TURBIDIMETRA y NEFELOMETRA

Dra. Cynthia E. Mrquez Serrano R1 Patologa Clnica

Espectrofotometra

ENERGIA RADIANTE
Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiacin de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo. La absorcin de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica.

 El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas.

ENERGIA RADIANTE
La Radiacin Electromagntica es una forma de Energa radiante que se propaga en forma de ondas. En este fenmeno ondulatorio se define:
a) Longitud de onda (l): es la distancia entre dos mximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, en nanmetros (nm).

 Frecuencia (n): es el nmero de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de onda. Su frmula es: n = c/l, y se mide en ciclos por segundo o hertzios. c) Fotones: la luz est formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de E. La E de un fotn depende de la frecuencia y de la longitud de onda.

La relacin entre la longitud de onda y la Energa es inversa, por lo tanto a menor longitud de onda mayor Energa y viceversa.

Espectro Electromagntico: cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos g de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga.
Regin Ultravioleta: l = 10-380 nm Regin Visible: l = 380-780 nm

Regin Infrarroja: l = 780-30.000 nm

 En la Regin Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene todo el espectro de longitudes de onda.

FENMENO DE ABSORCIN
Cuando una partcula que se encuentra en estado de reposo interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma en una partcula en estado excitado. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de cromgeno, tiene un determinado espectro de absorcin. Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia estudiada absorbe la mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz, mayor cantidad de sustancia).

 La medida de la absorbancia de una solucin es usada para determinar la concentracin de analitos tales como colesterol, glucosa, creatinina y triglicridos en sangre. Cada uno de estos analitos se hace reaccionar qumicamente con determinados compuestos, a fin de obtener una solucin coloreada. A mayor intensidad de color, mayor ser la absorbancia de la solucin en una determinada longitud de onda. La absorbancia es entonces directamente proporcional a la concentracin del analito en sangre.

ABSORBANCIA

medio, se registra una pasa aprdida de un Cuando un haz de luz travs cierta de

intensidad, debido a la absorcin por parte de la sustancia. A mayor cantidad de luz absorbida, mayor ser la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz ser transmitida por dicho cuerpo.

Se puede perder intensidad por la interaccin con la cubeta o el solvente. Para evitar este error se hace una primera medida con una solucin de referencia o BLANCO, que contiene todos los posibles compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos a medir. Todas las medidas que se hagan con posterioridad sern referidas a esta medida inicial y se harn en la misma cubeta que se utiliz en la medida del blanco.

ESPECTROFOTOMETRO

ESPECTROFOTOMETRO
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromtica a travs de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones: 1. Dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra 2. Indicar indirectamente qu cantidad de la sustancia que nos interesa est presente en la muestra

Fuente de luz: proporciona energa radiante en forma de luz visible o no visible. Tipos de lmparas: - Filamento de tungsteno
- Lmparas de filamentos de haluros de tungsteno - Lmparas de Hidrgeno y Deuterio - Lmparas de vapores de Mercurio

Precauciones: - La lmpara tiene una vitalidad limitada y se debe vigilar para que funcione bien el aparato.

Filtro: tiene como funcin reducir al mximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa entre en el sistema de seleccin de longitud de onda. Monocromadores. Prismas: De vidrio para trabajar en el espectro visible o cuarzo para trabajar en el ultravioleta lejano.

Cubeta: es el recipiente donde se coloca la muestra para la medicin. Se obtienen mejores resultados usando cubetas de bordes paralelos. Suelen estar fabricadas en vidrio o en plstico.
Detector y Medidor: sistemas de lectura de la Energa elctrica que recoge el detector y que puede ser lectura directa (se utiliza una clula fotovoltaica) o puede ser amplificadores de seal como en el caso del fototubo multiplicador. Los actuales aparatos incorporan lectura digital y clculos automticos de concentraciones con relacin a las curvas de calibracin.

METODOS FOTOMETRICOS
Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensin de partculas slidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La turbidez es la propiedad ptica de una muestra que hace que la radiacin sea dispersada y absorbida ms que transmitida en lnea recta a travs de la muestra. La turbidez es ocasionada por la presencia de materia suspendida en un lquido.

METODOS FOTOMETRICOS
Cuando un haz de luz choca con una partcula en suspensin parte de la luz se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe. La dispersin de la luz depende de:
Tipo y forma de las partculas El tamao de las partculas La concentracin de las partculas La longitud de onda de la luz de radiacin ndices de refraccin relativos de las partculas y del medio.

La dispersin de la luz se puede medir por turbidimetra o por nefelometra

TURBIDIMETRIA
La turbidimetra mide la disminucin de la luz transmitida a travs de una suspensin de partculas utilizando para ello un espectrofotmetro (en la misma direccin del haz de luz). La suspensin se pone en una cubeta (similar a un tubo de ensayo), que permite realizar las medidas de las energa incidentes y transmitidas.

 Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminucin de la luz transmitida) determinacin de protenas totales en suero, LCR u orina, crecimiento bacteriano en cultivos de medio lquido.

NEFELOMETRA
Entre 1967-1969 aparecieron los primeros nefelmetros por R. F. Ritchie disponibles en el laboratorio clnico y en 1974 se desarroll el primer nefelmetro con un sistema ptico de rayo lser. En los ltimos 15 aos el laboratorio clnico ha reemplazado el mtodo de inmunodifusin radial por los mtodos nefelomtricos.

 Se emplea una fotocelda colocada en un ngulo de 90 (ngulos que oscilan entre 15 y 90) con respecto a una fuente luminosa. Los mtodos nefelomtricos permiten detectar partculas extremadamente pequeas en solucin y detectar los estadios muy precoces de la agregacin molecular.

IgG IgA IgM C3 C4 ApoB

TRANSFERRINA HAPTOGLOBINA ALBUMINA MICROALBUMINA ApoA PCR

AT - III FIBRINOGENO MIOGLOBINA ASL RF

Gracias