
crecido bien.

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 En la placa, podemos ver que solo ha crecido
por un lado de la placa, en la zona de
descarga y no se observan colonias aisladas
Al mirar con la lupa, hemos observado el
aspecto de cada colonia y hemos visto que
son incoloras, tienen aspecto mucoso ya que
brillan al mirarlo, con forma irregular, los
bordes son un poco ondulados o
espiculados, y la superficie era planoconvexa

RESULTADOS GRAM

He realizado el Gram de la placa y he podido observar, como ya pensaba, que la placa estaba
contaminada. Se puede ver unas bacilos más gruesos, Gram positivos, que son estructuras
compatibles con Micrococcus luteus, y luego los Gram negativos son unos bacilos mas cortos y
finos rosas, que es el contaminante.

Bacilos Gram positivos, de color

morado por el cristal violeta, son
mas gruesos.

Bacilos Gram negativos, mas finos

y un poco mas cortos, de color
rosa, por la safranina.

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Conclusiones

Los medios de cultivo son indispensables para obtener un correcto crecimiento de los
microorganismos, en esta práctica hemos preparado medios de cultivo generales: agar nutritivo
y caldo soja-triptona. En este proceso deberemos de estar atentos mientras se esta calentando,
ya que cuando comience a hervir debemos retirarlo, y si no lo hacemos se podría salir todo del
matraz. Para el agar inclinado, después de echar el medio es necesario inclinar los tubos para
que cuando se solidifique adopte la forma del agar inclinado. En las placas Petri hay que vertirlo
hasta que cubra la mitad de la placa Petri y en el caldo tomamos un volumen de 5ml de
referencia, aunque no es de vital importancia si sobrepasamos o no llegamos a ese volumen.
Después de prepararlos debemos meterlos en el autoclave para esterilizarlos y eliminar los
microorganismos.

A la hora de realizar las siembras es especialmente importante mantener las condiciones

estériles, ya que es muy fácil que se contamine cualquiera de las muestras. Debemos
mantenernos dentro de la zona estéril, e ir flameando los tubos y las tapas de los tubos con el
mechero Bunsen. También es muy importante mantenernos dentro de la zona de esterilidad
cuando vayamos a sembrar en la placa, ya que es fácil que nos entre algún contaminante. Para
sembrar la placa hemos utilizado la técnica de agotamiento en estría múltiple, que es muy útil
para obtener colonias aisladas ya que en la zona de descarga habrá un crecimiento masivo y las
colonias estarán muy juntas, pero conforme vamos flameando el asa y pasando por la estrías
realizadas anteriormente conseguiremos que al final se encuentre una zona con colonias
aisladas si realizamos bien la siembra. En el tubo con agar inclinado no tocar el líquido que se
encuentra al final del agar ni tocar las paredes, y debemos sembrar por estría en superficie
inclinada en tubo. A la hora de incubar las muestras, es necesario fijarnos en que estufa va cada
bacteria para que pueda crecer correctamente.

Después observamos los resultados obtenidos del tubo, del agar inclinado y de la placa. En la
placa se observaba crecimiento, pero solo por la zona de descarga, por lo que se debe a que no
he realizado correctamente la siembra.

Además, hemos utilizado la lupa para poder observar las colonias de la placa desde más cerca y
con mayor nitidez para poder describir las características de las colonias. La lupa también puede
ser muy útil si queremos hacer un recuento de colonias.

Después de haber observados los tubos y placas, realicé la tinción de Gram, ya que es una tinción
diferencial, de la bacteria que tenía en la placa, porque sospechaba que la placa estaba
contaminada porque Micrococcus luteus al crecer suele dar colonias de color amarillo y las mías
eran incoloras, y efectivamente pudimos confirmar gracias al Gram que estaba contaminado ya
que observamos unas bacilos Gram positivos de color morado teñidos con cristal violeta y unos
Gram negativos de color rosa teñidos con safranina

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Anexo practica 8: Medios de cultivo
CALDO SOJA TRIPTONA
Es un medio líquido para enriquecimiento de uso general utilizado en procedimientos
cualitativos para la prueba de esterilidad y para el enriquecimiento y cultivo de microorganismos
aerobios no exigentes en exceso.

Composición:

• Digestivo pancreático de caseína 17,9g

• Digestivo papanoico de soja 4g

• Cloruro sódico 6g

• Fosfato monopotásico 2,5g

• pH 7,3

Precauciones

 Esterilizar en autoclave

AGAR NUTRITIVO
Es un medio de uso general, no selectivo, adecuado para el cultivo de una amplia variedad de
microorganismos no exigentes. Se puede usar como medio de recuento de colonias en
bacteriología sanitaria, médica e industrial.

Composición

• Peptona 5g

• Agar bacteriológico 15g

• Extracto de carne 3g

• pH de 6,8

Precauciones

 Esterilizar en autoclave

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Practica 9: Preparación del inoculo estándar y siembra para
recuento
Fecha inicio 19/11/2020 Fecha fin: 30/11/2020

Objetivos

- Aprender a realizar la técnica de siembra de los tres giros para recuento bacteriano.

- Aprender a preparar un inóculo estándar mediante el método de suspensión directa

de colonias.

- Familiarizarse con los recuentos de colonias .

- Aprender a realizar los cálculos necesarios y relacionarlo con los estándares de

McFarland.

Materiales

➢ Papel de filtro

➢ Tubos de ensayo

➢ Gradillas

➢ Asa calibrada estéril de 10 μl

➢ Solución SSF

➢ Asa de siembra

➢ Estándares de Mc Farland

➢ Mechero Bunsen

➢ Placa Petri con medio de cultivo PCA

➢ Agua destilada

Procedimiento

- Echar el tubo de SSF (de 1 ml) a un tubo

- A partir de un cultivo anterior en placa, se añaden 3 o 5 colonias de la placa hasta ajustarlo

a una turbidez 0,5 en la escala McFarland. Se añadirán más colonias si es necesario, hasta
que nuestro tubo este igual que el patrón con el que lo estamos comparando visualmente.

- Sembrar en una placa para recuento con asa calibrada con la técnica de los tres giros

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Resultados

Comparación del estándar de Mc Farland

y nuestro inóculo

RESULTADOS DE LA SIEMBRA DE LA PLACA

- Se puede ver que la placa esta contaminada porque se diferencian los dos tipos de colonias
que hay. Además, tampoco ha crecido correctamente porque se observa que solo ha crecido
por una parte de la placa.

Colonia que nosotros cultivamos,

se supone que es Escherichia coli

Colonia contaminante.

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RECUENTO DE LA PLACA
Ya que no puedo hacer el recuento de mi placa ya que está
contaminada y no ha crecido bien, vamos a realizar el recuento a
partir de la placa de una compañera

UFC: 111x4 cuadrantes

444--------------10 μl

x-----------------1000 μl; x= 4,4 x104 celulas/ μl

Conclusiones

En esta práctica hemos preparado un inóculo para realizar la siembra para recuento. El inóculo
lo prepararemos mediante el método de suspensión directa de colonias, e iremos comparando
la turbidez con los estándares de la escala McFarland. Debemos ajustarlo a una turbidez de 0,5
añadiendo colonias, y si vemos que nos hemos pasado de turbidez debemos diluir la muestra
añadiendo más SSF. Debemos asegurarnos de que el inoculo estándar que estamos preparando
tenga la misma turbidez que el patrón, ya que el grado de turbidez del inoculo está relacionado
con una concentración de células (bacterias) determinado. Comentado esto, nos damos cuenta
que si realizamos mal el inoculo el recuento de bacterias será erróneo. Además, en vez de haber
usado esta técnica también podríamos haber utilizado un espectrofotómetro midiendo la
absorbancia de la suspensión a 600-625 nm, ya que hay mucho menos margen de error.

Sembraremos una placa para realizar el recuento de colonias utilizando como medio de cultivo
PCA. A la hora de realizar la siembra lo realizaremos con la técnica de los tres giros que nos
permitirá obtener una buena distribución de las bacterias. Tendremos que intentar realizar una
distribución lo más homogénea posible y llegar a los bordes de la placa para que las colonias
después de incubarlas podamos encontrarlas dispersas por toda la placa. Para que no se rompa
el medio de cultivo debemos tumbar mas el asa, y no ponerlo tan horizontal.

Yo no pude realizar el contaje de colonias en mi propia placa ya que no se habían distribuido

bien y estaban tan solo en una parte de la placa, además el cultivo se encontraba contaminado.
Tuvimos que realizar el recuento de la placa en la placa de una compañera ya que se podían
observar mejor las colonias aisladas, aunque aun así se encontraban también en una parte de la
placa. Los resultados que obtuvimos tras realizar los cálculos necesarios fueron 4,4 x104 células/
μl, una cifra muy por debajo de lo que nos debería haber dado que es 1,5 x107 células/ μl si nos
fijamos en la escala de Mc Farland. Esto puede deberse a un error al preparar el inóculo y que
realmente no estuviese bien ajustada la turbidez del tubo, por lo que en este caso se debería
repetir el inóculo y volver a realizar la siembra.

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Anexo practica 9
AGAR PCA( PLATE COUNT AGAR)
Es un medio líquido para enriquecimiento de uso general utilizado en procedimientos
cualitativos para la prueba de esterilidad y para el enriquecimiento y cultivo de microorganismos
aerobios no exigentes en exceso.

Composición:

• Triptona 5g

• Glucosa 1g

• Extracto de levadura 2,5g

• Agar 9g

• pH= 7

Precauciones

 Esterilizar en autoclave

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Practica 10: Tinción esporas: Wirtz-Colkin
Fecha inicio: 25/11/2020 Fecha fin: 3/12/2020

Objetivos

➢ Aprender el procedimiento para la tinción de esporas y la utilidad de los colorantes

➢ Seguir practicando los frotis.

➢ Saber identificar las esporas y saber diferenciarlas de las células

Materiales

- Papel de filtro

- Asa de siembra

- Papel de filtro

- Antorcha

- Alcohol

- Asa de siembra

- Agua destilada

- Verde malaquita

- Safranina

- Matraz Erlenmeyer

- Placas Petri

- Tubos y tapones

- Tubos con agar inclinado y caldo

- Portaobjetos

- Bacterias

Procedimientos

- Frotis y fijación

- Tinción

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 o Añadir verde malaquita y dejarlo 5-7 minutos, mientras lo calentamos suave con
ayuda de una antorcha

o Lavar con agua

o Añadir safranina y dejarlo 1 minuto

- Mirar al microscopio

Resultados

- En mi muestra no he podido observar esporas, por lo que pongo la muestra de una

compañera, en la que si se han podido observar

Campo microscópico de 100x,

donde se ven bacilos de color rosa

Esporas de color verde

Bacilo en proceso de esporulacion

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Conclusiones

Hemos realizado la tinción de Wirtz-Colkin, que es una tinción estructural puesto que permite
teñir las endosporas. Las endosporas son una forma de resistencia de las bacterias y se
producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de nutrientes,
presencia de algún agente químico, temperaturas extremas…). Las endosporas solo aparecen
en Gram positivos, destacan los géneros Clostridium y Bacillus. Nosotros hemos partido de una
muestra de Bacillus sp, y hemos podido observar esporas y también hemos visto bacilos en
proceso de esporulación.

Las esporas bacterianas poseen cubiertas muy impermeables por lo que se necesitan tinciones
con calor para favorecer la entrada del colorante. Para realizar esta tinción hemos usado
primero una solución de verde malaquita mientras le poníamos calor con la antorcha para
favorecer la entrada de colorante y que se tiñan las esporas. En esta parte del proceso
debemos estar atentos de que las muestras no se queden secas, ya que se queman muy
rápido, por lo que deberíamos retirar un poco la antorcha cuando emita vapores. Luego, en
esta tinción no es necesario añadir un decolorante, es suficiente lavarlo con agua para que las
formas vegetativas pierden el colorante y se quedan incoloras, que posteriormente serán
teñidas con safranina de color rosa. Por lo tanto, las esporas se observarán de un color verde y
las formas vegetativas de un color rosa.

Por último, debemos coger la muestra de cultivo exacto de crecimiento, ni muy viejo ni muy
joven, para poder observar tanto bacilos en proceso de esporulación y esporas, y no
confundirla con restos de colorante.

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