GENÉTICA BACTERIANA

MICROBIOLOGÍA
2º FARMACIA (GRADO)
 Tema 1.- “Introducción”.........................................................................................3

Tema 2.-“Mutagénesis”…………………………………………………………10

Tema 3.- “Recombinación genética en bacterias. Transformación”……...…...23

Tema 4.- “Transducción”……………………………………………………….27

Tema 5.- “Conjugación”………………………………………………………...30

Tema 6.- “Ingeniería Genética”………………………………………………...39

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 Tema 1.-“ Introducción”:

-“Genética Bacteriana”: parte de la microbiología que estudia el genoma de las

bacterias.
-“Genoma”: conjunto de la información genética de una especie.
La información genética reside en el cromosoma. Los Procariotas sólo tienen un
único cromosoma, que está formado por una doble cadena de ADN circular y cerrada.
Es una estructura de doble hélice.
El ADN está compuesto por una secuencia de nucleótidos: A (Adenina), T
(Timina), G (Guanina), C (Citosina).
El Tamaño medio es de unas 3.000.000 de bases (3 x 106 pb: Pares de bases).
 Características de las 2 cadenas de ADN:
- Son Antiparalelas 5’ 3’
3’ 5’

- Son Complementarias, la secuencia de una cadena, determina la secuencia de

la otra.
A T
G C
Esto es importante para los mecanismos de replicación y transcripción.
El cromosoma contienen todos los genes de la bacteria.
-“Gen”: parte de la secuencia del ADN del cromosoma que codifica una Proteína.
-“Genoma”: incluye todos los genes que codifican todas las proteínas de una célula.
-“Gen Estructural”: secuencia de bases que codifican una proteína.
-“Secuencias Reguladoras”: secuencia de bases no codificantes, pero que regulan la
expresión del gen.
PROMOTOR ESTRUCTURAL TERMINADOR
-“Genotipo”: es el complemento genético de un organismo.
“La diferencia entre Genoma y Genotipo es que Genoma se aplica a la especie y por el
contrario Genotipo se aplica a una cepa concreta”.
Ej.: Genoma E.coli. Genotipo E.coli DH5α.
-“Fenotipo”: es la manifestación externa del genotipo. Son aquellas características del
genotipo que se pueden apreciar o detectar.
Ej.: Fenotipo: movilidad, capacidad de usar lactosa,…
Genotipo: gen que codifica la flagelina, operón lactosa…

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-“Cepa o Clon”: población bacteriana que procede enteramente de una célula original,
en la que todas las células son genotípicamente idénticas.
Se puede asimilar al concepto de “colonia aislada”.
 Flujo de información genética en las células:
El ADN tiene que pasar a la descendencia, las células se dividen mediante un
proceso de fisión binaria. Son idénticas. No se diferencia entre célula hija y célula
madre. Cada una tiene que recibir una copia del ADN → Replicación.
La Replicación la lleva a cabo una serie de enzimas, incluyendo la ADN-
Polimerasa.

ADN ADN

Replicación

ADN Polimerasa

Dentro de las células, los Genes se tienen que expresar para la síntesis de
Proteínas. Los genes se tienen que transcribir para dar lugar a ARNm, y este es
traducido en los ribosomas para dar lugar a la síntesis de Proteínas:

Replicación
ADN ADN
ADN-Pol.

Transcripción
ARN-Pol.

Expresión Génica ARNm

Traducción

PROTEÍNAS
En el Proceso de Replicación, la ADN-Polimerasa utiliza cómo molde una de
las cadenas de ADN para sintetizar la cadena complementaria a través de un mecanismo
conocido como “Horquilla de Replicación”. La descendencia recibe una copia del
cromosoma que contiene una cadena original y una cadena de nueva síntesis. Es un
proceso de Replicación Semiconservativa.

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 Origen
De
Replicación HORQUILLA DE
REPLICACIÓN

El Proceso de Transcripción forma parte del flujo de información genética dentro de la

célula que tiene como finalidad la síntesis de Proteínas. La ARN polimerasa, junto con
otros enzimas, es la que sintetiza el ARN mensajero.

ADN ARNm
Transcripción
(ARN-Pol.)

Se transcriben en cada momento exclusivamente los genes que son necesarios.

La ARN-Pol. Transcribe genes concretos.

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

La ARN-Pol. Utiliza cómo molde la cadena no codificante para sintetizar una

cadena complementaria de ARNm.
La cadena de ARNm será “Idéntica” a la cadena codificante, con la salvedad de
que en lugar de Timina la cadena de ARNm presenta Uracilo.
-“Código Genético”: la información contenida en la secuencia de bases del ADN está
codificada, y el proceso de Traducción, lo que hace es convertir el Código Genético en
una secuencia de Aminoácidos.

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 El Código Genético es un código de tres letras a las que se denomina “Codones”
y cada uno de estos Codones codifica un aminoácido, un Gen es una secuencia de bases
nitrogenadas organizadas en tripletes (Codones).
-“Traducción”: lectura de los tripletes de la secuencia del mensajero, para dar lugar a
la síntesis de la cadena de aminoácidos que constituye la proteína.
 Características del código genético:
- Es Universal: es compartido por todos los seres vivos.
Ej.: El Codón ATG (AUG en el mensajero) en el ADN codifica siempre Metionina en
virus, bacterias, hongos, plantas y animales.
Existen excepciones muy ligeras.
Ej.: En Mitocondrias y Cloroplastos, existen Codones que no tienen el mismo
significado para otros organismos.
- Es Degenerado: existen un total de 4 bases nitrogenadas (ATGC –
AUGC) y el código genético esta organizado en tripletes, si calculamos las
combinaciones posibles son 64. Es decir pueden codificar a 64 aminoácidos diferentes,
pero en la naturaleza sólo existen 20 aminoácidos diferentes, como consecuencia hay
más de un triplete que codifica para el mismo Aminoácido, y a este fenómeno se le
conoce cómo “Degeneración”.
Hay Tripletes con funciones específicas:
- Triplete de Iniciación: es el primer triplete del gen es ATG – AUG
(Metionina), pero puede haber tripletes ATG que no sean de
iniciación.
- Tripletes de terminación: no codifican ningún aminoácido, son tripletes
sin sentido

TAA; TAG; TGA Estos Tripletes cuando pasan por los Ribosomas, la maquinaria
UAA; UAG; UGA traduccional no es capaz de producir ningún aminoácido,
terminando así la traducción y liberando la cadena terminada.

- “Pauta Abierta de Lectura”: es prácticamente un sinónimo de Gen Estructural, es la

secuencia de Tripletes que constituyen un Gen Estructural, que comienza con un
Triplete de Iniciación y que puede leerse ininterrumpidamente hasta llegar a un Triplete
de Terminación. Es la secuencia de Tripletes que codifica una Proteína.
 Características Propias del Genoma Procariota:
Tiene una serie de características que lo diferencian del de los Eucariotas:

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 1) En los Procariotas el cromosoma es único, compuesto por una doble cadena
circular y cerrada

2) Carece de Intrones.
INTRONES: son secuencias no codificantes, que interrumpen la pauta abierta de
lectura (PAL) de los genes Eucariotas.

Terminación
Natural
Iniciación
EXON INTRON EXON INTRON EXON
ATG TAA
TAC ATT
Se interrumpe
la PAL
Zonas Codificantes
Eucariotas

Esto no ocurre en el Genoma de Procariotas.

ATG TAA
TAC ATT
Iniciación Zona Codificante Terminación
Natural

El genoma de Procariota es mucho más compacto, porque carece de Intrones,

toda su secuencia es codificante. En Procariotas las únicas secuencias no codificantes,
son las que conocemos cómo “reguladoras”, promotores y terminadores.
3) Está Organizado en OPERONES:
OPERÓN: es un conjunto de genes que codifican todas aquellas Proteínas que
tienen una función relacionada, y que se sitúan uno detrás de otro, bajo el control todos
ellos de una única región reguladora, que va por delante del primero de ellos, y de una
única región terminadora, que va por detrás del último de ellos.
Ej.: “Operón-Lac de Escherichia coli”: agrupa los tres genes que necesita E.coli para la
utilización de la LACTOSA (Disacárido Glucosa – Galactosa).
E.coli necesita 3 Enzimas para poder utilizar la Lactosa:
- PERMEASA: transporta la Lactosa desde el medio de cultivo, hasta el
interior de la célula.

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 - β-GALACTOSIDASA: rompe el disacárido, liberando Glucosa y
Galactosa.
- TRANSACETILASA: modifica la Galactosa de forma que puede ser
metabolizada, en otra ruta metabólica.
El OPERÓN-LAC agrupa los 3 genes que codifican estos 3 enzimas:

Lac Z (β-Galactosidasa) Lac Y (Permeasa) Lac A (Transacetilasa)

PROMOTOR
ATG TAA-ATG TAA-ATG TAA
TAC ATT-TAC ATT-TAC ATT
Triplete Terminador
Lactosa en el
Medio Triplete iniciación

OPERÓN-LAC

El que todos los genes de una vía metabólica estén juntos, y bajo el control de una
misma región reguladora, permite la expresión simultánea y equimolecular de todos los
genes que participan en dicha vía metabólica.
El PROMOTOR del OPERÓN-LAC se activa solamente cuando existe lactosa en el
medio de cultivo y cuando no existe glucosa, es decir, la expresión de estos genes sólo
ocurre cuando es necesario.
La presencia de Lactosa en el medio y la ausencia de glucosa, actúa sobre el
PROMOTOR que induce la expresión de los 3 genes a la vez, dando lugar a un único
mensajero, que codifica los 3 Enzimas, y que es POLICISTRÓNICO (codifica a más de
1 Proteína). Este mensajero es traducido, y da lugar a la síntesis de β-Galactosidasa,
Permeasa, Transacetilasa, de forma secuencial, desprendiéndose cada una de las
proteínas cuando la traducción alcanza su correspondiente triplete de terminación.

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 ARNm Policistrónico

AUG UAA-AUG UAA-AUG UAA

TRADUCCIÓN

β-Galactosidasa Permeasa Transacetilasa

El Operón garantiza que el grupo de genes sólo se exprese cuando sea necesario, y
cuando lo hace, se expresan todos los genes a la vez y en la misma proporción, por tanto
es un sistema muy eficiente de regulación de la expresión génica, y es característica de
las células Procariotas.
La célula Eucariota no presenta esta organización, en el genoma Eucariota los
genes que forman parte de una misma vía metabólica no solamente no están juntos, sino
que pueden estar en cromosomas diferentes, por lo que la regulación de la expresión
génica es mucho más compleja.

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 Tema 2.- “Mutagénesis”:

-“Mutación”: es cualquier cambio heredable en la secuencia de bases del ADN. Se

puede clasificar de acuerdo a diferentes criterios:
-Mutaciones Espontáneas: son las que ocurren cómo
consecuencia de errores de la maquinaria de replicación. Errores de la ADN Polimerasa.
Ocurren con una frecuencia muy baja y son la base del proceso evolutivo.
- Mutaciones Inducidas: aquellas que se originan por la acción de
un agente Físico o Químico, al que se denomina mutágeno.
-“Cepa Salvaje”: (Cepa Silvestre), es el microorganismo tal y cómo se aísla en la
naturaleza.
-“Cepa Mutante”: es una Cepa Salvaje después de haber sufrido una mutación:
-“Mutante”: Cepas obtenidas en el Laboratorio, por un proceso de Mutagénesis
inducida.
Los Mutantes Bacterianos son herramientas para el estudio de la Fisiología y el
Metabolismo Bacteriano.
La mejor forma de conocer la función de una Proteína en una célula es dañar esa
Proteína, causando una mutación en el gen que la codifica, y ver el efecto Fenotípico
que tiene sobre la célula.
Mediante Mutagénesis inducida, seguida por unos procesos de selección, se
pueden obtener, diferentes tipos de Mutantes Bacterianos, que podemos utilizar para el
estudio de distintos aspectos de la fisiología y metabolismo microbianos:
Vamos a ver solamente tres tipos, a modo de ejemplo, aunque existen muchos
más.

“Mutantes Nutricionales”: son cepas que al contrario que las cepas salvajes de las que
proceden, necesitan de la presencia de un factor de crecimiento en el medio de cultivo.
Ej.: Mutaciones nutricionales que hacen que la cepa que las ha sufrido requiera la
presencia de un aminoácido, en el medio de cultivo (Leu, Lis, His, Ala).
La cepa que no crece, a menos que este aminoácido se encuentre en el medio de cultivo,
se dice que es una Cepa Auxótrofa para ese aminoácido.

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Ej.: La Cepa Mutante auxótrofa para la leucina, mientras que la cepa silvestre o salvaje
de la que procede es protrótrofa para la leucina.
Los mutantes nutricionales han sufrido una mutación en uno de los genes que codifica
una de las enzimas que participan en la vía metabólica de la síntesis del factor de
crecimiento, por ejemplo en la vía metabólica de la síntesis de la Leucina”.
El mutante nutricional no sobreviviría en la naturaleza, la mayoría de las mutaciones de
este tipo no son viables, ya que el factor de crecimiento no se encuentra normalmente en
el habitat natural, las mutaciones suelen ser perjudiciales (“deletereas”).

 Obtención de mutantes:
Tomamos un cultivo y lo sometemos a la acción de un mutágeno, por ejemplo
radiación ulravioleta o nitrosoguanidina, un mutageno químico, obteniendose mutantes
de todos los tipos a los que después tendremos que someter a un proceso de selección:

U.V.
CEPA SELECCIÓN
SALVAJE MUTANTES

El proceso de selección, varía en función del tipo de mutante que queremos

obtener.

Método de réplica en placa:

Los mutantes se siembran en una placa y aparecen una serie de colonias. A
continuación hacemos una réplica de esta placa en dos placas, una de ellas, con medio
completo, y otra de ellas con el medio mínimo, que no contiene el factor de crecimiento.
Se comparan las colonias de uno y otro y la que falta es un mutante auxótrofo para ese
factor de crecimiento.
Obtención de la placa réplica:
Se impregna la placa original en un terciopelo estéril, y con él sembramos las
dos placas, la de medio completo y la de medio mínimo y, después de cultivar 24 horas,
se procede a la selección.

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Método de Réplica en Placa

Utilidad de los mutantes nutricionales: son herramientas básicas para estudiar la vía de
biosíntesis de un determinado metabolito, como puede ser un determinado amino ácido.

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 Mutantes resistentes a antibióticos y sustancias químicas:
La Cepa Mutante al contrario que la Cepa Salvaje, es capaz de resistir la acción
de un determinado antibiótico o sustancia química. En muchos casos la diana de los
antibióticos son Proteínas específicas, si una mutación afecta al gen que codifica la
proteína diana, el antibiótico dejará de ser efectivo, y la Cepa Mutante será resistente a
dicho antibiótico.
 Obtención de mutantes resistentes:

MEDIO COMPLETO

Réplica en Placa

U.V. Siembra en Placa

CEPA
SALVAJE MUTANTE
S

Réplica en Placa

MEDIO COMPLETO
+
ANTIBIÓTICO

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Se utiliza de nuevo el Sistema de Réplica en Placa, se replica la placa con los mutantes
en una placa con medio completo, y otra réplica en una placa con medio completo y
antibiótico o agente químico añadido, y después de cultivar, los que crezcan en esta
segunda placa, serán los mutantes resistentes a ese antibiótico o agente químico.
 Utilidad de los Mutantes Resistentes:
Estudiar específicamente las dianas, el mecanismo de acción del antibiótico, y
los mecanismos de resistencia frente al antibiótico o sustancia química, por parte del
microorganismo.
Este tipo de mutaciones son beneficiosas para el microorganismo, ya que le
permite sobrevivir a la acción de Quimioterápicos.

Mutantes Letales Condicionales:

-“Mutantes Letales”: son aquellos que han sufrido mutaciones en genes que codifican
Proteínas imprescindibles para la célula.
Ej.:” Mutante que sufre una modificación en el gen que codifica la ADN Polimerasa, la
célula no puede dividirse y la célula muere. Esta mutación es letal”.
Se pueden estudiar procesos cómo la replicación de ADN, la síntesis del ARNm
etc mediante Mutantes Letales Condicionales.
-“Mutante Letal Condicional”: son mutantes que solamente expresan el fenotipo de
letalidad en unas condiciones determinadas.
Condiciones Permisivas: aquellas en las que no se expresa la letalidad.
Condiciones Restrictivas: aquellas en las que sí se expresa la letalidad.
Normalmente las condiciones restrictivas y permisivas se encuentran asociadas a
la Temperatura: -Permisivas: 37ºC el microorganismo crece, no expresa letalidad.
.Restrictivas: 42ºC el microorganismo no crece, expresa letalidad.
Si se quiere estudiar el efecto de la mutación, pasamos el cultivo de condiciones
permisivas, a condiciones restrictivas, y en ese momento se observa el efecto de la
mutación.
 Utilidad Mutantes Letales Condicionales:
Permite el estudio de procesos imprescindibles para la célula.
Lo que ocurre en un mutante letal condicional es que se ha producido una mutación,
consistente en el cambio de 1 sólo aminoácido, que afecta a la estabilidad de la Proteína

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 ante el calor, variando enormemente el rango de temperaturas a las que la Proteína es
estable, desnaturalizándose y dejando de ser funcional.

Ej.: CEPA
CEPA U.V MUTANTE
SALVAJE LETAL
CONDICIONAL
DNA Polimerasa
Estable a 60ºC DNA Polimerasa
Se desnaturaliza
a partir de 42ºC
(Por el cambio
de un
Aminoácido)

 Obtención de Mutantes Letales Condicionales:

Tª 37ºC

Réplica en Placa

U.V. Siembra en Placa

CEPA
SALVAJE MUTANTE
S

Mutantes
Letales
Réplica en Placa Condicionales

Tª 42ºC
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 BASES MOLECULARES DE LAS MUTACIONES:
¿En qué consisten las mutaciones, a nivel de la secuencia de ADN?.
Se pueden dividir las mutaciones a este nivel en:
-Puntuales
-Delecciones e Inserciones
-Causadas por elementos móviles
 Mutaciones Puntuales:
Aquellas que implican el cambio de una base por otra, en la secuencia del ADN.
Éstas a su vez pueden subdividirse en 3 subtipos según el efecto fenotípico:
Mutaciones Silenciosas: cambio de una base, sin dar lugar al cambio de
un aminoácido. Pueden ocurrir debido a que existe más de un triplete de bases que
codifica el mismo aminoácido por la degeneración del código genético:
Ej.: …..CGG ATC GGA ATC…. (Original)
Arg Ile Gly Ile
…..CGG ATC GGC ATC…. (Mutado)
Arg Ile Gly Ile
Cambio de base con cambio de aminoácido en la proteína Mutada:
Este cambio puede tener una mayor o menor repercusión, ya que todos los
aminoácidos no son igualmente importantes. Por ejemplo, si se cambia un aminoácido
del centro activo de un enzima, el enzima dejará de ser funcional. Si por el contrario el
aminoácido que cambia no se encuentra en una región importante para la función de la
proteína, esta seguirá siendo funcional. Pueden también darse casos intermedios, en los
que el cambio de aminoácido provoque un aumento de la sensibilidad de la proteína
ante la temperatura, por el cambio estructural producido, por lo que ante un aumento o
disminución de la temperatura, se produciría su desnaturalización, se trata de
Mutaciones Condicionales.
Ej.: a 37ºC el enzima funciona, pero con un aumento o una disminución significativa de
la temperatura el enzima dejará de ser funcional (Mutante Condicional), si además el
enzima es imprescindible, dará lugar a una Mutación Letal Condicional.
CGG ATC GGA ATG
Arg Ile Gly Ile
CGG ATC AGA ATG
Arg Ile Arg Ile

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 Cambio de base que da lugar a un Triplete de Terminación:
La mutación da lugar a una Proteína truncada, la traducción se para antes de
tiempo, y en el 99’9% de los casos la Proteína no será funcional, y por tanto la mutación
tendrá consecuencias fenotípicas.
Ej.: …..CGG ATC GGA ATC…..
….. Arg Ile Gly Ile …...

….. CGG ATC TGA ATC….

Triplete de terminación
….. Arg Ile STOP………..

 Delecciones o Inserciones:
Implica Quitar o Añadir 1 o más bases a la secuencia de ADN. Las Inserciones
y las Delecciones, siempre tienen consecuencias fenotípicas, porque suponen un
corrimiento de la pauta abierta de lectura, lo que dará lugar a una Proteína aberrante.
Consecuencia: el código genético, es un lenguaje que utiliza palabras de tres
letras, y hay una frase que lo representa perfectamente.
Ej.: UNO MAS UNO SON DOS → Proteína funcional y Correcta
UNO MAU NOS OND OS → Proteína aberrante, no tiene sentido.
Por ello las Inserciones y Delecciones, siempre tienen consecuencias fenotípicas.

 Mutaciones Causadas por elementos móviles:

Causadas por “Transposones”, fragmentos de ADN que pueden saltar de una
localización cromosómica a otra, gracias a la actividad de la TRANSPOSASA, un enzima
que tiene actividad endonucleasa, de corte, y ligasa, de unión.
La TRANSPOSASA es codificada por el propio Transposon.
Los Transposones causan mutaciones por inserción, y el gen en que se insertan
queda totalmente interrumpido (disrupcionado), por lo que siempre tienen un efecto
fenotípico. Se han encontrado Transposones en una gran variedad de organismos. En el
caso de las bacterias los Transposones contienen genes que codifican Proteínas, que
están implicadas en la resistencia a antibióticos.
REVERSIÓN:
Consiste en un retorno al fenotipo original. La Reversión, ocurre, cuando las
mutaciones desaparecen. Es decir , cuando de alguna forma se ha reparado la mutación.

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“¿Cómo Revierten los diferentes tipos de mutaciones?”:
 Mutación Puntual:
Revierte mediante otra mutación puntual.
Ej.: …..GGA…… (Cepa Salvaje)
…..Gly…….
Mutación (U.V.)
…..GCA…… (Cepa Mutante)
……Ala…….
Reversión (U.V.)
…..GGA….. (Cepa salvaje)
….. Gly ….. Vuelve al fenotipo original
La Reversión de las mutaciones puntuales, puede ocurrir de forma espontánea.
 Mutaciones por Inserciones y Delecciones:
Una Inserción puede revertir mediante una Delección, y por el contrario una
Delección puede revertir mediante una Inserción. Pero este fenómeno ocurre raras
veces.
 Mutaciones por elementos móviles:
Revierten de forma espontánea, en el momento que el Transposón salta, se
inutiliza el gen en el que se inserta, y cuando vuelve a saltar deja el gen intacto, tal
cómo se encontraba antes de la inserción del Transposón.
EJEMPLOS DE MUTÁGENOS:
“Mutágeno”: cualquier agente físico o químico, capaza de causar un cambio en la
secuencia de ADN. En seres superiores Mutágeno es equivalente a Carcinógeno.
Veremos únicamente dos ejemplos:
-Análogos de bases nitrogenadas
-Radiación U.V.
 Análogos de bases nitrogenadas:
Se trata de compuestos químico, cuya molécula es muy similar a la de una base
nitrogenada.
Ej.: “5-BromoUracilo”: es un análogo de la Timina. La única diferencia que existe es
que en la posición 5 la Timina tiene un CH3 y el 5-BromoUracilo tiene un Br.
Si añadimos al medio de cultivo 5-BromoUracilo, la maquinaria de replicación
puede utilizarlo en lugar de la Timina.

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 Las mutaciones ocurren porque, a diferencia de la Timina, el 5-BromoUracilo
puede aparearse indistintamente con Guanina o con la Adenina.

1ºCiclo
GC GC
CG CG
GC Replicación GC
AT 5BU A5BU
GC GC
GC GC
2ºCiclo
GC GC
CG CG
GC Replicación GC
A5BU G5BU
GC GC
GC GC
3ºCiclo
GC GC
CG CG
GC Replicación GC
G5BU GC
GC GC
GC GC

Cómo consecuencia, el 5-BromoUracilo da lugar a mutaciones puntuales.

 Radiación U.V.:
Actúa específicamente, sobre Timinas adyacentes, en la misma cadena de ADN,
creando dímeros de Timina.
…..AGCGGCCGGTTAGCAGA…..
…..TCGCCGGCCAATCGTCT…..

/UV

…..AGCGGCCGGTTAGCAGA…..
…..TCGCCGGCCAATCGTCT…..
/Respuesta SOS
(1)
…..AGCG AGA…..
…..TCGCCGGCCAATCGTCT…..

/(2/3)

…..AGCGGCAGGTTAGCAGA…..
…..TCGCCGGCCAATCGTCT…..

/Replicación

19 …..AGCGGCAGGTTAGCAGA…..
…..TCGCCGTCCAATCGTCT…..
 La energía de la radiación U.V. es utilizada por las 2 Timinas para formar un
enlace covalente adicional, lo que crea rigidez en la cadena del ADN, que dificulta la
separación de las cadenas para la replicación, y desencadena una serie de mecanismos
de Reparación:
El más importante es la repuesta S.O.S., en el que participan tres enzimas que
son necesarios para la reparación:
-ENDONUCLEASA: corta el ADN y lo degrada. Degrada toda la zona
de DNA del dímero de Timina, por lo que esa cadena del cromosoma queda
interrumpida.
-ADN POLIMERASA: no es la que participa en la replicación del
cromosoma, actúa rellenando rápidamente la zona, lo que aumenta la probabilidad de
error, dando lugar a mutaciones.
-LIGASA: une los extremos de la nueva secuencia sintetizada por la
ADN Polimerasa reparadora.
La Respuesta S.O.S. puede tener que reparar miles de Dímeros de Timina, ya
que la radiación U.V. puede afectar a un gran número de las Timinas adyacentes que
puedan existir en la secuencia del cromosoma. Las mutaciones puntuales producidas por
la radiación U.V. son consecuencia de los mecanismos de reparación. Son mutaciones
puntuales introducidas por la ADN Polimerasa de reparación, que es capaz de actuar
rápidamente pero con una baja fidelidad.
La probabilidad de mutación es muy elevada, debido a que el sistema S.O.S.
tiene que reparar un elevado número de Dímeros de Timina.
TEST DE AMES:
Es una aplicación práctica de un mutante bacteriano, y sirve para determinar el
poder mutagénico de una sustancia química. Básicamente sirve para determinar si una
sustancia problema es un mutágeno o no.
Tomando en consideración que Mutágeno es sinónimo de Carcinógeno, es
obligatoria la realización de este test en cualquier compuesto químico nuevo antes de su
comercialización.
Cada año se obtienen nuevos compuestos químicos que se utilizarán cómo
colorantes, fármacos, detergentes, aditivos etc, y antes de su comercialización es
necesario confirmar que no son potencialmente carcinogénicos.
Hasta la década de los 60 del siglo pasado, los ensayos de actividad mutagénica
de compuestos químicos se realizaban por exposición de animales de experimentación,

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en un proceso que era largo y costoso. Para simplificar el ensayo “Bruce Ames”
desarrolló el Test que lleva su nombre en la década de los 70.
 Fundamento del Test de Ames:
Consiste en utilizar una cepa mutante de “Salmonella typhimurium” que ha
sufrido una mutación puntual, que la hace AUXÓTROFA para Histidina. El Test
consiste en medir la Tasa de Reversión de la mutación histidina (-) en este mutante,
inducida por el compuesto químico que se está ensayando. Si el compuesto químico que
se está ensayando es un mutágeno, aumentará la tasa de reversión espontánea.
Para realizar el ensayo, se siembra el mutante histidina (-) en dos placas con
muy poca histidina, en las que el mutante no es capaz de crecer. Por tanto, lo único que
crecerá en esas placas son las colonias de revertientes espontáneos.
Se añade en el agar de las placas, o bien en discos de cartón en la superficie del
agar, el compuesto químico a ensayar, de forma que una de las placas sea el control
negativo y la otra contenga el compuesto químico a ensayar. Al cabo de 24 horas se
observa el número de colonias en cada placa. En la placa control aparecerán cierto
número de colonias, que corresponderá a revertientes espontáneas. Si en la segunda
placa aparece un número mucho mayor de revertientes, esto nos estará indicando que el
compuesto químico problema ha incrementado la tasa de reversión y es un Mutágeno.

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 Ventajas:
-Se puede realizar en 24 horas.
-Sólo son necesarios dos discos de
cartón, dos placas y la cepa Histidina (-), es
decir el coste se reduce a una ínfima parte
de lo que supondría un ensayo con
animales.

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 Tema 3.-“Recombinación genética en Bacterias”
“Transformación”

-“Recombinación genética”: es el proceso mediante el cual una bacteria, adquiere

información genética (fragmentos de ADN) de otra bacteria. En la mayoría de los casos,
pero no siempre, se trata de bacterias de la misma especie. Forma parte del proceso de
evolución.
El fenómeno de Recombinación Genética en bacterias puede ocurrir por
tres mecanismos diferentes:
* Transformación: paso de ADN libre de una célula donadora a una
célula receptora. Se produce, por ejemplo, cuando la lisis de una bacteria libera al
medio fragmentos de ADN que son incorporados por otra bacteria. Es el primer proceso
de recombinación genética en bacterias que se descubrió.
*Transducción: el ADN pasa de una bacteria a otra en el interior de una
partícula vírica.
*Conjugación Sexual: el ADN pasa de una bacteria a otra por contacto
directo entre dos bacterias. Para que se dé este fenómeno, la bacteria donadora tiene que
contener un Plásmido conjugativo.
El proceso de recombinación genética, siempre implica dos pasos:
*1º Entrada del ADN: de la bacteria donadora en la bacteria receptora.
*2º Integración del ADN: de la bacteria donadora en el cromosoma de la
bacteria aceptora. Está es la etapa de recombinación propiamente dicha.
No siempre en 2º paso sigue al 1º. Con frecuencia el ADN entra la bacteria receptora y
no llega a integrase en su cromosoma. Esto ocurre porque existen dos factores que
limitan el fenómeno de recombinación, de tal forma que sólo suele producirse entre
bacterias de la misma especie o, en su defecto, de especies muy próximas
genéticamente:
 1. SISTEMA DE RESTRICCIÓN-MODIFICACIÓN:
Cada especie bacteriana, tiene una serie de enzimas de restricción del ADN,
que reconocen una determinada secuencia de bases (diana) y la cortan cuando aparece.
Ej.: E. coli ----------GAATTC---------
----------CTTAAG----------
Diana reconocida por el Enzima de Restricción EcoRI de E.coli

23
 Esta es la primera barrera que debe salvar el ADN exógeno. Las secuencias
reconocidas por los enzimas de restricción pueden aparecer también en el ADN propio.
Sin embargo, el ADN propio no es degradado por el enzima de restricción porque las
dianas que reconoce han sido modificadas por un Enzima de Modificación. El ADN de
la bacteria está modificado de tal forma que no puede ser digerido por los Enzimas de
Restricción propios. La modificación consiste en una metilación de una de las bases
que forman parte de la diana reconocida por el Enzima de Restricción. El ADN propio
está protegido, mientras que el ADN exógeno no lo está y por tanto es digerido por los
Enzimas de Restricción. Cuando el ADN proviene de otra bacteria de la misma especie,
éste se encuentra modificado y protegido contra los enzimas de restricción de esa
especie y no va a ser degradado. Por ello la recombinación es más frecuente entre las
bacterias de la misma especie.
 2. NECESIDAD DE HOMOLOGIA PARA INTEGRACIÓN DEL
ADN DE LA BACTERIA DONADORA EN LA BACTERIA ACEPTORA:
Para que se dé integración, verdadera recombinación de ADN exógeno en el
cromosoma de la bacteria receptora, tiene que haber Homología entre parte de la
secuencia del ADN exógeno y la secuencia de una región del ADN del cromosoma de la
bacteria receptora. Solamente en este caso se produce integración.

Estos 2 factores hacen que el fenómeno de recombinación sea mucho más

frecuente entre bacterias de la misma especie que entre bacterias de especies distintas.

-“Marcador Genético”: carácter fenotípico, cuyo cambio nos permite saber que se ha
producido un fenómeno de recombinación.

TRANSFORMACIÓN:
Consiste en el paso de ADN libre de una célula a otra. Fue el primer fenómeno
de recombinación genética que se descubrió en bacterias. Fue el británico Fred Griffith,
quien trabajando con Streptococcus pneumoniae, lo describió por primera vez en 1928.
En aquella época se conocía de la existencia de dos tipos de cepas de S.pneumoniae:
- L-Lisas: Dan lugar a colonias lisas, son capsuladas y virulentas.
-R-Rugosas: Dan lugar a colonias rugosas, no capsuladas y no virulentas.

24
“Experimento de Griffith”: Consistía en inyectar en ratones una mezcla de células vivas
de S.pneumoniae de una cepa-R y células muertas de una cepa-L. Contra lo que cabía
esperar, los ratones morían y en el cultivo realizado a partir de muestras de los ratones
muertos se recuperaban únicamente células de la cepa L.

Cepa-R (Vivas)
+ RATONES R.I.P. Cepa-L
Cepa-L (Muertas)

A raíz de este experimento, Griffith publica estos resultados y dice que las
células-R vivas habían sufrido un fenómeno de TRANSFORMACIÓN. Griffith dedujo
que había algo, en los restos de las células-L muertas, que era el “Factor de
Transformación”. Hoy se sabe que eran los fragmentos de ADN de las Células-L
muertas, que contienen la información genética necesaria para que las células-R sean
capaces de sintetizar la cápsula, y por tanto adquirir virulencia, pero en 1928 ni siquiera
se sabía que la información genética se encontraba codificada en el ADN.
Avery, McLeod, y McCarty en 1944 demostraron que el ADN era el responsable
de la Transformación en el experimento de Griffith, demostrando por primera vez que
la información genética reside en el ADN. Griffith tuvo una enorme suerte ya que
existen muy pocas especies bacterianas que sufran el fenómeno de Transformación de
forma natural, entre ellas “S.pneumoniae”. A la capacidad de un microorganismo para
sufrir un proceso de transformación se le conoce como “Competencia”. El Marcador
Genético en el experimento de Griffith es la virulencia, que deriva de la presencia o
ausencia de la cápsula.

 Etapas del proceso de Transformación:

1º. Interacción del fragmento de ADN libre con Proteínas específicas
de la superficie de la bacteria competente: estas proteínas, sólo se encuentran en las
células competentes.
2º. Internalización: entrada del ADN dentro de la célula. Ocurre
simultáneamente con la degradación de una de las dos cadenas, y lo que entra es una de
las dos hebras del ADN, la otra es degradada.
3º. Recombinación: propiamente dicha. Consiste en la integración del
ADN monocatenario, en el cromosoma de la bacteria receptora. Este proceso está
mediado por las Proteínas REC (Recombinación).

25
Las Proteínas REC, se encargan de llevar a cabo la hibridación, y se encargan tanto de
cortar y degradar el cromosoma propio, cómo de empalmar este cromosoma con el
ADN exógeno. Las Proteínas REC intervienen en todos los procesos de recombinación,
independientemente del mecanismo por el que se hayan producido.

 Producción de cambios fenotípicos:

Ocurre cuando la información presente en el fragmento de ADN que ha entrado,
o parte de ella, no estaba en el cromosoma de la célula receptora. Es decir, para que se
produzca un cambio fenotípico, el fragmento de ADN externo ha de ser homólogo, pero
no idéntico; ha de aportar algo nuevo. Por ejemplo, en el experimento de Griffith, los
genes responsables de la síntesis de la cápsula. En el caso de que el fragmento de ADN
que entra fuese totalmente idéntico a una región del cromosoma de la célula aceptora,
ocurriría una recombinación “silenciosa”, sin que se produjesen cambios fenotípicos.

26
 Tema 4.- “Transducción”:

TRANSDUCCIÓN:
-“Transducción”: es el paso de ADN de una célula bacteriana a otra en el interior de
una partícula vírica. Fue descubierto por Zinder y Lederberg en la década de 1950.
-“Virus”: partícula submicroscópica que, en forma libre, carece de actividad
metabólica. Son parásitos intracelulares estrictos. Solamente pueden replicarse
utilizando la maquinaria biosintética de la célula hospedadora.
 Composición de un virus:
-“Cápsida”: cubierta Proteica que contiene el ácido nucleico.
-“Ácido Nucleico”: se encuentra en el interior de la cápsida y es el genoma del
virus.
 Ciclo Replicativo Bacteriofago (Virus Bacteriano):
1º. Unión de la partícula vírica a la superficie de la célula.
2º. Inyección del ácido nucleico.
3º. Multiplicación de la copia del Ácido Nucleico vírico.
CICLO LÍTICO 4º. Síntesis de Proteínas que forman la cápsida.
5º. Ensamblaje de las copias de Ácido Nucleico con las cápsidas.
6º. Partículas víricas maduras.
7º. Liberación por lisis de la célula bacteriana.

 Mecanismo recombinación genética a través de un ciclo lítico:

Accidentalmente puede ocurrir que lo que se introduce en la cápsida sea un trozo
del cromosoma de la bacteria hospedadora, dando lugar a una “Partícula Vírica
Transductante”. Esta puede unirse a la superficie de otra bacteria hospedadora
(Receptora del ADN foráneo), inyectando el ADN de la bacteria donadora y ese
fragmento de ADN se acaba integrando en el cromosoma de la Bacteria Receptora.
Este accidente ocurre porque la etapa de ensamblaje de lo Ácidos Nucleicos
víricos en las cápsidas es un proceso puramente mecánico, y sólo se requiere que el
fragmento de ADN del hospedador (Bacteria Donadora) sea de un tamaño adecuado,
similar al del ADN vírico.

27
 Cómo las cápsidas son específicas de especie, el fragmento de ADN será
transportado (transducido) a otra bacteria de la misma especie. Este proceso se conoce
como:

-“Proceso de Transducción Generalizada”: se llama así porque cualquier gen del

cromosoma de las células donadoras, tiene la misma probabilidad de ser transducido.

-“Proceso de Transducción Especializada”: requiere que ocurra un tipo de infección

de Ciclo Lisogénico. En este caso, el ácido nucleico vírico no desencadena un ciclo
lítico, sino que pasa a integrarse, en el cromosoma de la célula hospedadora (Bacteria
Lisogenizada), y cada célula hija recibirá una copia de ese DNA vírico en su
cromosoma. Mediante este mecanismo el ADN vírico puede permanecer integrado en el
cromosoma de forma indefinida. Solamente cuando hay una acumulación de mutaciones
en el cromosoma puede desencadenarse un ciclo lítico. Cuando la bacteria pierde
estabilidad, el virus se marcha.
 ¿Cómo se produce la transducción especializada mediante un ciclo
lisogénico?:
El ejemplo mejor conocido es el del fago (lambda) en E.coli. El ADN del virus
se integra en la región conocida como ATT (del ingles attachment) del cromosoma de
E.coli que se encuentra entre los operones GAL, responsable del metabolismo de la
galactosa, y BIO, responsable de la biosíntesis de la biotina. Por distintas razones, en un
momento dado, el ADN de lambda puede desintegrarse y se desencadena un ciclo
replicativo (lítico). La transducción especializada se produce cuando, accidentalmente,
la desintegración del ADN vírico ocurre de forma anómala, llevándose consigo el
operón GAL o el operón BIO y dejando integrado en el cromosoma parte del ADN del
virus. La encapsidación dará lugar a partículas transductantes que llevarán en su interior
el operón GAL ( dGAL) o el operón BIO ( dBIO). Estas partículas, cuando se unan a
una nueva célula de E.coli le inyectarán el operón BIO o el operón GAL. Si la célula era
gal- pasara a ser gal+ o, en el caso del operón BIO, si era bio- pasara a ser bio+. En
ningún caso se producirá un ciclo lítico, ya que las partículas víricas transductantes son
defectuosas (d) por haber dejado parte del ADN vírico en el cromosoma de la anterior
célula hospedadora.

28
 ATT (lugar de integración)
-Desintegración
Anómala

GAL BIO -Desintegración

Fago Anómala

-Desintegración
Normal
GAL BIO

 Diferencias entre Transducción Especializada y Transducción

Generalizada:
En la GENERALIZADA puede transducirse cualquier gen de la célula donadora
y, además, no requiere de la existencia de un ciclo lisogénico previo.
En la ESPECIALIZADA sólo se transducen aquellos genes que están próximos
al lugar de integración del ADN del virus en el cromosoma de la célula hospedadora.
Requiere un ciclo lisogénico previo para que pueda producirse.

29
 Tema 5.-“Conjugación”:

CONJUGACIÓN:
-“Conjugación”: es el proceso por el que se transfiere ADN de una bacteria donadora a
una receptora por contacto directo entre ambas. Para que este proceso sea posible, la
bacteria donadora ha de contener un Plásmido conjugativo. La conjugación bacteriana
fue descubierta por Lederberg y Tatum en 1946.
-“Plásmido”: molécula de ADN de doble cadena circular cerrada que puede replicarse
autónomamente, independientemente del cromosoma. Es cómo un cromosoma en
miniatura, con un tamaño mil veces más pequeño que el cromosoma de la célula.
Hay diferentes tipos de plásmidos:
-Plásmidos conjugativos.
-Plásmidos no conjugativos.
Los implicados en la conjugación son los plásmidos conjugativos.
Otra clasificación es:
-Plásmidos integrativos: los que, en un momento dado, pueden integrarse
en el cromosoma de la bacteria.
-Plásmidos no integrativos: plásmidos que nunca se integran.
Para que se dé el proceso de conjugación, la bacteria donadora tiene que
contener en su citoplasma un Plásmido conjugativo.
 ¿Cómo determinan las plásmidos conjugativos la transferencia de
información genética de una célula a otra por un proceso de conjugación?
El ejemplo mejor estudiado es el del “Factor F” en Escherichia coli

F+ F+

X +
F- F+

30
 F+: Células de E.coli que contienen el factor F.
F-: Células E.coli que no contienen el factor F.
El cruce de células F+ de E.coli con células F- da lugar a dos células de E.coli ambas F+.
Los Plásmidos conjugativos pueden transmitirse de una célula a otra sin que la célula
donadora los pierda.
Los “Plásmidos conjugativos” se transmiten de forma “infecciosa” en las poblaciones
bacterianas; si introducimos una célula F+ en un cultivo F- de E.coli, al cabo del tiempo
todas las células del cultivo pasarán a ser F+.
 Proceso de conjugación:
El Plásmido conjugativo contiene genes que codifican proteínas que son las que
intervienen en el proceso de Conjugación. Por ejemplo, en el caso de E.coli, las células
F+ son capaces de formar un apéndice específico que se denomina “Pili sexual”.

El proceso consta de cuatro etapas:

1º. Etapa: la célula F+ de E.coli se une a través del Pili sexual a una célula F-.

Pili sexual

Conjugación Bacteriana

2º. Etapa: el Pili sexual se retrae y las dos células quedan unidas a través de lo que
se conoce con el nombre de puente sexual. Puente sexual

31
 3ª Etapa: implica la transferencia del Factor F. Esta transferencia ocurre a través
de un mecanismo que se conoce cómo “Mecanismo de círculo rodante”, que comienza
con la rotura de una de las cadenas del Factor F en un punto específico que se conoce
cómo “origen de transferencia” (ORIT). A partir del ORIT, la cadena que se ha roto
empieza a pasar a la célula receptora. Este proceso de transferencia está facilitado por la
ADN Polimerasa de la célula donadora y de la célula receptora. La ADN Polimerasa de
la célula donadora utiliza cómo molde la cadena intacta del Factor F para sintetizar una
cadena complementaria y, al avanzar, va desplazando a la cadena rota hacía la célula
receptora. Cuando esta cadena entra en la célula receptora la ADN Polimerasa de la
célula receptora la utiliza cómo molde para sintetizar una cadena complementaria.
Es un mecanismo que facilita la transferencia de la cadena de abierta de ADN
del factor F, tanto por desplazamiento de la ADN Polimerasa de la célula donadora
cómo por tracción de la ADN Polimerasa de la célula receptora.

ORI T

Al final de esta etapa queda un Factor F intacto en la célula donadora y dos

cadenas lineales del Plásmido en la célula receptora.
4ª Etapa: consiste en la circularización del Factor F en la célula receptora y separación
de las dos células, siendo ya las dos F+. Es un proceso de replicación Semiconservativa,
porque cada una de las células tiene una cadena original y una cadena de nueva síntesis
en su factor F.

32
 La transmisión de un plásmido conjugativo, como puede ser el factor F en
E.coli, no constituye en sí misma un proceso de recombinación genética, ya que no se
transmiten genes del cromosoma de la célula donadora.

 Recombinación genética mediada un Plásmido conjugativo:

Se puede producir porque muchos plásmidos conjugativos son también
plásmidos integrativos, por ejemplo el Factor F también es integrativo. Por tanto, el
Factor F puede estar de Forma Normal o Integrado en el cromosoma, en ambos casos
se trataría de células F+.

Si el Factor F está integrado en el cromosoma, el cromosoma se convierte en un

“enorme plásmido conjugativo”, porque pasa a tener un origen de transferencia y
además tiene todos los genes que codifican las proteínas necesarias para el proceso de
conjugación.

La conjugación, en este caso, es un proceso en el que, en teoría, sería posible

transferir todo el cromosoma de la bacteria donadora a la bacteria receptora. Es un
proceso idéntico, pero en lugar de transmitirse el Factor F se transferiría el cromosoma

33
completo de la bacteria donadora, incluyendo el Factor F. Sin embargo, en la práctica
no ocurre así. El puente sexual es bastante inestable, y para la transmisión de todo el
cromosoma serían necesarios más de 70 minutos y el puente sexual sólo es capaz de
mantener su integridad durante unos pocos minutos, permitiendo el paso de,
únicamente, un trozo del cromosoma de la célula donadora a la célula receptora.

La célula donadora reconstruye la cadena rota y la célula receptora, tiene un

trozo de cromosoma de la bacteria donadora, junto con un trozo de Factor F, que puede
integrarse en su cromosoma.

En este caso Si se ha producido transferencia de ADN cromosómico, por lo que

se trata de un verdadero proceso de Recombinación. Pasan solamente los genes que
están cercanos al sitio de integración del Factor F en el cromosoma. La célula receptora
no será F+ al final del proceso, continuará siendo F-, ya que solamente habrá pasado un
trozo de Factor F con parte del cromosoma de la célula donadora, y no el Factor F
completo.
A las cepas de E.coli en cuyas células el Factor F esta integrado en el cromosoma se les
denomina cepas “HFR” (High Frecuency Recombination), cepas de alta frecuencia de
recombinación.

* Factor F’ en E.coli:
Como ya hemos dicho, el Factor F es un plásmido conjugativo e integrativo. De igual
forma que se puede integrar en el cromosoma de la célula, puede desintegrarse del
mismo, lo que en el 99% de los casos ocurre de forma limpia. Sin embargo, en el 1% de

34
 los casos el Factor F al desintegrarse se lleva consigo un trozo del cromosoma de la
célula, que será el que más próximo se encuentre al lugar de integración.

Cromosoma
Bacteriano
Factor F

A este Factor F que al desintegrarse se lleva consigo genes del cromosoma, se le

denomina Factor F’. Este Factor F’ puede transmitirse fácilmente de una célula a otra
por conjugación, lo que se conoce cómo proceso de “Sexducción”. La sexducción
recuerda remotamente a la transducción especializada en la que por ejemplo el ADN del
fago puede también desintegrarse anómalamente, llevándose consigo genes del
cromosoma.

“Proceso de SEXDUCCIÓN”

Conexión entre las células

mediante el Pili sexual

Replicación y transferencia del

Factor F’

35
  Tipos De Plásmidos:
Una vez visto el concepto de Plásmido y como los plásmidos conjugativos
intervienen en la recombinación genética, vamos a hablar, a modo de ejemplo, de tres
tipos de plásmidos (hay muchos más) clasificados de acuerdo con las características que
confieren a las células que los contienen:

1) Factores R o factores de resistencia: confieren a las bacterias que los

contienen resistencia a uno o varios antibióticos. Tienen una enorme importancia desde
el punto de vista clínico. Son Plásmidos que contienen genes que codifican enzimas que
destruyen o modifican la molécula que constituye el antibiótico.
 Ejemplos:
a) β-Lactamasas: son enzimas que degradan específicamente el anillo β-
lactámico, que es la estructura central de penicilinas y derivados.
Cuando una bacteria produce una β-Lactamasa, ésta degrada las penicilinas y
sus derivados, confiriendo resistencia a la bacteria frente a este tipo de antibióticos.
b) CAT cloranfenicol acetil transferasa: es un enzima que acetila la
molécula del cloranfenicol, inactivándola, por lo que las bacterias que secreten este
enzima serán resistentes al cloranfenicol.

 Estructura molecular de los Factores R:

Para explicar la estructura típica vamos a ver un ejemplo, el Factor R 222 de E.coli.
Está formado por dos componentes:
a) Factor de transferencia de resistencia (RTF): es un Plásmido
conjugativo, responsable de que las resistencias se propaguen de una bacteria a otra. El
problema es que los Plásmidos que confieren resistencia a antibióticos se transfieren de
forma “infecciosa”. Si hay una sola célula resistente en un cultivo ésta transmitirá la
resistencia de forma que al cabo de cierto tiempo todas las células del cultivo serán
resistentes.
b) Determinantes R: son Transposones que se caracterizan porque
contienen uno o varios genes que codifican proteínas o enzimas que confieren
resistencia a un antibiótico en particular. Cada determinante R confiere resistencia a un
antibiótico en particular.

36
Por tanto, cada Factor R contiene:
a) RTF
b) uno o varios Determinantes R.

Por ejemplo, en el caso de R 222

R1
R1 Resistencia a Sulfamidas
R2 R2 Resistencia a Cloranfenicol
RTF

R222 Determinantes R R3 Resistencia a Eritromicina

R3 R4 Resistencia a Tetraciclina
R4

El Factor R222 de E.coli presenta un RTF y cuatro Determinantes R. Si una de estas

cepas de E.coli produce una infección, esta infección será difícil de tratar, ya que será
una cepa “multiresistente”. De hecho, cada vez es más frecuente la aparición de cepas
resistentes a varios antibióticos por efecto de Factores de Resistencia. Este tipo de
cepas plantean un problema muy grave desde el punto de vista clínico llegando al punto
de infecciones que no se pueden tratar con ningún antibiótico conocido.
Los Factores R estaban presentes en la naturaleza antes de que los antibióticos
se empezasen a utilizar en clínica. Su origen es probablemente evolutivo, apareciendo
por primera vez en bacterias que compartían nicho ecológico con hongos productores de
antibióticos. Cuando hongos y bacterias coinciden y han de utilizar los mismos
nutrientes para crecer, las bacterias llevan siempre las de ganar por que se dividen cada
30 minutos mientras que un hongo necesita horas. Evolutivamente algunas especies de
hongos acabaron secretando antibióticos para inhibir el crecimiento de las bacterias y
también evolutivamente algunas bacterias desarrollaron mecanismos, mediados por la
presencia de plásmidos, que les permitían secretar enzimas que inactivaban los
antibióticos. La presión selectiva generada por el uso masivo y generalizado de los
antibióticos durante los últimos 60 años ha hecho que, lo que era un fenómeno
restringido a determinadas cepas, de determinadas especies bacterianas, en
determinados nichos ecológicos, sea hoy en día un fenómeno generalizado.

2) Factores Bacteriocinogénicos: son Plásmidos que contienen genes que

codifican una Bacteriocina, una proteína de secreción que es tóxica para otras células de

37
la misma especie que no contengan el mismo factor Bacteriocinogénico. Son proteínas
tóxicas, producidas por las bacterias para competir con bacterias de la misma especie.
Los Factores Bacteriocinogénicos contienen el gen que codifica la Bacteriocina y,
obligatoriamente, deben contener un gen que codifica el supresor de la Bacteriocina,
que es una proteína que inhibe la acción de la bacteriocina. De otra manera las células
que produjesen la bacteriocina serían las primeras en morir.

3) Plásmidos Toxigénicos:
Son Plásmidos que contienen genes que codifican proteínas de secreción que son
tóxicas para el ser humano. Los Plásmidos Toxigénicos son factores de virulencia.
Dentro de una misma especie bacteriana, aquellas cepas que contengan un Plásmido
Toxigénico serán virulentas, de lo contrario no lo serán. Un buen ejemplo de esto son las
cepas enterotoxigénicas de E.coli. E.coli es habitante habitual del intestino, por lo que
normalmente no es un microorganismo virulento, pero existen cepas que si que lo son,
algunas de ellas debido a la presencia de Plásmidos Toxigénicos que contienen genes
que codifican una enterotoxina muy potente que cuando se libera en la mucosa intestinal
da lugar a un cuadro diarreico.

38
 Tema 6.-“Ingeniería Genética”

La Ingeniería genética se engloba dentro de la Biotecnología, que se puede definir

como el uso de organismos vivos o sus derivados para llevar a cabo procesos químicos
definidos de aplicación industrial. Se pueden dar dos definiciones alternativas del
concepto de Ingeniería Genética:
1. Cualquier manipulación artificial que implique la creación de moléculas híbridas de
ADN a partir de ADNs de especies diferentes. Por esta razón se le suele llamar
metodología del ADN recombinante.
2. La introducción, mantenimiento y expresión artificial de genes de una especie en
células de otra. El ejemplo clásico de esto seria la introducción, mantenimiento y
expresión del gen de la insulina humana en Escherichia coli para producir insulina
recombinante.

La Ingeniería genética ha sido posible gracias al desarrollo o a la purificación de cuatro

herramientas básicas a lo largo de los años 70 del siglo pasado. Estas herramientas
son:

1- Los enzimas de restricción.

Son enzimas que se encuentran en las células bacterianas. Forman parte del sistema de
restricción modificación que se encarga de degradar ADN exógeno. Cada especie
bacteriana posee enzimas de restricción característicos que reconocen una secuencia de
ADN determinada, normalmente palindromica de 6 pares de bases y la cortan. A esta
secuencia se le denomina "diana" de restriccion. Los enzimas de restricción se
denominan de acuerdo con la especie de la que se aíslan, por ejemplo EcoRI, de E.coli,
o SmaI, de Serratia marcescens. Los que se utilizan en Ingeniería Genética son de clase
II y dependiendo del enzima pueden cortar el ADN dejando extremos cohesivos o
extremos romos.

Extremos cohesivos, por ejemplo EcoRI

.....GAATTC..... ......G AATTC.............
.....CTTAAG..... .....CTTAA G.............

39
Extremos romos, por ejemplo SmaI
......CCCGGG....... ......CCC GGG........
......GGGCCC....... ......GGG CCC........

Los enzimas de restricción reconocen una secuencia concreta, que se encuentra

distribuida aleatoriamente una serie de veces en los cromosomas y la cortan,
independientemente de que se encuentre en un fragmento de ADN humano o en el ADN
de una bacteria. Fragmentos de ADN que han sido cortados con el mismo enzima de
restricción son compatibles entre si, pueden ligarse. En el caso de fragmentos de ADN
con extremos romos, pueden siempre ligarse entre si. Por tanto es posible cortar trozos
de ADN de distintas especies y posteriormente empalmarlos entre si para dar lugar a
moléculas de ADN recombinante.

2 - Ligasas
Son enzimas que se encargan de unir los extremos del ADN digeridos por los enzimas
de restricción, cuando estos extremos son compatibles. Las que se utilizan son de origen
vírico (T4DNA ligase).

3- Vectores de clonación
Son plásmidos artificiales, compuestos de fragmentos de ADN de distinto origen y que
permiten que el fragmento de ADN exógeno que contiene el gen que nos interesa sea
estable y se exprese en las células que actúan como hospedadoras. Un vector de
clonación típico para E.coli, por ejemplo pUC18/pUC19, consta de cuatro elementos
básicos.
a) Un origen de replicación (ORI R). Es lo que le confiere al plásmido la capacidad de
replicación autonoma de forma que cada vez que la célula se divida, cada una de las
células resultantes reciba copias del plásmido. El ORI R más utilizado para E.coli es
el del factor colicinogénico Col E1.
b) Un marcador de resistencia, es decir, un gen que confiera resistencia a un
determinado antibiótico. La resistencia al antibiótico nos permitirá diferenciar las
células de E.coli que contengan el vector de las que no lo contengan. Normalmente
se utiliza el gen AMP que codifica una -lactamasa que confiere resistencia a
Ampicilina. Este gen se ha obtenido de un factor R.

40
c) Un marcador de selección. Normalmente el gen LACZ, que se obtiene del operón
lac. Este gen confiere, a las células que contienen el vector, actividad -
galactosidasa.
d) Un sitio múltiple de clonaje (SMC). Es una secuencia de ADN de unas 60bp,
introducida artificialmente en el centro del gen LACZ, sin interrumpir su secuencia
codificante, que consiste en las dianas de restricción para una serie de enzimas de
restricción. La particularidad del SMC es que estas dianas son únicas en el vector.
Es decir tratando el vector con cualquiera de estos enzimas de restricción lo único
que se hace es abrir, linearizar el vector. Es en este SMC donde se introducen los
fragmentos de ADN exógeno, se digiere el vector con un enzima de restricción y se
liga el vector con un fragmento de ADN exógeno digerido con el mismo enzima
para que tenga extremos compatibles. La introducción de este ADN exógeno en el
SMC implica la inactivación del gen LACZ, por lo que las células que contengan un
vector con inserto no tendrán actividad -galactosidasa.

4- Métodos de transformación artificial

Estos métodos permiten la transformación artificial de E.coli y otros organismos que no
son transformables de forma natural. Básicamente permiten introducir en las células el
ADN recombinante. Los métodos que se utilizan son:
Para E.coli, tratamiento de las células con ClCa2 en frio.
Para Saccharomyces cerevisiae, tratamiento de las células con ClLi.
Para cualquier tipo de células, Electroporación. Consiste en poner las células y el ADN
a transformar en una celdilla que se encuentra en un campo eléctrico alternante. El
cambio rápido de polaridad desorganiza los fosfolípidos de la membrana permitiendo la
entrada del ADN.

A modo de anécdota, se puede decir que la ingeniería genética, la metodología del ADN
recombinante, nació en 1972 a partir de una reunión entre Stanley Cohen, de la
Universidad de Stanford, y Herbert Boyer, de la Universidad de California en San
Francisco. El grupo de Cohen estudiaba los plásmidos bacterianos y el de Boyer
trabajaba en la caracterización de los enzimas de restricción. En un congreso en
Honolulu, en 1972 ambos coincidieron y se dieron cuenta del potencial de combinar el
uso de los enzimas de restricción para cortar fragmentos de ADN, con los plásmidos
bacterianos, para poder introducir estos fragmentos de forma estable en bacterias. La

41
colaboración entre ambos grupos dio lugar al nacimiento de la metodología del ADN
recombinante.

Una vez descritas las herramientas básicas necesarias vamos a ver las etapas de la
clonación de un gen eucariota en Escherichia coli. El objetivo último de este proceso
es el aislamiento de una colonia de E.coli que contenga un vector de clonación que lleve
insertado en el SMC un gen eucariota concreto.

1- Aislamiento de los genes eucariotas. Puesto que los genes están en el ADN de los
cromosomas, podría por ejemplo aislarse ADN cromosómico y trocearlo utilizando
enzimas de restricción para dar lugar a fragmentos que podrían insertarse en
vectores de clonación abiertos con el mismo enzima. Esta aproximación no puede
utilizarse en la práctica por dos razones: i) el enzima de restricción reconoce dianas
específicas que están distribuidas al azar, por tanto puede cortar por la zona
codificante de los genes. ii) los genes eucariotas tienen intrones. Para que un gen
eucariota pueda expresarse en una célula procariota tiene que estar libre de intrones.
Lo que se hace en la práctica es purificar el ARNm de las células. La transcripción
en eucariotas da lugar a la síntesis de un pre-ARNm que contiene todavía intrones,
pero antes de que este pre-ARNm abandone el núcleo, sufre un procesamiento por
nucleásas específicas que eliminan los intrones para dar lugar a un ARNm maduro
sin intrones. Por tanto, se purifica este ARNm y se convierte en ADN de doble
cadena en el tubo de ensayo añadiéndole transcriptasa inversa. A estas moléculas de
ADN de doble cadena que proceden de moléculas de ARNm se les denomina ADNc
(c de copia). De esta forma se consigue una colección de ADNcs que representan la
secuencia codificante, libre de intrones, de los genes más expresados en las células
de las que se ha aislado el ARNm. Estos ADNcs tienen extremos romos.
2- El vector de clonación se digiere por el SMC con un enzima de restricción que deje
extremos romos (por ejemplo SmaI). Esto da lugar a una población de moléculas de
vector abiertas y dispuestas a ligarse con las moléculas de ADNc.
3- Ligación de las moléculas de vector con las moléculas de ADNc en tubo de ensayo
en una reacción catalizada por la ligasa. De esta forma se obtiene una colección de
miles de moléculas de vector que contiene cada una de ellas un ADNc (que
corresponde a un gen eucariota) distinto insertado en su SMC. También, muchas

42
 moléculas de vector no atrapan ningún ADNc y simplemente se vuelven a
recircularizar por efecto de la ligasa.
4- Transformación en células de E.coli, mediante un método de transformación
artificial. Generalmente tratar las células con CaCl2 en frío y ponerlas luego en
contacto con el ADN. Una parte de las células serán transformadas con moléculas de
vector que lleven un ADNc como inserto, otra parte lo serán con moléculas de
vector vacías (sin inserto) y otra parte no se transformarán.
5- Selección. La finalidad de esta última etapa es aislar una colonia de E.coli que
contenga un vector que lleve como inserto la molécula de ADNc correspondiente al
gen que nos interesa. Esta colonia será un clon y por tanto habremos conseguido el
clonaje de un gen eucariota en E.coli. Esta etapa tiene tres fases.
5.1- Seleccionar transformantes de no transformantes. Esto se consigue sembrando en
placas que contengan Ampicilina después de la transformación. Los transformantes
(independientemente de que el vector que lleven dentro lleve inserto o no) crecerán
puesto que la presencia del vector confiere resistencia a la Ampicilina.
5.2- Seleccionar transformantes que contengan vectores con inserto de los que solo
contengan el vector religado. Esto se consigue sembrando en placas que contengan un
sustrato cromogénico de la -galactosidasa. El más popular es el conocido como X-
GAL, que cuando es procesado por la -galactosidasa da lugar a un producto de color
azul que precipita alrededor de las colonias. Las colonias que contengan un vector con
inserto no cambiaran de color, puesto que el inserto habrá inactivado la -galactosidasa
al introducirse en el MCS (como es lógico se utilizan cepas de E.coli en las que el
operón Lac esta inactivado), mientras que las colonias que contengan el vector religado
sin inserto serán azules por encontrarse el gen de la -galactosidasa intacto. Las
colonias que interesan son las blancas que contienen insertos. Estas colonias se pasan a
otras placas. Los pasos 5.1 y 5.2 se hacen conjuntamente sembrando en placas que
contengan Ampicilina y X-GAL.
5.3- Seleccionar el transformante que contenga un vector que lleve como inserto el
ADNc que corresponde al gen que estamos buscando. Para conseguir esto hay dos
posibilidades.
5.3.1. Utilizar anticuerpos específicos que reconozcan la proteína codificada por el gen
que estamos buscando. La condición para esto es que el gen se exprese en E.coli. La
técnica consiste en transferir las colonias a nitrocelulosa e incubar la replica en

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nitrocelulosa con el anticuerpo específico marcado colorimétricamente o
radiactivamente. El anticuerpo marcará específicamente la colonia que contenga el
vector que lleve como inserto el gen que estamos buscando. La colonia, el clon, podrá
aislarse de la placa original.
5.3.2. Utilizar un fragmento de ADN (sonda) que corresponda al gen. Esta sonda,
marcada colorimétricamente o radiactivamente, hibridará específicamente con la
colonia que contenga el gen que estamos buscando. Para ello, como en el caso anterior,
se transfieren las colonias a membranas de nitrocelulosa y se incuban con la sonda. La
colonia que sea marcada podrá recuperarse en la placa original.

De esta forma se obtienen colonias (clones) de E.coli que contienen en su interior genes
eucariotas concretos, se dice que se ha "clonado un gen".

Este proceso que acabamos de describir es un proceso “clásico”, en uso hasta mediados
de la década de los 90 del siglo pasado. A partir de ese momento, los programas de
secuenciación sistemática permitieron determinar la secuencia completa de los
genomas de una gran variedad de organismos: virus, bacterias, levaduras, plantas y
animales, incluyendo la secuencia completa del genoma humano. La posibilidad de
conocer de antemano la secuencia del gen que se quiere clonar permitió que, antes de
terminar el siglo, la mayor parte de los procesos de clonaje se hiciesen amplificando los
genes específicos mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando
cebadores sintéticos (primers), que hibridan con las zonas 5´y 3´del gen a clonar.
Cuando se trataba de clonar genes eucariotas (con intrones), normalmente se combinaba
una etapa de transcripción inversa con la amplificación con PCR (RTPCR). Finalmente,
en los últimos años, la técnica más utilizada, si se conoce la secuencia de gen a clonar,
consiste en sintetizar los genes “in vitro” en un proceso totalmente automatizado que
realizan maquinas de síntesis, con un precio de unos 50 céntimos de euro por base.

Aplicaciones de la Ingeniería Genética

1.- Producción de proteínas de interés farmacológico en microorganismos

1.1. Hormonas
El ejemplo más clásico es la insulina. Hasta 1982 se extraía de páncreas de cerdo. La
insulina de cerdo difiere tan solo en un aminoácido de la humana, en algunos casos esto

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era suficiente para dar lugar a reacciones inmunológicas. A partir de 1982 se comenzó a
comercializar insulina humana recombinante producida en E.coli. Otro ejemplo es la
hormona del crecimiento humana. Se utiliza para tratar niños con enanismo hipofisário.
Hasta 1985 la poca que podía obtenerse se extraía de la hipófisis de cadáveres. Esto hizo
que muchos niños tratados desarrollaran enfermedad de Creutzfeld Jakob, por
contaminación de la hormona con priónes. A partir de este año se comercializa la
hormona del crecimiento humana recombinante obtenida en E.coli. Desaparece el riesgo
de contaminación por priónes y se pueden obtener cantidades ilimitadas. Otras
hormonas recombinantes comercializadas son los factores de crecimiento óseo y
epidérmico.
1.2. Moduladores del sistema inmune. Interferones (alfa, beta, gamma) todos los que se
utilizan en clínica son recombinantes. Lo mismo ocurre con las interleucinas (IL1, IL2,
IL3) y el factor necrosante de los tumores.
1.3. Proteínas sanguíneas. Por ejemplo el activador tisular del plasminógeno, que es una
proteína que disuelve trombos y que se puede utilizar en la prevención y tratamiento del
infarto de miocardio. Se comercializó en 1987. Otro ejemplo son los factores de
coagulación, VII, VIII y IX, comercializados ya en su mayor parte, al igual que la
eritropoyetina y la seroalbúmina.

2. Producción de vacunas. Se pueden utilizar como vacunas antígenos proteicos de un

microorganismo patógeno producidos por la metodología del ADN recombinante. El
clásico ejemplo de esto es la vacuna de la hepatitis B que consiste en el HBsAg
producido en Saccharomyces cerevisiae y que es la vacuna recombinante de mayor
difusión. Se están ensayando vacunas para citomegalovirus, colera, rabia, VIH......

3. Animales y plantas transgénicas. Aunque claramente fuera del campo de la

Microbiología, son animales o plantas que expresan genes de otras especies. Se ha
conseguido por ejemplo cerdos con hemoglobina humana. También el caso de "Polly",
una oveja clónica (como Dolly) pero además transgénica que produce en su leche
antitripsina , un enzima humano cuya carencia causa la Fibrosis Quistica, una
enfermedad mortal. También, en plantas de tabaco se ha conseguido expresar
anticuerpos humanos, o toxinas para insectos, por no hablar de la soja o el maíz
transgenicos.

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4. Terapia génica. También lejos de lo que se puede considerar Microbiología aunque
hay virus que se pueden utilizar como vectores. Hay muchas enfermedades que se deben
a mutaciones a veces hereditarias que inactivan determinados genes. La terapia génica
consiste en reemplazar el gen defectuoso por un gen funcional para curar la enfermedad.
Para ello hay que conseguir hacer llegar los genes hasta las células, pueden utilizarse
por ejemplo retrovirus o adenovirus como vectores. La primera aplicación de este tipo
ocurrió en 1992, consiguiendo curar a dos niñas deficientes en Adenosina Desaminasa,
un enzima cuya carencia produce inmunodeficiencia.

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