TEMA 8.

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Apuntes teoría

2º Ingeniería Genética

Grado en Biotecnología

Facultad de Ciencias Experimentales

UAL - Universidad de Almería

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su
totalidad.
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TEMA 8:VECTORES Y HOSPEDADORES EUCARIOTAS.

ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS (OGMs)
Métodos de transformación de células vegetales.
Los protoplastos son las células vegetales sin pared celular, y para ello hay que inhibir la
sintesis de la pared añadiéndole fármacos.
- Electroporación: someter a una diferencia de potencial importante que abre los poros
en la membrana para que el ADN entre rápido en la célula, es relativamente fácil. Esto
se utiliza mucho con levaduras y con bacterias.
- Fusión de liposomas: basta con tener un ADN en emulsión, se agita en una sustancia
que sea bipolar y se obtienen moléculas englobadas en partículas esféricas.
- Micro-inyección: debe ser una pipeta muy fina. Hay máquinas especiales para hacerlas
o se pueden hacer a mano: se calienta un tubito de vidrio en un mechero bunsen, se le

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va dando vueltas al vidrio para que se caliente todo por igual, y se va estirando.
En animales es relativamente fácil, pero en células vegetales, hay un problema y es la pared
celular. Cuando pinchemos la célula con la pipeta, la pared va a quedar dentro de esta y eso es
un inconveniente.
- Agroabcterium: bacteria fitopatógena, que se utiliza mucho en ingeniería genética.
Tiene un inconveniente, hay organismos en los que no funciona bien, el mecanismo
molecular por el que funciona es relativamente complicado.
- Biolística: disparamos el ADN que queremos llevar a la célula en partículas de un
mineral que sea lo más inerte posible.
La biolística tiene algunos problemas, si se dispara con aire comprimido que no
necesita mucha energía, la presión del aire en la partícula hace que la célula se
expanda y reviente. Por eso todos los disparos hay que hacerlos en vacío (en un
acamara donde se hace vacío y se dispara un gas inerte comprimido). Hay que hacer
primero experimentos para ajustar la velocidad y la fuerza.
Cuando un ADN llega al citoplasma de una célula, si no es reconocido como patogénico, tiene
señales quimiotácticas que lo llevan al núcleo. Si la célula lo reconoce como patogénico se
disparan nucleasas que lo degradan.
Hay experimentos que demuestran que, si no es reconocido como patógeno, el ADN migra al
núcleo. Dichos experimentos consistían: ADN marcado con fluorescencia (fluoresceína) es
pinchado en el citoplasma y a los pocos segundos toda la fluorescencia está en el núcleo, hay
señales quimiotácticas en los receptores de la membrana nuclear que guían al ADN hacia el
interior del núcleo.

Ejemplo de organización génica en humanos.

Para el gen de la insulina humana, podemos hacer la
construcción genética mediante fusión de liposomas,
microinyección, etc. Cogiendo de ese gen humano lo que
sabemos que es el promotor, el exón 1, el 2, etc.
Normalmente hay un símbolo que indica el inicio de la
transcripción y el sentido de esta (que es la flecha que está
pintada en la imagen). Si cogemos el fragmento de ADN y lo
sometemos a algunos de los métodos de transformación
¿se transcribirá?
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Construcciones genéticas
¿Se transcribirá?
No, porque los promotores son específicos de las
especies por lo tanto no se transcribirá. Las
características del promotor humano no son las mismas
que las que hay en una planta.
Tendríamos que cambiar la construcción, poner un
promotor específico de la especie o del grupo de
organismos que queremos manipular para que lo
reconozca. Habría que hacer lo mismo con el terminador
de la transcripción. El promotor 35S es un promotor
muy usado en ingeniería genética, es el promotor del
virus del mosaico de la coliflor, la razón de su uso es que
ese promotor funciona muy fuerte en casi todas las

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células y tejidos vegetales. (Promotor de transcripción constitutiva). El terminador también es
muy efectivo en todas las células de los vegetales, asegura que la ARN polimerasa no pase.
Se producirá un ARN heterogéneo nuclear y la pregunta es: ¿Será procesado el ARNm humano
en la planta?
Las señales de procesamiento de intrones también son específicas de cada especie. En el
procesamiento de intrones intervienen casi 20 proteínas. Entonces la
respuesta es también NO
Para poder quitarlos (intrones) tenemos que purificar esos ARNm, se hace
de una forma muy similar a como se purifican los plásmidos, mediante
cromatografía de afinidad en gel de sílice, columnas que abajo tienen un gel
de sílice, cuando hay sales: el ARN se pega al gel de sílice, y cuando
quitamos las sales: el ARN se suelta. Aquí se hace igual, solo que se hace
con cromatografía de afinidad en columnas de oligo dT- celulosa.

Método de Gubler y Hoffman de síntesis de cDNA.

Describieron un método que sintetizan cDNA a partir del RNA. En este caso no bastan con la
síntesis de la primera cadena. Para la síntesis de la primera cadena hace falta la acción de una
transcriptasa inversa que utiliza como molde ARN y es capaz de sintetizar ADN, hay que utilizar
un cebador que puede ser genérico y un oligo dT.
Hay un inconveniente y es que la transcriptasa no es progresiva, y eso quiere decir que de cada
ARNm que tengamos se va a producir una batería de moléculas (unas más largas que otras). El
siguiente paso es tratar con una ARNasa H, la cual degrada los híbridos de ARN-ADN, se utiliza
la ADN pol I para que utilice estas móleculas de ADN como cebador y comience la síntesis de
ADN en cada una de las mellas que se forman, entonces se producirán cadenas de ADN de
cadena doble gracias a la T4 ADN ligasa.

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¿Se pueden usar otros cebadores?

SI, se pueden utilizar otros cebadores que no sean oligo dT, todos los que sean equivalentes a
los ARNm.

Contrucciones genéticas

¿Será traducido en la planta el ARNm con sólo el ORF del gen

humano?
Si, depende del uso diferencial de los codones.

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¿Será traducido el RNAm humano en la planta?

Uso diferencial de los codones para serina en distintos organismos

Cada especie cuando hay más de un codón para un aminoácido tiene sus codones “favoritos”.
Hay diferencias si comparamos el maíz con S. cerevisiae, en el maíz los codones más
abundantes es el UGC que tiene un 22% y S. cerevisiae lo usa en un 1%. Lo que está reflejando
es que cantidad de T-RNAs tiene en una célula. Puede que reproduzcamos un cDNA perfecto
que se traduzca fatal porque el uso de codones no es el de la especie.
- Expresión transitoria: Cuando hacemos una célula transgénica, esperamos a ver qué
ocurre con la transcripción de ese gen, ver que ocurre en el genotipo, tras la
traducción, etc.
- Expresión estable: Cando quiero que el transgen se exprese y que se herede en las
siguientes generaciones.
Cuando queremos que ocurra una expresión estable, se suele utilizar Agrobacterium.

Interacción agrobacterium-célula vegetal

En Agrobacterium, la expresión
estable, hace que el transgen se
inserte en el núcleo de forma
eficiente.
Agrobacterium es un fitopatógeno
que funciona hasta en hongos. Es
una bacteria Gram +, que se siente
atraída por las heridas de las células
vegetales. Cuando una célula
vegetal tiene una herida libera
compuestos polifenolicos (se ve
arriba) que son oxidantes y
Agrobacterium se mueve hacia la
fuente de los compuestos
polifenolicos, entonces agro se pega

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a las células con todas las proteínas que se ven ahí, se pega en la herida y se ancla a la célula.
Los compuestos polifenólicos son activadores transcripcionales de genes denominados vir, se
desencadena un proceso por el cual el agrobacterium inyecta parte de su material genético, no
del cromosoma bacteriano, sino de un plásmido enorme que tienen estas bacterias. Esta
bacteria crea tumores en la planta. El plásmido se llama Ti. No inyecta todo el DNA, inyecta
solo una parte del plásmido Ti, lo que se denomina T-DNA, el ADN que se transcribe con un
mecanismo molecular. La proteína VIRD2 del operón VIR sirve de cebador, da un 3´OH libre

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para que la ADN polimerasa comience a sintetizar una molécula de ADN de cadena sencilla y
luego actúa la VIRE2 que recubre a esa molécula de cadena sencilla, en esas condiciones esta
molécula viaja hasta el núcleo por canales que forman las proteínas VIRB, entran dentro del
citoplasma y allí son reconocidas por proteínas receptoras de la célula vegetal, se reconocen
por la membrana nuclear, entra y se inserta en el cromosoma vegetal.

Plásmido Ti moderno
Los plásmidos Ti son inmensos, son plásmidos de más de
200kb. Los de la izquierda son marcadores selectivos.
Tiene un origen de replicación para E. Coli y para
Agrobacterium Tumefaciens. Las diferencias
microbiológicas son muy importantes. En condiciones
óptimas E. coli se divide en 20 min; mientras que
Agrobacterium tiene un tiempo de división de horas. Las
manipulaciones del plásmido, por tanto, se llevan a cabo
en E. coli, y después este se introduce en Agrobacterium,
encargado de la transformación.
El T-DNA moderno está especialmente diseñado para
hacer ingeniería genética. Contiene un promotor constitutivo y un gen de resistencia a un
antibiótico. El fragmento de ADN que se inserte entre LB (left border) y RB (rigth border) se va
a transferir.
El agrobacterium tiene un plásmido Ti defectivo donde el T-DNA se ha quitado, se puede
considerar un “helper”.
Hace tiempo, grupo de investigadores holandeses se dieron cuenta de que obtener plantas
transgénicas era complicado por la manipulación de plásmidos Ti, debido a su gigantesco
tamaño. Se les ocurrió entonces utilizar vectores binarios: utilizar un plásmido Ti defectivo (con
los genes vir, pero con la región del T-DNA interrumpida, de modo que es inviable, o
directamente sin T-DNA) y en otro plásmido más pequeño incorporar únicamente el T-DNA.
Esto permite incorporar nuestra construcción en un plásmido mucho más pequeño, fácilmente
manipulable.
Plásmido binario genérico
“cambia”, es una organización que se ha
desarrollado una batería de plásmidos binarios
disponibles para los investigadores. El diseño
general de sus vectores está en la imagen de
abajo. El plásmido contiene un origen de
replicación de E.coli y otro de Agrobacterium y un
marcador selectivo (resistencia a antibióticos
generalmente). Puede introducirse también un
gen que aporte estabilidad al plásmido para
cuando este sea transferido a Agrobacterium.
Por otro lado, contiene el T-DNA con la
construcción genética que queramos introducir en
el vegetal.
También puede contener un sitio de conjugación
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pensado para producir la conjugación de E. coli y otros microorganismos.

Un ejemplo real de este tipo de plásmidos es el plásmido pD991. Es bastante grande y tiene un
T-DNA particular: presenta un promotor 5’mas (promotor de cultivo en plantas), un gen ntpII
(que aporta resistencia a kanamicina) y el terminador 3’mas (potente terminador). Además,
contiene un gen chivato, que nos indica donde se ha insertado el gen: GUS, es lo más parecido
al operón LacZ de bacterias, pero en plantas (con un sustrato artificial, β-glucuronidasa, hace
que las células vegetales, cuando se expresa produzcan un color azul). El T-DNA presenta
también un promotor mínimo: CaMV (un promotor mínimo es la mínima expresión que se
necesita para que algo se transcriba, es decir, unión del factor de transcripción TATA a la caja
TATA).

Normalmente hay que hacerle una herida porque se necesitan las señales polifenólicas que

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inducen a los genes VIR. Después de poner el agrobacterium en presencia de esas células
heridas, esas células se ponen en presencia de kanamicina, para comprobar las que son
resistentes y por tanto capaces de vivir de las que no lo son.
En lugar de hacer heridas, podemos insertar a agrobacterium mediante con biolística y poner
dichas células en presencia de kanamicina. Las células no transformadas se empiezan a
blanquear y las resistentes a kanamicina se ponen verdes y a partir de esto podemos saber si
esas células son transgénicas.
¿Con un promotor mínimo se expresará el gen GUS?
Dependiendo del entorno en el que se introduce el T-DNA, GUS se transcriba o no. es decir, si
cae cerca de una región heterocromática, GUS no se trasncribirá, mientras que se cae en una
región eucromática (en la que los genes se están transcribiendo activamente), entonces si se
transcribe.
Si se encuentra en un gen que se expresa sólo en el estigma pues solo se pigmentará el
estigma, si cae en un gen que se expresa en los ovarios pues solo se pigmentaran los ovarios,
etc. A esta construcción se le llama trampa de intensificadores.
Si las plantas recién transformadas son la primera generación transgénica ¿cómo serán sus
descendientes?
Para saberlo, se realiza una autofecundación, en la que se obtienen las siguientes
proporciones: ¼ homocigotas transgénicas (TT); 1/2 hemicigotos (con un alelo transgénico,
tiene T-DNA, y el otro alelo normal, sin el transgén, T0);
1/4 acigotas (ambos alelos normales, no son transgénicas, 00). De aquí se deduce que la
primera generación siempre es hemicigótica.

Plásmido binario para transformar construcciones

Ejemplo del plásmido pCAMBIA2300 con 8742kb, es muy
grande. Hay un gen que hace que el plásmido se estabilice
(pVS1-Sta) y que no sea recombinogénico.
El pBR322 bom site es el sitio de conjugación ¿esto qué
es?
Que tengan el plásmido F1 con el pelo y se produzca la
´”reproducción” de la bacteria. Si forzamos las
condiciones, la conjugación puede ocurrir entre E. coli y
otros y no solo entre E.colis.
Siempre tiene que tener promotor y terminador. El
T-DNA ya tiene un marcador selectivo (el promotor 35S,
muy fuerte, constitutivo).

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LacZα con un múltiple colon inside. Eso quiere decir que en el plásmido en su configuración
nativa si le ponemos x-gal las bacterias serán de color azul. Solo tenemos que hacer nuestra
construcción y añadirle un promotor y un terminador, siempre.

Transformación de Hongos (TKC)

En el caso de los hongos, se persiguen todas aquellas transformaciones genéticas que no son
viables en bacterias y plantas. Fundamentalmente hablamos de producción de antibióticos o
de producción de proteínas recombinantes.
Los métodos para obtener hongos transgénicos son casi iguales a los de las plantas:
- Transformación de protoplastos
- Electroporación: a partir de células competentes, en el hongo se hacen agujeros en la
pared celular para que el ADN sea capaz de entrar. En caso de no ser reconocido como
patógeno es enviado al núcleo.

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- Agrobacterium tumefaciens: también funciona con hongos, aunque hay que alterar un
poco el sistema para que actúe de forma eficaz. Si Agrobacterium es capaz de acoplase
a él, introduce le T-DNA. Por tanto, todas las construcciones que hemos visto en
plantas son válidas para hongos.
- Fusión de liposomas: para su introducción se utilizan campos magnéticos.
- Virus: se intenta hacer construcciones víricas que contengan ADN de interés en el
interior de la cápsida.
- Nanomateriales: se está estudiando la posibilidad de generar partículas con una
estructura a mitad de camino entre los liposomas y los virus, es decir, generar una
partícula inerte que tenga afinidad por alguna molécula del hongo.
Exceptuando la transformación de protoplastos, el electroshock y Agrobacterium, los otros
métodos son de tipo experimental, que están descritos en determinadas especies y de los que
existe un protocolo, pero que no se utilizan demasiado.
Otro método para la transformación genética en hongos, muy novedoso y avanzado, es le
Trans-Kingdom Conjugation (TKC). En este método se intenta aplicar el sistema de conjugación
bacteriana de E. coli a hongos para que este funcione entre hongos y bacterias.
Los vectores utilizados para este método necesitan:
- Un origen de replicación para E. coli (pues la bacteria donde se va a llevar a cabo la
manipulación del plásmido).
- Un marcador selectico de E. coli.
- Marcadores selectivos del hongo. En el caso de hongos, los marcadores selectivos casi
siempre son genes que codifican para la síntesis de algún compuesto (como por
ejemplo algún aminoácido o alguna base nitrogenada). Lo que se trata es de convertir
a un hongo auxótrofo en protótrofo (un hongo que es incapaz de sintetizar un
compuesto, mediante esos genes, la adquiere la capacidad de producción)

Métodos de obtención de animales transgénicos

Genéricos
- Microinyección: Se provoca una sobreovulación en las hembras, se extraen los óvulos y
son fecundados in vitro. Se inyecta el nuevo gen en el núcleo del óvulo y este se
reintroducen en las hembras. El porcentaje de éxito es muy bajo por lo que se
necesitarán muchos óvulos. Es un método muy genérico y aplicable a multitud de
especies. La inserción de ADN ocurre al azar.

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Específicos
- Retrovirus: Es un método específico (se necesita un conocimiento de la relación virus-
hospedador). La inserción ADN también ocurre al azar. Primero se elige un virus
benigno y se atenúa hasta eliminar su carga viral, se inserta el transgén que se quiere
introducir, y cuando el virus comienza a replicarse en el interior de las células libera el
transgén. Tiene un alto riesgo de infecciones por virus atenuados, reacciones adversas,
etc. La controversia más grande está en los retrovirus y retrotransposón. Los
transposones son elementos genéticos autónomos que se mueven por sí mismos por
el genoma y los retrotransposones son más parecidos a un retrovirus (capacidad de
moverse de una célula a otra). Son capaces de llegar a la célula y retrotranscribirse y,
que la copia generada se inserte en el genoma de la célula.
- Células madre embrionarias: Cuando las células están en cultivo es posible llevar a
cabo modificaciones genéticas específicas como la eliminación o sustitución de un gen.
- Blastocisto: consiste en inyectar células modificadas en embriones en fase de

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blastocito. Dicho embrión en esa fase, es implantado en una madre adoptiva. los
individuos resultantes serán quiméricos. Es un método que tiene más éxito

Ratones KO
Un ratón knockout o ratón KO es un ratón modificado por ingeniería genética para que uno o
más de sus genes estén inactivados mediante una técnica llamada bloqueo de genes. Su
propósito es comprender el papel de un gen que ha sido secuenciado pero del que se
desconoce su función o se conoce de forma incompleta. Inactivando el gen y estudiando las
diferencias que presenta el ratón afectado, los investigadores pueden inferir la probable
función de ese gen.
Para llevar a cabo este bloqueo debemos tener el gen que deseamos reemplazar (Gen)
flanqueado por dos secuencias específicas (Seq1 y Seq2).

Se hace una construcción que contenga una nueva copia del gen (Gen) y un gen selectivo que
confiera resistencia a antibióticos (neo), ambos flanqueados por las secuencias específicas
(Seq1 y Seq2), junto con el gen Timidina Kinasa (tk), que en presencia de ganciclovir, mata a la
célula.

Si ocurre recombinación específica (homóloga) entre las Seq 1 y Seq 2, el gen se sustituye por
el que nosotros hemos hecho y el gen tk se pierde, y el individuo se vuelve resistente a
ganciclovir y a neo.

Utilidades de los animales transgénicos

Tiene entre otras, aplicación sobre animales de granja, colaborando de forma importante en la
mejora de la producción. La incorporación del gen de la hormona del crecimiento tras un
promotor inducible, ha dado algún resultado importante en peces. La alteración de la
composición proteica de la leche de vaca, cabra u oveja o la mejora de la lana producida por
ovejas transgénicas son otros ejemplos. Igualmente, esta metodología tiene aplicación en la
prevención de enfermedades (inmunización in vivo). De la leche de cabra y oveja se han
podido aislar diferentes proteínas humanas. Se han producido cerdos transgénicos que llevan
en su sangre las cadenas de globulina humana.

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