TEMA 2: TECNICAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA CLÍNICA

2.1 ESPECTROFOTOMETRIA DE MASAS

Se basa en obtener iones en estado gaseoso a partir de moléculas para luego separarlos en función de su
carga. Los procesos originados son químicos, se obtiene un espectro con el tipo y la cantidad de iones
diferentes. La muestra utilizada no se puede recuperar porque queda modificada químicamente y los iones
se destruyen al ser detectados. Presenta numerosas ventajas

• Especificidad: puede medir la molecular de un analítico y sus fragmentos, puede detectar cualquier
molécula
• Sensibilidad: detecta moléculas en cantidad de attomoles
• Versatilidad: aplicable a todo tipo de muestras

2.1.1 Espectrofotómetro de masas

Equipo complejo capaz de diferenciar y cuantificar cualquier tipo de molécula en concentraciones bajas

FUNCIONAMIENTO GENERAL

1. Volatilizar la muestra
2. Ionizar las muestras en estado gaseoso
3. Acelerar los iones: La nube de iones se somete a un campo eléctrico y los iones con más carga irán
más rápido
4. La nube acelerada se somete a un potente campo magnético y separa los iones según su relación
masa/carga
5. Detecta los distintos iones separados y procesa la información: Un sistema detector mide el grado
de desviación de cada ion, y con eso se determina la composición química de la muestra original

COMPONENTES PRINCIPALES

1. Sistemas de ionización
Permite volatilizar y ionizar la muestra. Dos tipos de técnicas
➢ Ionización por pulverización eléctrica: para disoluciones y se obtiene bastantes moléculas, el
espectro obtenido tiene bastantes picos. Se acopla a métodos cromatográficos, medio líquido.
➢ Desorción por laser asistida por matriz: La muestra solidifica y se excita con un laser que
provoca la ionización y volatilización de la muestra
➢ Otros: desorción laser, ionización por laser inducida en superficie o el bombardeo con átomos
acelerados
2. Analizador
Separa la mezcla de iones que se ha obtenido tras la ionización, en función de su masa/carga
➢ Analizadores de sector magnético: Se utilizaba un sist. de aceleración de iones y un imán que
hace que el haz de iones se desplace de forma circular
➢ Espectrofotometro de masa cuadripolar(Q) : Espectrofotómetro que tiene 4 barras alargadas
formando un cuadrado, conectadas entre pares opuestos, que se les aplica una tensión de
radiofrecuencia variable que sintoniza con un determinado ion. Cuando existe sintonía entre el
ion y la frecuencia, dicho ion continua su camino y los demás se desvían fuera del cuadripolo e
impactan con el detector
➢ Analizadores de masas tiempo de vuelo(TOF) : capaz de separar los iones según el tiempo que
tardan en llegar al detector.
 3. Detector
Los iones procedente del sistema acelerador llegan al detector, constituido por cátodo emisor que
recibe el impacto producido por las partículas cargas, emite electrones. Esta señal se registra, y lo
resultante es un grafico que representa la abundancia relativa de los iones producidos

APLICACIONES DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA DE MASAS

En las técnicas de screening neonatal (enfermedades metabólicas hereditarias), en toxicología, en fármacos
y en proteómica.

2.2 Técnicas cromatográficas

Diferente comportamiento de los componentes de la muestra al ser desplazados o retenidos por la acción
conjunta y contrapuesta de una fase móvil que se hace pasar de una fase estacionaria

➢ FASE MOVIL(ELUYENTE): Gas/liquido que ejerce el efecto del desplazamiento de los componentes
de la muestra.
➢ FASE ESTACIONARIA: Incluida en soporte (columna/superficie sólida) y retendrá los componentes.

Los componentes que se unan fuerte a la fase estacionaria se moverán lentamente con el flujo de la fase
móvil, y los que se unan débil se moverán rápido. La diferente movilidad hace posible su separación, el
registro de esta separación (cromatograma) permite realizar un estudio cualitativo y cuantitativo

TIPOS DE CROMATOGRAFIA SEGÚN FASE MOVIL

➢ Gaseosa: La fase móvil es un gas

➢ Liquida: La fase móvil es un liquido

TIPOS DE CORMATOGRAFIA SEGÚN EL SOPORTE DE LA FASE ESTACIONARIA

➢ Cromatografía plana: Soporte plano (papel o gel) sobre el que se desplaza la fase móvil por
capilaridad. Bandas separadas que se revelan pulverizando la capa con fluoresceína e iluminando
con luz UV una sust química (ninhidrina) que reacciona con los aa y produce manchas coloreadas
➢ Cromatografía en columna: Es un tubo relleno de fase estacionaria (liquida o solida) sobre la que
se inyecta una fase móvil (gas o liquida) de forma continua, de forma que al final de la columna se
recogen los volúmenes de los eluyentes a distintos tiempos. Se obtiene un cromatograma, los picos
de la gráfica identifican las sustancias analizadas por comparación con los tiempos de retención, El
área de los picos permite calcular la concentración de las sustancias. Cuanto más estrechos y
separaos estén los picos, mejor será la separación de las sustancias
❖ Tiempo muerto: tiempo que tarda en salir la fase móvil desde que se inyecta
❖ Tiempo de retención: tiempo que tarda en salir una determinada molecual
❖ Tiempo de retención corregido; tiempo real que la fase estacionaria ha retrasado el
avance
❖ Línea base: señal producida cuando solo sale fase móvil
❖ Altura y área del pico: concentración de la sustancia.

TIPOS DE CROMATOGRAFIA SEGÚN EL TIPO DE INTERACCION QUE PERMITE LA SEPARACION

➢ Cromatografía de adsorción: La fase estacionaria es solida y la fase móvil liquida o gas. La

separación depende de la polaridad de las moléculas y se suele hacer en columna
➢ Cromatografía en reparto: Separa las sustancia según su distribución en dos fases liquidas
inmiscibles. Cada sustancia migra una distancia según su solubilidad, R f(distancia recorrida
sustancia/ frente de avance de la fase móvil) en columna, en papel, o en capa fina
• En fase normal: fase móvil apolar y la estacionaria polar
• En fase reversa: fase móvil polar y la estacionaria apolar
 ➢ Cromatografía de intercambio iónico: Se separan las sustancias según su carga, se basa en la
interacción iónica del soluto con la fase estacionaria que tiene grupos funcionales cargados. La fase
móvil es un sólido, se lleva a cabo en columnas
• Resina con cargas fijas negativas y contraiones positivos, retienen moléculas +
• Resina con cargas fijas positivas y contraiones negativos, retienen moléculas –

USOS: para separar compuestos de naturaleza iónica: aminoácidos, proteínas, péptidos, nucleótidos

➢ Cromatografía de penetrabilidad: La fase estacionaria esta formada por esferas de gel con poros
depende del gel. Se separan las sustancias en función de su tamaño, las mas grandes no caben en
el poro, y pasan entre las esferas y llegan antes. La fase móvil es líquida; la elución depende de la
forma y el tamaño de la partículas
➢ Cromatografía de afinidad: Para separar sustancias que pueden establecer iones ligando-receptor,
enzima-sustrato o Ag-Ac. Se inyecta la muestra, los Ac se unen al Ag especifico y lo demás eluira. La
elución de la sustancia buscada se conseguirá modificando el pH de la fase móvil. Test
inmunocromatográficos, como los de embarazo.

2.2.2 Cromatografía de líquidos de alta resolución

Para determinar hormonas, catecolaminas, glucohemoglobina, aminoácidos y fármacos.

COMPONENTES

• Sistema impulsor de la fase móvil: Bomba impulsora de fase móvil, apolar(ciclohexano) o polar
• Inyector de la muestra: Permite inyectar la muestra evitando interferencias en la corriente
• Columna: Procedida de una precolumna con características parecidas que impide la entrada de
contaminantes.
• Fase estacionaria: varios tipos según su naturaleza(apolar o polar), el principio de separación y el
tipo de soporte que usen.
• Detector: absorbancia, índice de refracción, fluorescencia, amperometría y espectrómetro de
masas.
• Registro-integrador: Permite obtener el cromatograma

PROCEDIMIENTO:

La fase móvil pasa a través de la columna por el sistema impulsor que proporciona un flujo constante y
uniforme. La muestra se inyecta al sistema por el inyector y la separacion se produce según la columna.
Los compuestos que van eluyendo son detectados por el detector y el sistema de lectura proporciona el
cromatograma que permite el análisis cuantitativo y cualitativo

2.2.3 Cromatografía de gases

La mas utilizada la de gas-liquido con fase móvil gaseosa y fase estacionaria liquida retenida sobre la
superficie de un solido inerte. Usada en la determinación de fármacos y estudios toxicológicos

COMPONENTES

• Gas portador (fase móvil): gas inerte que fluye por la columna a la presión adecuada
• Sistema inyector de la muestra: Las muestras biológicas deben ser transformadas por un sistema
que volatiliza la muestra(microjeringa) para ser inyectadas
• Columnas en desarrollo: capilares rellenos de partículas inertes(microesferas de vidrio)
• Fase estacionaria: Liquido no volátil. Depende de las moléculas que se quiera separar
• Horno: columna dentro de un horno para controlar y variar la temperatura según necesidades
• Sistema de detección
PROCEDIMIENTO

Se volatiliza la muestra y luego se inyecta en la columna gracias al gas inerte (transporta la muestra). La
separación se produce por la solubilidad y difusión de los compuestos volatilizados. La gran longitud de las
columnas posibilita un alto grado de resolución y un máximo rendimiento del proceso. Los compuestos
que salen de la columna son analizados por el detector y se obtiene el cromatograma

2.3 Osmometría
Medida del efecto osmótico (número de partículas del soluto disueltas en ella), independiente del tamaño
o carga de iones o moléculas presentes.

Osmolalidad: número de partículas del soluto por unidad de masa del disolvente (mOSm/kg)

Osmolaridad: número de particulas del soluto por unidad de volumen de la disolución (mOSm/l)

La osmolalidad se calcula con un osmómetro, que se fundamenta en las propiedades coligaticas

➢ De punto de congelación: cuando aumenta la osmolalidad disminuye el punto de congelación

➢ De punto de condensación: cuando aumenta la osmolalidad aumenta la presión de vapor

Se usan para el estudio del equilibrio hidroeléctrico

2.4 Técnicas electroquímicas

Electrodos selectivos para compuestos iónicos

Contienen una membrana que reacciona de forma selectiva con un solo ion. La parte externa de la
membrana esta en contacto con la solución que tiene el ion que debe medirse, la parte interne contiene
una solución del mismo ion a una actividad fija

2.5 Automatizacion de las técnicas de laboratorio

Mecanización de los procesos que tienen lugar en el laboratorio para procesar muestras y realizar tareas
repetitivas.

Automatizacion parcial

Afecta a todos los laboratorios, y automatiza en los procesos preanalíticos, analíticos y postanaliticos.

Fase preanalítica: Automatización del proceso de preparación de las muestras antes de su análisis.

➢ Unidad de entrada de muestras: clasificar y ordenar los tubos primarios

➢ Unidad de centrifugación: centrifuga automáticamente
➢ Unidad destaponadora: Quitar el tapón a los tubos
➢ Unidad alicuotadora: Realizar e identificar las alícuotas necesarias.
➢ Unidad clasificadora: Organiza el tubo primario y alícuotas para dirigirlos a su destino analítico.

El personal del laboratorio se encarga del manejo de todas las máquinas

Fase analítica: Los autoanalizadores

➢ Dispositivos de carga: Se introducen los tubos primarios para ser analizados. Circulares o cadenas
➢ Dispositivo de identificación de muestras: Conectados al SIL y con lectura de código de barras.
Los técnicos verifican la identificación e introducen manualmente los códigos necesarios para
análisis.
 ➢ Dispositivos de toma y dispensación de muestras. Micropipetas que toman el volumen de
muestra y lo llevan a la cubeta de reacción.
➢ Dispositivos de almacenaje de reactivos: Se identifican mediante código de barras sus posiciones
➢ Dispositivos de dispensación de reactivos: Pipetas que cogen el volumen necesario de reactivo y
lo llevan a la cubeta para hacer la mezcla de reactivo y muestra.
➢ Cubetas de reacción: Plástico/vidrio y son lavados y secadas. Van dentro de baños de incubación.
➢ Sistema de medida: espectrofotométrica, nefelométricas, fluorescencia y electroquímica.
➢ Sistema informático: Procesan y presentan los datos analíticos

Personal técnico de laboratorio es el encargado de carga, funcionamiento y descarga del

autoanalizador, y de la validación técnica de los resultados.

Fase postanalítica

➢ Genera pruebas reflejas: Capacidad del SIL de generar nuevas pruebas realizadas como
consecuencia del resultado obtenido.
➢ Crear archivos de muestras: Se mecaniza la creación de archivos de muestras en condiciones
adecuadas para poder hacer mas análisis sin volver a cargar la muestra en el analizador

Automatizacion total

Permite la obtención de resultados analíticos sin apenas intervención humana

➢ Cinta transportadora: va desde el modulo de preanalítica hasta la xeroteca pasando por los
diferentes módulos analizadores
➢ Brazo robotizado: Se desplazan los tubos por la cinta y desplazados a los diferentes analizadores
mediante los brazos robotizados
➢ Sistemas informáticos