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Apuntes temario completo

2º Ingeniería Genética

Grado en Biotecnología

Facultad de Ciencias Experimentales

UAL - Universidad de Almería

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su
totalidad.
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Ingeniería Genética Tema 10

TEMA 10: Ingeniería de

proteínas
EXPRESIÓN Y PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS:
Bacterias, levaduras y hongos filamentosos son organismos muy utilizados en este
ámbito, aunque también podemos utilizar algas unicelulares y células de mamíferos.
Uno de los objetivos de la producción de proteínas es obtener fármacos para la curación
de enfermedades humanas. Muchas proteínas humanas no pueden ser obtenidas en

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
bacterias, y por ello tenemos un amplio rango de organismos para la producción de
proteínas. Si no funciona en bacterias, se pasa al siguiente nivel: las levaduras, y así
hasta llegar a las células de mamíferos (en caso de no haber podido conseguir la
proteína en otro organismo más simple).

SISTEMAS DE EXPRESIÓN Y PRODUCCIÓN EN BACTERIAS:

Sistemas de producción en E.coli.
Todas las manipulaciones
en E.coli se realizan en
plásmidos.
En estos plásmidos de
expresión es muy
importante el origen de
replicación: dependiendo
de cuál escojamos,
obtendremos más o menos
copias del gen que codifica
para nuestra proteína. Esto
es muy importante, ya que,
en general, para la producción de proteínas en E.coli debemos escoger plásmidos que
produzcan un número pequeño de copias (2-12 copias), de modo que no supongan una
lastre genético para la bacteria (p.ej., los pUC, que pueden generar hasta 500 copias, no
son muy utilizados por esta razón).
También es importante en estos plásmidos el marcador selectivo. Hay diversos
marcadores, aunque generalmente se utilizan genes de resistencia a antibióticos.
En cuanto al sitio de clonaje (MCS:

- Debe haber un promotor el cual

debe ser muy específico, de modo
que permita el máximo control de
la expresión de la proteína (que
solo se transcriba y traduzca en el
momento que a uno le interese).

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Los promotores Lac son muy utilizados.

- En caso de no disponer de un anticuerpo específico para detectar la proteína,
debemos introducir en esa construcción una etiqueta (una secuencia específica
que se va traducir junto a la proteína y que nos permitirá identificarla). Las
etiquetas más utilizadas se clasifican en dos tipos, de acuerdo a su tamaño:
➢ Péptidos: muy pequeñas (entre 5-15 aminoácidos). Son muy simples y
algunas de ellas, diseñadas en el laboratorio, no existen en la naturaleza.
Son muy específicas, y se diseñan de modo que tengan afinidad por
alguna sustancia o medio, de modo que nos permita detectarlas. Por otro
lado, se disponen condiciones muy específicas para la unión y liberación
de esa etiqueta de su ligando.
➢ Proteínas: la GST (glutatión S transferasa) es muy utilizada debido a que
es fácilmente seleccionable. Algunas de ellas se utilizan, no porque
tengamos condiciones para unirlas, sino porque aumentan la solubilidad

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de la proteína que queremos expresar en E.coli (es importante que la
proteína sea soluble).
- Esa etiqueta debe poder ser eliminada a voluntad, por lo que hay que añadirle
una diana de proteasa. En general se utilizan proteasas específicas que no
requieren condiciones desnaturalizantes (trombina, enteroquinasa…), es decir,
que pueden actuar sobre la proteína nativa (esto es importante para que la
proteína de interés no pierda su función biológica). Por otro lado, estas proteasas
deben ser fáciles de eliminar después de usarlas (fáciles de purificar).
En la foto se presenta una
batería de plásmidos que
contienen todos los
elementos descritos
anteriormente. Los tres
plásmidos se diferencian
entre sí en el marco de
lectura en el que se
encuentra la diana de
EcoRI.
Es necesario que la
etiqueta y la proteína se
encuentren en el mismo
marco de lectura para
que se produzca la
traducción de la proteína
de interés. Por tanto, es
necesario que la
secuencia que codifica
para la proteína se ligue
en el vector debe estar en
el marco correcto.
Podríamos pensar en acoplar siempre una diana de EcoRI a la secuencia nucleotídica de
nuestra proteína, de modo que no tuviéramos problema al elegir el vector (siempre sería
el 1). Pero, en el caso de que nuestro cDNA tuviera una diana de EcoRI, esto ya no sería
factible pues digeriríamos nuestro inserto. Debemos elegir dos enzimas diferentes

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Ingeniería Genética Tema 10

(clonación dirigida) que no corten a nuestro inserto (en el caso de que las dos dianas
sean iguales, se estaría realizando una clonación no dirigida y se obtendrían transcritos
en ambos sentidos). Cuando hacemos una clonación dirigida solo obtenemos transcritos
en un sentido.
Si observamos los plásmidos, en caso de digerir con BamHI, la proteína obtenida tras la
actuación de la trombina (proteasa), solo tendrá dos aminoácidos de más respecto a la
proteína de interés, por lo que es la mejor diana. En caso de que nuestro inserto
contenga dianas BamHI, ya no se puede utilizar.
Pregunta: Se quiere introducir un inserto en uno de esos plásmidos, pero tiene
todas las dianas de restricción, ¿qué soluciones hay? Como el código genético está
degenerado, se pueden generar mutaciones silenciosas (cambiar un codón por otro, pero
de forma que el resultado final sea el mismo aminoácido) para eliminar dianas. Habrá
que asegurarse que esto no afecta a la proteína producida (de que no se producen

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cambios en los aminoácidos).

Producción de proteínas en E.coli.

No todas las cepas de E.coli están recomendadas para la producción de proteínas. La
cepa más utilizada es BL21 (y sus derivadas) por dos razones:
- Carece de una proteasa que degrada proteínas exógenas.
- Carece de una proteasa de membrana externa, la cual podría degradar la proteína
tras la lisis celular (para la purificación de la proteína).
Sin embargo, tiene un inconveniente: posee nucleasas, lo que hace que la purificación
de los plásmidos sea muy complicada.

SISTEMAS DE EXPRESIÓN EN CÉLULAS EUCARIOTAS:

Sistemas de expresión y producción en levaduras.
Saccharomyces cerevisiae es el
hospedador más utilizado (la insulina
humana, p.ej, se produce en este
organismo, ya que en E.coli no es
eficiente). También hay otros hongos,
aunque todas las especies tienen
ventajas e inconvenientes.
El vector de la imagen es un esquema
de los plásmidos que se suelen utilizar
(se introducen en E.coli para las
manipulaciones genéticas). Este
contiene: casetes de expresión
(promotores específicos de la especie
que vamos a utilizar), marcador
selectivo (síntesis de aminoácidos o de uracilo), región rDNA (secuencia que permite
la integración del plásmido en el genoma de la levadura) y ARS (“secuencia de
replicación autónoma”).

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Sistemas de expresión y producción en mamíferos.

Si la expresión no funciona en levaduras, pasamos al siguiente grupo de hospedadores:
mamíferos. En realidad lo que se utilizan son las células de los mamíferos: un cultivo en
monocapa en placa Petri. Los sistemas más utilizados son los ovarios del hámster chino.
También se utilizan células tumorales (inmortales) como las de mieloma de ratón. Al
igual que en el caso de las levaduras, cada sistema tiene ventajas e inconvenientes.

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El esquema del plásmido
típico utilizado lo vemos
en la imagen. Como se
busca expresión en
mamíferos, necesitamos
un promotor específico
de estos. Por si acaso la
proteína que
introducimos es letal para
la bacteria, se introduce
un “seguro”: la secuencia
de un intrón, ya que este
no podrá ser procesado
por la bacteria
(recordemos que antes de
introducir el plásmido en
el hospedador, las manipulaciones hay que realizarlas en una bacteria).
Necesitamos añadir también terminadores específicos, que añadan colas de poli-A, y un
marcador selectivo.

MUTAGÉNESIS:
La mutagénesis in vitro se realiza para conseguir diferentes objetivos:

- Definir los dominios funcionales de una proteína. En un sentido estricto,

decimos que un dominio es la secuencia primaria de una proteína que se pliega
de forma autónoma y que mantiene su función de forma independiente al resto
de la proteína. El concepto de dominio también se refiere a los aminoácidos
esenciales para la función de la proteína.
- Incrementar la funcionalidad de la proteína.
- Otros.
Podemos generar mutaciones de dos formas:

➢ Al azar.
Tenemos un gen que codifica para una proteína. Una vez clonado el gen en un vector,
cuando tenemos interés en conocer su función y sus dominios funcionales o queremos
incrementar su funcionalidad, se hacen una serie de experimentos de mutagénesis
aleatoria.

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Hay muchas formas de hacerlo, pero lo más normal es hacer una PCR con una
polimerasa con una tendencia al error alta (error-prone PCR). La Taq polimerasa tiene
un cierto margen de error; para incrementar esta tasa, se pueden hacer varias cosas:

- Se disminuye el magnesio y se aumenta el manganeso (este elemento induce a la

polimerasa a cometer un mayor número de errores).
- Se utilizan distintas proporciones de dNTPs.
- Utilización de etimetanosulfonato (sustancia química muy mutagénica y tóxica).
- Utilización de dITPs (nucleótido comodín): nucleótidos de inosina. Tiene la
ventaja de que puede aparearse con cualquiera de los 4 nucleótidos.

➢ Dirigidas.
Deleciones por PCR inversa:

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en la PCR inversa se utilizan
cebadores que, en lugar de estar
enfrentados (mirándose, como
en una PCR normal) tienen
sentido opuesto. Esto quiere
decir que solo habrá
amplificación exponencial si el
molde es circular, es decir, si se
trata de un plásmido.
Los cebadores se diseñan de modo que una secuencia en concreto quede sin replicar, de
modo que no se amplifica. Cuando los plásmidos obtenidos en el proceso se liguen
finalmente, estos no contendrán ese fragmento. Es necesario utilizar una polimerasa sin
actividad transferasa terminal (que no añada nucleótidos), pues necesitamos un producto
con extremos romos para poder ligarlo. Además, la polimerasa tiene que tener una baja
tasa de error.
Antes de ligar hay que eliminar el molde (el plásmido con el fragmento que queremos
eliminar). Si no eliminamos el molde, y ligamos y transformamos directamente, se
trasforma tanto el molde como el producto de PCR inversa. Por otro lado, los plásmidos
tienen un gran problema: están superenrollados (forma “supercoiled”), lo que les da una
capacidad de transformación enorme. Los plásmidos supercoiled contaminan mucho. El
producto de PCR, al ser sintético, no estará en esta forma (será simplemente un
plásmido covalentemente cerrado), pero el molde si lo estará. ¿Cómo eliminamos el
molde? El plásmido natural de la bacteria (el molde que hemos usado) está metilado,
por lo que tenemos que utilizar la enzima DpnI, capaz de reconocer y digerir el ADN
metilado.
Inserciones por PCR inversa:
método inverso al anterior. Se
diseñan cebadores a los que se les
añaden colas de oligonucleótidos
(secuencia de interés). Los
productos de la amplificación serán
plásmidos a los que se les ha
insertado esa secuencia que se ha
diseñado.

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Las condiciones son las mismas: se lleva a cabo una PCR inversa con una enzima sin
actividad transferasa terminal y una baja tasa de error. Se elimina el molde, se ligan los
productos y se transforman.
Hay otra forma de hacerlo: introducir la secuencia solo en uno de los cebadores.
Mutaciones por PCR inversa: se
diseñan oligos con nucleótidos
mutantes en 5’. Si se colocan en 3’,
seguramente la polimerasa no lo
utilizará de cebador. Los productos
obtenidos contendrán esas
mutaciones. Para comprobarlo y
asegurarnos de que realmente
contienen esas mutaciones, antes de

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
transformarlo hay que secuenciarlo.
Intercambio de dominios: tenemos en el genoma dos genes homólogos. Podemos
fusionar dominios de las proteínas codificadas por estos genes. Existen varias formas de
hacerlo, pero una técnica fácil es la siguiente: realizar una PCR específica con un
cebador con una cola específica de la otra secuencia (se diseñan entonces dos cebadores,
uno para cada proteína). Los productos de la reacción tienen ciertas secuencias
solapantes.

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