TEMA 9.

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Apuntes teoría

2º Ingeniería Genética

Grado en Biotecnología

Facultad de Ciencias Experimentales

UAL - Universidad de Almería

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su
totalidad.
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TEMA 9: CONSTRUCCIÓN Y CLONACIÓN DE

MOLÉCULAS DE ADN RECOMBINANTE
Genotecas genómicas
- Todo el genoma de la especie en, al menos, un clon.
- Contiene todas las secuencias informativas de un gen.
- Algunas secuencias no informativas.
Una genoteca genómica es coger todo el genoma de un híbrido, de un individuo de una
especie, y clonar en un vector de clonación. Tiene como ventaja que contiene toda la
secuencia informativa de cada gen y como inconveniente tiene que algunas secuencias del
genoma no son informativas.

Probabilidad

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
N es el número de genes que tengo que analizar para tener cierta probabilidad de encontrar la
secuencia del gen que nos interesa.
Con un genoma de un millón de pares de nucleótidos vemos en la tabla el número de clones
que necesitamos, dependiendo de la probabilidad y del tamaño medio de los insertos. Esto
condiciona todo, ya que condiciona la extracción de DNA, qué tipo de DNA extraigo.
Con un método de extracción de DNA normal no se suele pasar de 20kb. El tamaño de 5kb se
suele dar como mucho en una librería que esté hecha en plásmido, 20kb en bacteriófagos y
200kb en Cromosomas Artificiales de Bacterias (BAC).
Lo siguiente sería en cromosomas artificiales de levaduras, tienen unos espectros tan grandes
que ya dejan de ser interesantes.

N es el número de clones
P es la probabilidad de recuperar una secuencia
dada
f es la fracción del genoma que representa la
secuencia

Equivalentes
Si tenemos una especie con sólo un cromosoma, el número de equivalentes sería un
nucleótido dado lo deberíamos tener contenido en N clones distintos. Es decir, cuantas veces
como media ese genoma está contenido en la genoteca. A su vez esto significa que en cada
posición del genoma se necesitarían 7 clones independientes por ejemplo. Hay posiciones del
genoma que está en todos los clones y otros que no.

Cuando el tamaño de los insertos es grande es más difícil de observar, pero cuando son
pequeños (plásmidos) hay regiones que se clonan fatal. Esto no se tiene en cuenta, ya que a
veces el DNA que se intenta clonar en una bacteria puede resultar tóxico para la bacteria al
recombinar con su propio material genético.
Por suerte, cuando la genoteca es genómica, si el
gen tiene intrones esto no va a ocurrir nunca ya que
el gen no se va a expresar dentro de la bacteria.
Siempre vamos a encontrar Gaps.
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Pasos para obtener una genoteca genómica:

- Elección vector clonación: Extracción de ADN de calidad y peso molecular adecuados al
vector elegido
En una extracción normal el tamaño medio de los fragmentos es de 20kb.
1. Digestión completa:
 Elección de enzima determina el tamaño de fragmentos (4 pares de bases en
fragmento pequeños y 8 pares de bases en fragmento largos).
 Fragmento NO solapantes, inconveniente. En el caso de que esto fuera así
siempre tendríamos el mismo fragmento.
2. Digestión parcial: Los extremos siempre van a ser solapantes. Que sea parcial
quiere decir que ponemos una enzima de restricción y que controlando el tampón
y el tiempo no dejamos que actúe al 100%, por lo que va a cortar en algunas dianas
y en otras no. Por este motivo cada fragmento va a ser único

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 Limitando cantidad de enzima y tiempo de acción se obtiene una población de
fragmentos solapantes.
 Selección de tamaño (electroforesis, etc).
 Fragmentos con extremos cohesivos: presentan una ventaja, ya que tienen la
diana de restricción que se haya elegido. No vamos a elegir una diana de corte
romo, puesto que es difícil de clonar después.
3. Rotura mecánica: Consiste en coger el ADN y someterlo a fuerzas de cizalla súper
controladas, para que después el ADN quede como media del tamaño que uno
quiera.
Siempre vamos a tener la forma de una campana de Gaus, si nos interesa un
determinado tamaño hay que pensar en algo para seleccionar sólo los fragmentos
que separen los más grandes de los más pequeños.
Este método de rotura mecánica es uno de los más empleados actualmente, se
pasa el ADN por una prensa francesa (una boquilla muy pequeña que se somete a
una presión, controlamos la presión de entrada, el tamaño de la boquilla y el
tamaño de los fragmentos que salen , los que son capaces de atravesar la boquilla)
 Fragmentos solapantes, que tienen ventaja.
 Extramos no uniformas que requieren de reparación enzimática antes de
poder ser clonados, ya que el ADN está roto mecánicamente, no está apto
para ser clonado, lo cual es un inconveniente.

Ejemplo de una genoteca hecha en BACs

La extracción de DNA se hace en discos de agarosa. La muestra del material que uno quiere
extraer el DNA se envuelve en una gelatina para que nunca haya fuerzas de cizalla, ni si quiera
de agita. Se necesitan varios días de extracción.
Si queremos cambiar un tampón o requiere una sal, esta sal tiene que estar dentro de la
gelatina. Las digestiones del DNA con las enzimas de restricción también se hacen dentro
de la gelatina.
Como vemos en la imagen se han probado distintos tiempos y distintas cantidades de
enzima NodI. Hay siempre ADN sin digerir ya que se está variando la concentración de Nod
y Nod no lo digiere completamente. Una vez que se obtiene el tiempo idóneo, se elige uno
de los tiempos, se digiere suficiente cantidad de DNA y se somete a una electroforesis, se
separa y se obtiene el tamaño seleccionado. Se descartan los fragmentos de tamaño muy
pequeños y los más grandes.
En la imagen vemos representada una Electroforesis en campo pulsante:

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Como marcador de tamaño se utiliza el genoma del bacteriófago landa concatemerizado.
Tenemos una agarosa de baja concentración, donde la movilidad de los electrones va
cambiando (normalmente son de 6-8 electrodos). La idea es que el DNA muy grande vaya
moviéndose despacio poco a poco pasando por los poros de la agarosa.
Después de elegir un tiempo, cuando se carga mucho DNA se ve fragmentos muy grandes
y fragmentos muy pequeños, se selecciona entre 100 y 200 y se purifica el gel de agarosa.
Normalmente se utiliza agarosa de bajo punto de fusión, una agarosa que está
parcialmente modificada y se fusiona a una Tª muy baja, 60ºC aproximadamente.

Cálculo del tamaño medio de clones BAC (Digestión con enzimas utilizadas para clonar)

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Cogen número de clones de los BAC digeridos con el enzima con el que hicieron la
genoteca. Volvemos a tener marcador de tamaño en el genoma con concatémeros.
El vector empleado es pÍndigoBAC, que sea de color azul índigo quiere decir que tiene LacZ
para ver los clones que tiene inserto con los clones que no. El vector digerido con Nod se
linealiza, y todo lo que no sea vector es inserto (Exceptuando dos clones, que solo tienen
un fragmento Nod).
Arriba en los pocillos, siempre tenemos DNA tan grande que cuesta trabajo que entre en el

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gel a pesar de ser campo pulsante.

Identificación de clones mediante el método tradicional

Una vez que tenemos una genoteca hecha, ¿cómo buscamos un clon que contenga al gen
que nos interesa?
Esto es lo que se conoce como screening. El método más empleado es hibridación, hay que
crecer el número representativo de la genoteca. Dependiendo de los clones se hará la
dispersión de una alícuota de los clones de manera que contenga al menos la copia de uno
de los fragmentos, se transfiere a la membrana como la que vimos de los Southern. Es muy
importante marcar los clones, ya que si cada genoteca está contenida en 100 placas de
Petri luego no hay manera de distinguirlas.
Lo que se hace es colocar la membrana encima de la placa de Petri, y en el momento en el
que se pone, en unos segundos o unos minutos para que todos los genes se estampen en
la membrana, con una aguja se marcan tres puntos. Al cabo de un tiempo se levanta la
membrana y nos hemos llevado una réplica de todo lo que estuviese ahí. Tras esto se
desnaturaliza el DNA cambiando la Tª y pH, se fija el DNA que estará estampado en la
membrana y se marca con unas sondas radiactivas. Se espera un poco y esperamos que las
sondas radiactivas produzcan su secuencia complementaria inversa, con lo cual al final
tendremos de 1-3 señales de hibridación en determinadas membranas.
Lo difícil es a través de esta señal, ir para atrás y encontrar en la placa el clon positivo.
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Identificación de clones

Hoy en día la mayoría de las genotecas se dan en placas de 96 (8x12). Están marcadas
desde la A a la H y del 1 al 12, de esta forma es más fácil la manipulaciín, regulación, etc.
- BACs que contienen al marcador genético cri2:

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Vemos un screening de una Genoteca BAC de melón descrita por Luo y col., 2000,
generada con digestión parcial HindIII.
Contiene 85.248 clones con un tamaño medio de inserto 118 kb. La cobertura es
de 15,5 equivalentes del genoma de melón.
Tenemos una membrana de 20*20, se muestran 18.432 clones. Se dispone de 6
campos, cada uno de los cuales posee 384 clones por cuadrícula y en cada una de
las cuadrículas hay 8 clones.
Siempre que se hace una hibridación por
muy limpia que se haga hay fondo, esto
quiere decir que puede caer un poco de
la sonda radiactiva y quedarse en un
punto de la membrana que va a dar una
señal. Si cada uno de los clones estuviese
contenido en un solo punto, se puede
dar la mala suerte de que ahí hubiese un
clon y eso sería un falso positivo. Por eso
el screening se hace en el que cada uno
de los clones, en la cuadrícula de 8 está
dos veces en una disposición que le
determinemos al robot.
Vemos una disposición en la que el clon que señalamos el clon es la 2 y otra es una
disposición en la que el clon que dio señal positiva es el 3. Siempre se necesita para
que un clon sea positivo que dé dos señales.

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Esto no se puede hacer sin robot, hay que automatizar el proceso. Estamos
hablando de hacer hibridaciones en un tamaño de membrana lo más pequeño
posible.

- Estrategia de pooler o superpooler

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¿La forma más eficiente de identificar el clon positivo de la placa?
Queremos saber qué colonia tiene el fragmento de DNA que a nosotros nos
interesa.
Se ponen 96 clones en un solo pool y se hace una sola extracción de ADN. En este
experimento, había 343 placas de 96 colonias cada una, por lo que se realizan 343
pooles.
Un determinado pool se mezcla con otros pooles: superpooles.
En este caso se han hecho 7 superpooles de 49 pooles:

Se hacen 7 PCRs con los cebadores del fragmento de interés para ver en qué
superpool está la colonia que lo contiene.
Una vez que conocemos en qué superpool está el fragmento de interés, hacemos
14 superpooles más: con los pools de 1, 2, 3, 4 decenas, e igual con las unidades.
Realizamos 14 PCRs.
Una vez sabemos en qué placa de 96 colonias está la colonia de interés seguimos
realizando pooles.
Podemos hacer pooles de 8 filas y de 12 columnas. Tendremos que hacer 20
extracciones y 20 PCRs (10 para las decenas y 10 para las unidades), cada una de
las PCRs tendrá un conjunto de colonias que es lo que conocemos como pool. Si
nos da por ejemplo positivo el pool con la unidad 4 y el pool con la decena 2,

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sabemos que nuestra colonia es la 24 y lo hemos hecho sin tener que hacer 96
PCRs.
Sabiendo la fila y la columna podremos saber qué colonia de la placa de 96
contiene el fragmento que nos interesa.
En resumen:- Si analizamos 343 placas de 96 colonias cada una, una vez que
sepamos cuál de las placas de 96 colonias tiene el clon que nos interesa, tenemos
que saber cuál de las 96 colonias es la que nos interesa. Por lo tanto en vez de
hacer 96 PCRs podemos hacer 20 por la estrategia de los pools.
Si hacemos pooles de unidades, decenas y centenas con sólo 30 PCRs analizamos
1000 individuos.
Con el screening de superpooler sabemos que la placa 7 es positiva, que sea
positiva quiere decir que al menos un clon de la 7 es positivo. La forma más
eficiente de identificar cuál de los 96 es el positivo

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Tenemos una placa positiva que contiene 96 individuos, en este caso 96 clones de
BAC, uno es positivo y queremos saber cuál de los 96 fue el que dio señal, cual es el
positivo
Una de las formas es coger los 96, extraemos los 96 ADN y hacemos una PCR en
una placa y 96 PCR para saber cuál es el positivo.
Otra estrategia mejor es la explicada anteriormente, hacer pooles de 8 y 12
simultáneamente

Chromosome walking
A partir de un clon que dé positivo, podemos identificar clones que contengan DNA
solapante de manera sucesiva.
El único inconveniente aquí es la redundancia. Si la genoteca tiene una redundancia de 10,
cuando hagamos un sreening no nos va a
salir un solo clon positivo nos van a salir
10 como media.
Elegimos el más grande, y del más grande
cogemos los extremos y como media cada
uno de esos extremos nos dará otras 10
señales positivas. Hay que elegir siempre
el más grande y el que más solape. De
esta forma se puede incluso tener un
genoma ordenado clon a clon, tenemos
un mapa físico.
Esto se hace normalmente cuando
tenemos un gen que nos interesa
contenido entre dos fragmentos conocidos. Esto se hace cuando queremos secuenciar un
genoma entero, lleva mucho tiempo por la redundancia.

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Experimento:
Si tenemos una planta que es resistente y la cruzamos con otra
que es susceptible, vemos las proporciones en la F1 y en la F2.
Vemos como hay un gen que confiere resistencia al patógeno
que es dominante, R. Podemos deducir a partir de los fenotipos
lo genotipos.
A partir de eso podemos mapear cualquier cosa. Dijimos que

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teníamos dos marcadores, cri1 y cri 2. Hay que extraer ADN de
alta calidad (ya que queremos hacer chromosome walking),
clonar en un vector adecuado (en este caso BAC) mediante
genotecas de BAC, y por la estrategia creamos mediante PCR si
los marcadores eran de PCR, por la estrategia de los pooles si los
marcadores eran de PCR, por la estrategia de los pooles seleccionamos los BACs positivos y
a partir de los extremos de estos se vuelve a clonar tantas veces como sea necesario hasta
que tengamos un BAC o un continuo de BACs que nos va a llevar de un marcador hasta
otro.

¿Cómo podemos demostrar si esto es verdad o mentira?

Si los marcadores están prácticamente en un BAC quiere decir que el gen tiene que estar
en algún lugar del BAC, el gran fragmento de DNA clonado en un BAC (el inserto de ese
BAC = cromosoma artificial de levaduras, plásmidos que permiten llevar insertos muy
grandes). Pero, ¿cómo sabemos que está en el BAC?
Podemos hacerlo con sondas o con silenciamiento pero serían procesos muy largos.
Tenemos el fragmento de DNA el cual tiene en algún sitio el gen, podemos cogerlo e
introducirlo en una planta haciendo una planta transgénica. Para hacerlo antes tendríamos
que haber hecho la genoteca de BACs del individuo que tiene el alelo dominante, y hay
que transformar con un BAC que contiene el gen a un individuo que es susceptible. Si el
BAC de verdad contiene el gen, hay que transformarlo de susceptible en resistente.
Desde el momento en el que le metemos un DNA extraño decimos que estamos haciendo
una transformación. Lo mismo sucedió con Griffith, que transformó cepas de lisas a
rugosas y de letales a no letales:

- Experimento de Griffith: El experimento de Griffith, llevado a cabo en 1928, fue

uno de los primeros experimentos que demostró que las bacterias eran capaces de
transferir información genética mediante un proceso llamado transformación.
En 1928, el microbiólogo Frederick Griffith, que investigaba varias cepas de
neumococo (Streptococcus pneumoniae), inyectó en ratones la cepa S y la cepa R
de la bacteria.
La cepa lisa (S) era dañina, mientras que la rugosa (R), no lo era ya que la cepa S se
cubre a sí misma con una cápsula de polisacárido que la protege del sistema
inmune del ser que ha sido infectado, resultando en la muerte de este, mientras
que la cepa R no contiene esa cápsula protectora es derrotada por el sistema
inmune.
Cuando, inactiva por calor, la cepa S era inyectada, no había secuelas y el ratón
vivía. Sorprendentemente, al combinar cepa R (no letal), con cepa S inactivada por
calor (no letal), el ratón murió. Además, Griffith encontró células de cepa S vivas.
En apariencia la cepa R se convirtió en cepa S. Este hallazgo no se pudo explicar,
hasta que en 1944 Avery, MacLeod, y McCarty, cultivaron cepa S y:
1. Produjeron extracto de lisado de células (extracto libre de células)
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2. Tras eliminar los lípidos, proteínas y polisacáridos, el estreptococo aún

conservó su capacidad de replicar su ADN e introducido en neumococo R.
La inactivación por calor de Griffith habría dejado intacto el ADN de los
cromosomas de las bacterias, que era el causante de la formación del gen S, y
podía ser liberado por las células destruidas e implantarse en cultivos sucesivos de
cepa R.
El promotor tiene que funcionar, tenemos el DNA de una planta que es resistente
de la misma especie que ha sido introducido por transgénesis.

¿Cómo sabemos que en el BAC está el gen de resistencia?

Cuando metemos el BAC en la planta que no es resistente, es solo para comprobar que el
BAC que hemos seleccionado es el que tiene el gen. La genética nos dice que hay un gen
de resistencia que mapea entre dos marcadores moleculares ligados a 1cM del gen. El gen
tiene que estar en algún lugar entre ambos marcadores, si molecularmente vamos desde

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un fragmento del cromosoma haciendo un continuo desde un sitio del cromosoma en el
que está un marcador hasta el otro marcador.
Lo más simple para saber si el gen está en algún sitio del BAC, es coger todo el inserto del
BAC (vector) e introducirlo en una planta. Si el inserto del BAC viene de una planta
resistente y tiene el alelo de la resistencia, hay que introducirlo en una planta susceptible y
transformarla en resistente. Entonces de esta forma estaremos seguros de que ahí estará
el gen, sin promotores. Con esto estaríamos haciendo una planta cisgénica, no
transgénica, se da cuando el DNA viene de la misma especie.
Hicimos la PCR de los marcadores, no del gen. Si tenemos 1cM, quiere decir que tenemos
1 cromosoma recombinante.

¿Cuántos genes hay ahí, entre los dos marcadores?

Si hay un gen tiene que transcribirse, para eso se hacen las genotecas. Tenemos que tener
todos los genes transcritos en un momento y en una condición dada. Debemos de partir
de una línea pura, podemos hacer infinitas genotecas de un individuo. Cuando una planta
se está muriendo cambia toda su expresión y volvemos a tener infinitas genotecas. Los
genes tienen memoria por epigenética.

Genotecas de cDNA
- Genes transcritos
- Momento y condición dada
- En un cDNA no hay información sobre las secuencias reguladoras, nos olvidamos
de los promotores solo vamos a tener las regiones transcritas
- Difícil obtener cDNA completos (full lenght). Hablamos de cDNA completo desde
que el promotor inicial la transcripción
 Elección del vector de clonación
 Extracción de ARN
 Síntesis de cDNA
 Adición de adaptadores específicos del vector
 Ligar
 Transformar hospedador

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Diagrama de un gen que se transcribe:

Las secuencias reguladoras no siempre
están en el promotor. Para tener un
mensajero maduro necesitamos una
zona CAP y una cola de poli A.
A una cierta distancia de CAP tiene que
haber un codón de inicio para la
traducción y un codón de stop.
Para clonar un fragmento de cDNA, lo primero tenemos que elegir un vector, en este caso
no puede ser BAC ya que son de gran tamaño. Las genotecas genómicas se pueden hacer
en BAC mientras que las de cDNA no.

Sondas
Una vez hecha la genoteca, para buscar los cDNA en nuestro experimento usaríamos como

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sonda el BAC.
- ADN genómico
- Genes heterólogos, genes de otra especie
- Oligonucleótidos deducidos de secuencias aminoacídicas
- Rastreos +/-: consisten en hacer una genoteca de BAC, luego someto las plantas a
una condición y a la condición contraria. En este caso
sería la condión + planta control y la condición –
plantas estresadas. Hibrido con cDNA de la condición
+ y de la condición -, con esto me quedo con los
genes que son específicos de una condición. Con la +
me darán señal aquellos genes que se expresen en la
planta sana, y con – los que se expresen en plantas
estresadas.

Genotecas: identificación de clones mediante el método tradicional

Para hacer un secreening, se coge la
genoteca en el vector que queramos, se
siembra una alícuota de la genoteca,
muchos clones. Estos clones se
transfieren a una membrana igual que la
de los southern, luego hay que hacer
marcas con una aguja.
Hay que desnaturalizar el DNA que se ha
quedado en la membrana ya que es de
cadena doble, hay que romper el
bacteriófago o la bacteria con cambios
de pH de la membrana, y luego fijar el
DNA de cadena sencilla. Estas
membranas se hibridan con una sonda
radiactiva. Sólo unos pocos clones dan señal positiva, hay que identificar aquellos
clones que den señal y luego localizar la colonia que dio la señal positiva.
Una alícuota en una genoteca pueden ser 20 placas por ejemplo, dependiendo
del vector en el que esté.

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Identificación de clones

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La mayoría de los screening se hacen hoy en día por PCR, si tenemos información del gen o
ya hemos sido capaces de diseñar algo del gen como oligos.

Identificación de clones por expresión

Un screening que es muy difícil pero
interesante consiste en que, lo que
tenemos en el clon clonado en el vector
es cDNA que tiene capacidad de
codificar proteínas. Hay un screening
basado en la expresión de la proteína
codificante, podemos hacer que el
plásmido transcriba al inserto y que el
ribosoma de la bacteria lo traduzca en
una proteína. Podemos hacer el
screening con el Anticuerpo de una
proteína, a esto se le llama genotecas de
expresión.
Mediante anticuerpos específicos podemos detectar proteínas.
Se pueden hacer con anticuerpos de conejos. La señal va creciendo en cadena con
anticuerpos secundarios y terciarios ya que tienen mayor número de epítopos. El
anticuerpo primario es el que se obtiene directamente de la proteína que uno quiere, para
obtener estos anticuerpos habría que pinchar la proteína a un animal que sea alérgico a la
misma. Si hemos hecho el anticuerpo primario en un conejo, el anticuerpo secundario son
anticuerpos específicos frente a anticuerpos de conejo. Son genéricos y mucho más
baratos.

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Hibridación +/-
Consiste en un screening en el cual se coge todo el cDNA de una condición (normalmente
el + es el que está en una condición problema). Hay que comparar los dos patrones y luego
buscar señales que estén en estrés y señales que estén en control.
Esto nos indica que son genes que inhiben su transcripción, se degradan rápido en
condiciones de estrés.

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Síntesis de cDNA

Cuesta mucho trabajo obtener cDNA completos, ya que en la síntesis de cDNA estamos
siempre limitados por el primer enzima, la transcriptasa inversa. No son enzimas muy
progresivas, hay que poner una gran cantidad de nucleótidos para que sintetice. Lo normal
es cebar con oligo dt, este se va a pegar a la cola de poli A y va a comenzar la síntesis de
cDNA por rivers. Esto quiere decir que en todos los productos de esta síntesis la región 3’
no codificante siempre va a estar presente.
Luego la transcriptasa inversa, la polimerasa de cadena sencilla, es relativamente poco
procesiva. Cuando nos encontramos con una estructura secundaria en el RNA, cosa que es
muy común, se intenta desnaturalizar el RNA antes de empezar la síntesis por calor.
Tenemos muchas secuencias cortas.
Lo que esperamos de un mensajero es que desde el extremo 5’ tiene que tener la
secuencia 5’ leader, el AUG (codón de inicio de la traducción), el marco y un codón de
stop. Esto es lo que hace a un mensajero maduro.
Necesitamos un extremo 3’ libre.
Hexanucleótido de secuencia aleatoria (NNNNNN). A la máquina que sintetiza DNA le
decimos que sintetice una N, es decir, cualquier nucleótido, por lo que la máquina le añade
los 4 polímeros y sintetiza uno u otro. La síntesis que se hace dentro de un tubo es
múltiple, con lo cual al final vamos a tener una población de oligonucleótidos, cada uno
con una secuencia aleatoria (vamos a tener en un tubo todas las secuencias posibles,
tenemos todas las combinaciones de N). Esto se representa también como G-mer.
Si queremos clonar en un vector que hemos desfosforilado la única forma de que se clone
es desfosfatándolo.
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Aun empezando en distintos sitios es difícil llegar hasta el final ya que la transcriptasa
inversa se para. Siempre perdemos el extremo 3’ no codificante. Se pegan cuando
encuentran su complementario.
En una célula tenemos muchos mensajeros, si consideramos los transcritos alternativos el
número aumenta mucho.
Un humano tiene alrededor de 30.000 genes. Un gran debate es: si un gen tiene varios
exones y en el ARNm, en ocasiones entran algunos exones y en ocasiones otros, como
tenemos distintas funciones, distintas proteínas ¿decimos que son genes distintos o que
son el mismo gen?

¿En una célula humana se expresan siempre todos los genes?

No, ya que si todos los genes se estuvieran expresando simultáneamente no podría ser
unicelular. La pluricelularidad conlleva a especialización, hay genes que se expresan
directamente.

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¿Por qué algunos podemos beber leche con lactosa y otros no?
El gen de la lactasa que en la mayoría de los mamíferos se expresa solo en el estado
infantil, en determinados individuos de nuestra especie se expresa durante toda nuestra
vida. Esto es porque tenemos una mutación en el promotor de la lactasa que hace que ese
gen se siga transcribiendo, y podamos seguir bebiendo leche con lactosa.
Sabemos dónde está el gen de la resistencia a la lactasa, lo que no sabemos es donde está
el segundo gen. Cuando la mutación aparece en una población es persistente.

Identificación de cDNA completos

- 5’ RACE (amplificación rápida de los extremos de
cDNA). ES el más demandado
Hay dos formas de hacerlo, la primera que se
describió implica la TdT. Se coge el RNA y se pone
la enzima TdT, lo que se hace con esta enzima es
poner un solo nucleótido (normalmente suele ser
CTP). Tenemos siempre un extremo C en nuestro
caso. La transferasa terminal añade un nucleótido
en el extremo 5’ sin molde. Severo Ochoa
descubrió las TdT, una enzima capaz de sintetizar
ácidos nucleicos sin molde.
El modelo T4 RNA ligasa, tiene un adaptador sintético ligado en el extremo 5’. Se
hace una PCR con un cebador del adaptador. Va a tener especificidad, ya que se le
va a poder poner una secuencia única. En ocasiones, cuando no se está muy seguro
de que el producto de PCR sea bueno se va a hacer PCR anidada.
Tenemos un cebador que esté más dentro, y otro aún más dentro. Por lo tanto
vamos a añadir especificidad por si acaso alguno de los productos fuese
inespecífico.

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- 3’ RACE. Si hemos primado con oligo dt, siempre lo vamos a tener.

- Oligo-cappingo Cap-trapper para seleccionar cDNAs de longitud completa. Una
ARN polimerasa no lleva CAP. Los mensajeros más abundantes son los
ribosomales.

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Haciendo una construcción genética, que empieza en AUG, tiene también el CAP y
una secuencia leader que puede ser la del gen u otra. Un RNAm se transcribe, se
traduce y se degrada. Se degradará antes o después dependiendo de los leaders y
de los non-code.

El CAP es una estructura de una guanina cíclica, guanina de la forma trifosfato que
se une en la posición invertida. Las metilaciones que se unen en los CAPs son
importantes.
Cuando queremos hacer un RNAm in vitro en el laboratorio, si sintetizamos RNA no
lleva el CAP, hay que añadirlo si queremos que luego se traduzca. Para que se dé
traducción tenemos que tener: CAP, leader, 3’ non-coding y poli A. Si no no se da
un mensajero.

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En un experimento se identificó la enzima pirofosfatasa ácida, que corta grupos

pirofosfatos. En un RNAm hay pirofosfatos en el CAP, si hay un RNAm que esté
truncado esta enzima le va a quitar los grupos fosfatos luego se va a añadir T4 RNA
ligasa y se ligará con un adaptador sintético, el cual se va a pegar única y
exclusivamente a los RNA que tuviesen CAP. En un RNAm solo hay pirofosfatos en
CAP. (CIP fosfatasa del intestino del cordero).
Hemos hecho una genoteca normal, mediante el método de los NNNNNN, lo
metemos en un vector y queremos que se exprese la proteína que buscamos
(cDNA sintetizado que van a terminar en cualquier sitio) por lo que se expresa el
RNA, esperamos que se traduzca y luego queremos buscar con un Ac la proteína.

¿Todos los clones que contienen el ARN que yo quiero van a expresar la proteína?
No. Solo un 1/3 de los que tengo con el inserto de interés si los hemos clonado en
dirigido. Solo los que estén en el marco que establezco se van a traducir a

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
proteínas. Solo se clonan aquellos que estén en el sentido correcto. Si lo hemos
clonado en cualquier dirección 1/6.
En una E.coli se puede dar el problema del uso de codón? Podría darse, pero
cuando ponemos un vector de tipo plásmido tenemos un montón de RNAm y
siempre se traducen.
- ARNseq

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