Tema-7.

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EvaCholbi

Principios, Instrumentación y Metodología en Biología Celular y

Bioquímica
1º Grado en Biología

Facultad de Ciencias
Universidad de Málaga

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 PIM Bioquímica. Tema 7.
Hibridación y PCR

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DNA
El DNA es bicatenario con cadenas antiparalelas, se lee en sentido 5’-> 3’. Las cadenas se unen entre sí mediante puentes de hidrógeno entre las
distintos bases nitrogenadas, formándose dos puentes entre la timina (T) y la adenina (A), y tres entre la guanina (G) y la citosina (C). Sus ácidos
nucleicos absorben a la longitud de onda de 260 nm (las proteínas lo hacen a 280 nm), en el rango de luz ultravioleta. El DNA, como ya sabemos,
puede desnaturalizarse si se dan las condiciones indicadas (aumento de Tª, de pH…) haciendo que los puentes de hidrógeno se rompan
Southern blot
Con este sistema podemos reconocer moléculas específicas de DNA. Primero ponemos
una mezcla en el buffer, la cual irá subiendo a lo largo del papel cromatográfico del
aparato por capilaridad. Esta pasará también por el gel de agarosa, donde se encuentra
el DNA. Así, el DNA se moverá hasta el papel/membrana de nitrocelulosa, ordenándose
por tamaño, y moviéndose más rápido los más pequeños. (Dará lugar a una imagen
especular de este)

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Luego, se procede a desnaturalizar el DNAbc, mediante la adición de una disolución alcalina al gel, haciendo que una de las hebras se copie en la
membrana de nitrocelulosa. También hay que producir una sonda marcada, una molécula de DNA/RNA que sea capaz de hibridar con un fragmento
del DNA de restricción del ensayo anterior (para detectar un gen concreto), funcionando como primers (crean extremos 3’-OH libres) A este se le
añade DNApol (bacteriana y estable) unida a un isótopo radiactivo (52P-dATP, marca y carga)
Por tanto, el DNAmc se hibridará, y se elegirá un genoma específico, el cual se corta por partes formando secuencias polindrómicas (se leen igual
desde ambos sentidos) Este genoma específico es el que formará la sonda.
Por último, tras crear la cadena complementaria, se separa la sonda por calor, y se añade al filtro de nitrocelulosa, para ver qué cadenas hibridan
con las del papel mediante la incubación. Lavamos y eliminamos las que no se hayan unido, y se transfieren las moléculas del filtro a una película
auto-radiográfica con el numero de genes del papel.
Northen blot
Con esta técnica podemos reconocer moléculas específicas de RNA. Al RNA no suele hacer falta desnaturalizarlo, ya que normalmente es
monocatenario. Este pasará por las distintas electroforesis (como en Southern blot), llegando a transferirse a una membrana. Se genera una sonda
marcada, la cual se une directamente, se incuba para que se de la hibridación, se lava y se eliminan las partes que no hayan hibridado. Luego se
transfieren las moléculas a una película auto-radiográfica.
PCR
Las técnicas de PCR consisten en una amplificación exponencial de la información genética, en la cual se van a multiplicar las moléculas de DNA. Es
muy útil poder sacar a partir de una muestra pequeña, otra mucho más grande (por esto mismo deben ser reacciones muy ajustadas, porque si no,
cualquier error que se cometa se verá también amplificado)
Es una técnica de dos ciclos, donde el primero consta de tres fases:
- Desnaturalización: se separan las hebras del DNA mediante el aumento de la temperatura (se aumente hasta los 93-95°C)
- Hibridación: se usan cebadores específicos para hibridar ciertas zonas y en un determinado número de bases (en sentido 5’-3’) Esto
ocurre a una temperatura específica (50-65°C) que depende del cebador (a mayor tamaño, mayor temperatura)
- Elongación: añadimos una DNApol, la cual se une al cebador y sintetiza las cadenas complementarias de DNA a una temperatura de 72°C
(en el caso de una bacteria termófila)
El segundo ciclo consta de la separación, la hibridación y la elongación. Aquí se llega a cuatriplicar la cantidad de DNA, gracias a la cadena
complementaria que se ha hecho respecto de la inicial.
Gracias a los cebadores, que se unen a zonas específicas, ahora tenemos mayor cantidad de cierto trozo de molécula, siendo su amplificación
exponencial. Estos trozos pueden cuantificarse (q PCR)

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Usos de las PCR:

La vida son experiencias, Cuenta Smart

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