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Apuntes temario completo

2º Ingeniería Genética

Grado en Biotecnología

Facultad de Ciencias Experimentales

UAL - Universidad de Almería

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su
totalidad.
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Ingeniería Genética Tema 11

TEMA 11: Análisis de interacciones

entre proteínas y DNA-Proteína
PHAGE DISPLAY:
Trata de hacer construcciones
génicas, mediante una proteína no
esencial de la cápsida del fago se
fusiona con la proteína que nos
interesa, de manera que se muestra

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
en él.
Ejemplo: En una proteína no
esencial de la cápsida del fago M13
como puede ser su parte
glicoproteína se realiza una fusión
de la proteína que nos interesa.
Es una técnica que se está quedando
obsoleta, es más sencillo secuenciar.
Se trata de una técnica que consiste
en la expresión de proteínas en la
cápsida de bacteriófagos.
Se utiliza cuando se dispone de
anticuerpos para la selección de
clones que expresen la proteína de
interés.

Un plásmido que contiene el ADN

que codifica la proteína de interés es
transformado y expresado en E. coli. Una vez realizada la construcción esta es infectada
con un fago defectivo denominado Helper Phage que la incorpora a su genoma y se
expresa en la cubierta la proteína fusionada, es decir, las proteínas que le faltan al fago
defectivo le serán suministradas por el plásmido de forma que ambos se integren y
expresen (únicamente aquellos bacteriófagos que sean capaces de expresar el plásmido
en su genoma van a ser bacteriófagos a recuperar).
Si estamos expresando una determinada proteína debemos tener la herramienta necesaria
para reconocerla, como podrá ser un anticuerpo. El anticuerpo será inmovilizado y ''le
serán presentados'' los distintos bacteriófagos, de los cuales la mayoría no se unirán a él
excepto el que exprese la proteína de interés que se unirá con mayor o menor facilidad
(ya que la unión antígeno-anticuerpo es muy específica). Sin embargo, existen
anticuerpos policlonales con la capacidad de unirse a distintos epítopos, por lo que puede
haber proteínas que den lugar a una reacción cruzada, es decir, pueden existir proteínas
parecidas capaces de unirse al anticuerpo parcialmente. Para evitarlo, repitiendo ciclos de
lavado y amplificación al final obtendremos bacteriófagos que van a tener en su cubierta
la proteína que nos interese. Podrá obtenerse puro un clon que esté expresando dicha
proteína.
Esta técnica es utilizada cuándo se dispone de anticuerpos para la selección de clones que
expresen la proteína de interés, si se tiene un anticuerpo que reconoce una proteína de

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Ingeniería Genética Tema 11

interés específica de la respuesta de una planta al patógeno X, con el anticuerpo

correspondiente podremos saber el gen que la codifica. Actualmente esta técnica ha sido
sustituida por la secuenciación de proteínas.

El factor de transcripción Gal4

Es un factor de transcripción del tipo dedos de zinc
(Zn2Cys6), presenta enlaces entre cisteínas que unen
como cofactor necesario una molécula de zinc en el
centro, formando una protuberancia en la proteína de
forma que reconoce a una secuencia concreta del ADN
uniéndolo como homodímero y activando la
transcripción.
Tiene dos dominios funcionales: DU (DB), de unión al
ADN, y DA (AD), de activación de la transcripción.

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Ambos dominios son intercambiables, es decir, puede
eliminarse el dominio de unión y fusionarse otro de
activación y viceversa.
INTERACCIÓN DE PROTEÍNAS: SISTEMA DE DOBLE
HÍBRIDO:
El sistema “two-hybrid” o de la levadura con dos quimeras
Se demostró que el zinc es una molécila
esencial en la dieta, si a una levadura se
le suprime el zinc no puede sobrevivir ya
que lo utilizan, entre otras cuestiones,
los factores de transcripción.
Se trata de una levadura a la que se
añaden dos construcciones, dos genes
“reportadores” (His3 y LacZ)
controlados por la secuencia de unión de Gal4, si tienen una proteína Gal4 funcional,
crecerá en un medio sin histidina (en el caso de que sea defectiva para el gen de histidina)
y mostrará color azul en presencia de X-Gal (5-bromo-4-choro-3-indolil-β-D-
galactopiranósido).
Gal4 se une al ADN aguas arriba del inicio de transcripción en el plásmido para los genes
que nos interesan, de forma que una levadura con los plásmidos de histidina, lacZ y gal4
podrá crecer en un medio sin histidina y además será de color azul. En dominio de anclaje
se une al ADN y el de activación de la transcripción se une al complejo de replicación.
Al tener gal4 dos dominios se fusiona la proteína anzuelo (actúa como anzuelo, queremos
ver con cual interactúa) a uno de los dominios y la proteína de activación al otro dominio.
Ahora para que se active la transcripción se necesita que se unan los dos dominios de
forma que los fragmentos de gal4 queden cerca activando así la transcripción de la
proteína que nos interesa. A todo este proceso se le denomina two-hybrid. De esta forma
sabemos cómo interactúan las proteínas, o más bien con que otras proteínas interaccionan
entre sí.
Se hacen dos tipos de construcciones, dos quimeras:
- En una el dominio de unión (DU) al ADN de Gal4 se fusiona a la proteína en la
que estamos interesados (que actúa de anzuelo)
- En la otra construcción se fusiona el dominio de activación de la transcripción de
Gal4 (DA) y la proteína que queremos saber si interacciona con la nuestra.

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Aunque sean fusiones proteicas, se realizan con los ácidos nucleicos, que controla la
síntesis de estas proteínas. Hay que tener en cuenta el marco de lectura de éstos en su
transcripción a proteínas.
Los plásmidos anteriores destacan para realizar esta técnica. Contienen diversos
componentes: un gen de resistencia a la kanamicina o a la ampicilina y un origen de
replicación pUC para poder hacer las convenientes manipulaciones en E. coli tras las
cuales podrá transformarse en las levaduras; un origen de replicación 2μ de levaduras
para que una vez que el plásmido entre en la levadura pueda replicarse; un dominio de
selección que le permite al plásmido pGBKT7 crecer en un medio sin triptófano y a
pGADT7 en un medio sin leucina; un promotor de alcohol deshidrogenasa; un dominio
de unión al ADN de Gal4; y un múltiple cloning side (polylinker) donde clonamos nuestra
construcción.
Nuestra proteína deberá ser fusionada en el marco de lectura correcto para que dicha
proteína quimera sea la única sintetizada, por si acaso siempre se introducen epítopos
como polihistidina o Myc para poder seleccionar la proteína quimera y purificarla. Todos
los cebadores presentes son para poder secuenciar la construcción y estar seguros de que
el marco de lectura ha sido el correcto.
Si una levadura tiene todo eso: las dos quimeras y el pescadito muerde el anzuelo se
recompone la función de Gal 4, el dominio de unión y de activación están físicamente
cerca y son capaces de activar la transcripción de la enzima. Si la proteína casa no tiene
actividad no se recompone la actividad del factor de transcripción, esa levadura no es
capaz de crecer en un medio sin histidina y si crece no se pondrá de color azul.

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Ingeniería Genética Tema 11

Tú quieres ver que proteínas interactúan, unas hacen de anzuelo y las otras de pez o casa.

Tenemos un gen que controla un

fenotipo en este caso convierte a
los sépalos de tomate en carpelos.
¿Cómo ha conseguido transformar
a una célula que iba a ser un sépalo

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en un carpelo? ¿Con qué genes
interactúa para producir ese
fenotipo? Ese gen (proteína) lo
ponemos de anzuelo y todos los
genes que se expresen en el sépalo
se fusionan en el otro plásmido,
solo aquellas proteínas que
interactúan dejarán que la
levadura crezca. Necesitamos todos los cDNA del tejido con el que quieres que interactúe.
Se usa como sistema chivato para ver que dos proteínas interactúan.

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Ingeniería Genética Tema 11

En muchas ocasiones forman multímeros, enzimas que actúan en la misma ruta se unen
físicamente. Se produce una cadena, el sustrato coge a una enzima el producto de esta a
la siguiente enzima y así sucesivamente, lo cual es mucho más eficiente energéticamente.
Utilizar un factor de transcripción y todo lo que sabemos de él, para utilizarlo como
sistema chivato de las proteínas que interactúan.

Comprobación por coinmunoprecipitación:

Esto es un ejemplo real en placa de Petri: solo vemos, solo existen dos proteínas que
interactúan y se pueden observar en color azul. El resto no interactúan. (fotografía
izquierda).

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(Fotografía derecha) Queremos saber con qué proteína interactúa la proteína que nosotros
hemos clonado: para ello cogemos todos los cDNA y los clonamos y contraformamos con
levaduras. Si las levaduras salen azules es que se ha unido.
Tras esto se coinmunoprecipita para comprobar
finalmente si interactúan o no ya que si se altera con el
anticuerpo una proteína la otras también sufrirán el
mismo cambio. Se extraen las levaduras y con un
anticuerpo específico de la primera proteína tiras para
abajo y miras que cosas se vienen con ella.
Coinmunoprecipitas la proteína casa, pescado pequeño y
grande y observamos que solo interactúan los dos
pescados.
Lumier es el proyecto más importante que se ha realizado con esto y está basado en la
proteína luciferasa, desprende luz en la interacción en vez de ser de color azul. La ventaja
que tiene es que se pueden medir la cantidad de fotones siendo una medición cualitativa
y cuantitativa.

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SISTEMA DE UN HÍBRIDO:
El sistema “one-hybrid”
Están basados en una proteína o en el
ADN. Tenemos un promotor y lo fusiono.
Queremos saber que proteínas se unen al
promotor. El dominio de unión y si
interactúa será de color azul.
Tengo un factor de transcripción que no se
a qué lugar del promotor se une, pues le
pongo todo el promotor y uso Gal4, activa
la transcripción. Vamos reduciendo el

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promotor hasta saber en qué sitio exacto
se une el factor.
Por otro lado, tengo el promotor de un gen no sé qué factor de transcripción se le une pues
uso el cDNA y veo que células se le unen.

SISTEMA DE TRIPLE HÍBRIDO “TRIPLE-HYBRID”:

Conceptualmente podría ser una proteína que se coma el anzuelo y otra que se coma a la
que se come el anzuelo pero que no se coma el anzuelo. Pero no solo pueden ser proteínas,
si fusionamos el anzuelo con una proteína que une un metabolito podemos saber que otras
proteínas unen a ese mismo metabolito. Por lo tanto, un triple híbrido sería proteína-
anzuelo-metabolito y otras. Tenemos que postular hipótesis y comprobarlas
conceptualmente. Por ejemplo, podríamos buscar un fármaco que impida esa unión.
Incluso se podrían hacer cuádruples híbridos.

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INTERACCIÓN DNA-PROTEÍNA:
“Gel shift” y “supershift”:
Electroforesis en acrilamida no desnaturalizante, para ver cadenas dobles. Tenemos un
fragmento de ácido nucleico que puede ser de ADN o ARN, lo más sencillo es ADN
marcado normalmente en los extremos con fosfato. Lo vamos a separar por tamaño en la
electroforesis. Si antes se queda unido ese ácido nucleico con una proteína, lo retrasa en
el gel. Retrasa su movimiento porque ese complejo es mucho más grande (movilidad del
ácido nucleico junto con la de la proteína que se une específicamente). Eso es un shift.
Lo que ocurre en el gel es el blanco y lo que vemos es el azul.
El supershift es otra proteína que interactúa con la primera proteína retrasando todavía

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más el ácido nucleico.
Los factores de transcripción se unen a promotores, ácidos nucleicos o incluso a otros
factores.
Cualquier proteína que tu sospeches que interactúa a un ácido nucleico deberías
demostrarlo haciendo esto.

Un competidor:
En el centro podemos observar un competidor específico que se une específicamente al
ADN. El competidor se unirá al ADN marcado radiactivamente. Pero si le ponemos ADN
no marcado en mayor cantidad, se va a unir a este y no al que está marcado
radiactivamente por lo que observaremos la fluorescencia estará abajo ya que no se ha
retrasado en el gel, la radioactividad no se ve afectada.
También se hace coinmunoprecipitación en los ácidos nucleicos. Para demostrar que
las dos proteínas no interaccionan al azar.

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Ejemplos reales de cómo

se ven esos geles:
A: Ejemplo de shift
B: Ejemplo de supershift

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Footprinting:
Tenemos una proteína que sospechamos que une a un ácido nucleico, en
este caso es un factor de transcripción. Si este une al AN se puede hacer
este experimento que se llama footprinting ponemos el ácido nucleico con
la proteína que sospechamos que se une. Dejamos que se una y después se
digiere el ácido nucleico parcialmente.
Si el ácido nucleico es unido por la proteína, el fundamento está en que
cuando se digiere con DNasa 1 el lugar con el que está unido queda
protegido de la digestión. Y los productos se separan en geles
desnaturalizantes.
Ese hueco, que observamos en la foto, es el que el factor de transcripción
protegió de la transcripción y no dejo que la DNasa llegara ahí.
Si te pasas se llena todo de huecos, tienes que encontrar el punto en el que
corte todos los sitios, pero no todos completamente. Tiene que ser aleatorio
y parcial.
• Una molécula de ADN a la que se sospecha que se une un factor de
transcripción se marca con 32P
• Se incuba la molécula de ADN con el factor de transcripción
• Digiere (parcialmente) el producto con DNAasaI
• Separar los productos de la digestión en geles de la acrilamida
• La secuencia protegida de la digestión (footprinting) es el lugar de
unión de FT