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Como obtener un clon de un gen

específico

Cómo obtener un clon de un gen específico

Una librería genómica es una colección de clones

en un número suficiente como para contener,
muy probablemente, cada gen presente en un
organismo en particular.
Las librerías genómicas son preparadas
purificando el DNA total y haciendo digestiones
parciales con enzimas de restricción, resultando
en fragmentos que pueden ser clonados en un
vector, usualmente un fago λ de reemplazo, un
cósmido o un yeast artificial chromosome (YAC),
bacterial artificial chromosome (BAC) o vector P1

No se usan plasmidos porque los fragmentos que queremos clonar

son grandes. Se usan vectores que permiten alojar fragmentos
más grandes

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Digestión parcial de un fragmento de DNA con una endonucleasa de restricción de tipo II. Las digestiones parciales son
realizadas usualmente variando ya sea el tiempo o la cantidad de enzima usada para la digestión. En algunas de las
moléculas de DNA la enzima ha cortado en todos los sitios (marcados como RE1). En otras moléculas ha ocurrido un
menor número de rupturas. El resultado deseado es una muestra con moléculas de DNA de todas las longitudes
posibles.

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Producción de fragmentos de restricción que se solapan

mediante digestión parcial de DNA genómico con Sau3A.
El uso de estos fragmentos superpuestos aumenta la probabilidad de que
todas las secuencias en el DNA genómico estarán representadas en una
biblioteca.
Se usan condiciones no optimas de la enzima de restricción.
en un gel se ve como un chorreado donde no se distinguen bandas

si la digestion es total se ven fragmentos definidos (bandas definidas)

Construcción de una biblioteca

genómica usando un vector lambda
de sustitución y digestión parcial con
EcoRI

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Construcción de una biblioteca

genómica usando un vector lambda
de sustitución y digestión parcial con
Sau3A se observan placas de lisis

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Screening library en fago l

Library de
expresion

Screening

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Librería genómica de
fago lambda
plaqueadas en placas
petri

Cada clone ocupa un

lugar específico en
una placa

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idem anterior. importante desnaturalizar el DNA en el filtro

Una biblioteca de ADN es esencialmente una representación de

todo el conjunto de ADN (ya sea genómico
o complementario a los ARN).
Una biblioteca de ADN genómico se puede definir como la
representación de todo el ADN genómico de un
organismo, incluyendo regiones codificantes y no codificantes por
igual.
La biblioteca de ADNc, por otro lado, se construye mediante la
transcripción inversa
(retrotranscripción) de los ARNm, y por lo tanto solo representa
las regiones codificantes de
proteínas (CDS) del genoma.
Por lo tanto, las dos bibliotecas se utilizan para diferentes
propósitos que se describirán en
detalle. Según el tipo de biblioteca, varía
(a) la fuente de ADN,
(b) el tipo de vector utilizado,
(c) las metodologías experimentales

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• El principio básico de todas las bibliotecas

de ADN implica:
• • Preparación de fragmentos de ADN
representativos; digestiones parciales
• • Preparación del vector apropiado; depende del tamaño del fragmento a clonar
• • Clonado y transformación; Si es fago se infecta, si es cósmido se transforma.
• • Selección y screening.

¿Qué es una librería o genoteca?

•Genoteca genómica – moléculas de vector
que contienen
insertos de DNA genómico
•Genoteca de cDNA – moléculas de vector
que contiene
insertos de cDNA
Recuerda: RNA cDNA (específico de tejido)
¿Por qué necesitamos una genoteca?
Encontrar lo que buscamos es como buscar
una aguja
(gen) en un pajar (genoma/mRNA)

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La pregunta es cual plásmido contiene nuestro gen de interés y como lo aislamos de la

genoteca?

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Obtener biblioteca de cDNA eucariota

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• ¿Qué podemos usar como sonda?

• Normalmente:
• Un oligonucleótido Una cadena corta de ácidos
nucleicos
(sintetizada por nosotros) que hibrida
con nuestro DNA objetivo
• Una sonda de cDNA Un trozo de DNA mayor
• Un anticuerpo El vector debe producir la
expresión de
proteínas!

si se tiene colonias
(cosmido)

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Marcado de sonda
Se usa un nucleótido que tiene un P 32 radioactivo. Se usa el nucleótidoradioactivo para
usarlo. Se lo compra. O se lo sintetiza con la polinucleótido kinasa.
Síntesis del oligo usando este nucleótido radioactivo. Generalmente se eligen sondas que
tengan alto contenido de GC, se usa generalmente una guanina radioactiva en vez
de una guanina fría.

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Usamos el código genético para designar oligonucleótidos para el

cribado

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Sondas de oligonucleotidos para genes

cuyo productos han sido
caracterizados

Al sintetizar todo el conjunto de sondas diferenetes se

marcan con la misma forma (ej: se sintetiza con guanina radioactiva)
Todas las sondas tienen radioactividad.
así marco y aislo el gen de mi proteína y lo mando a secuenciar.

Se hacen sondas degeneradas.

Obtengo una mezcla de oligos marcados, y uno de ellos será el que se pega en el gen. Es una combinatoria muy grande

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Se da un RNA consenso

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• Cribado usando secuencias similares

• Si un tejido está enriquecido en un mRNA
determinado, éste se puede usar como sonda
p.e. secuencias de genes de globina
• a veces es más fácil aislar una secuencia de un
organismo que de otro, y este gen relacionado se
puede usar para pescar el mismo gen de otro
genoma
• – p.e. secuencias de genes de actina

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Sondas de especies emparentadas

Sondas heterologas

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Detección del producto de la expresión del gen

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• Ejemplo:
• Estamos interesado una proteína (P450) que metaboliza
drogas anti-HIV
• Hemos purificado una proteína de 50kDa y reconstituimos una
actividad que metaboliza la droga (estamos bastante seguros
que hemos purificado la proteína correcta)
• Secuenciamos los aminoácidos del amino N
• La secuencia que obtenemos es:
MALIPDLAM????. ilegible….
• Queremos saber la secuencia de aminoácidos completa y tener
el clon para manipularlo

• No secuenciamos proteínas para tener su secuencia de aas

completa: técnicamente difícil
• Deducimos la secuencia de aas a patir de su secuencia de cDNA
• Necesitamos clonar el cDNA para el enzima P450
• ¿Qué hacemos?
• 1. Hacemos una genoteca de cDNA de un tejido que exprese
altos niveles de la proteína (si cantidad de proteína es alta, es
• lógico que cantidad de mRNA sea alta y por tanto
enriquecemos el cDNA)
• 2. Cribamos la genoteca con una sonda: - ¿oligonucleotido?
- ¿anticuerpo?

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• La lógica de cribar una genoteca

• El cribado es un compromiso entre:
• El tamaño del genoma. A genomas más
grandes mayor número de colonias hay que
cribar
• Tamaño del inserto A medida que el tamaño
del inserto es mayor, menor número de
colonias que cribar

recombinantes: colonias, placas de lisis, etc

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dónde enntra el tamaño del genoma en el cálculo?????????

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