Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Maria Juliana Garzón Villarreal, Daniel Alejandro Gonzalez Li Puma, Lesly Alejandra Roa Barbosa

Resumen:
En esta práctica de laboratorio se realizó la reacción en cadena de la polimerasa
comprendiendo las bases teóricas de esta técnica, para esto en dos microtubos se agregaron
las cantidades de los reactivos mostrados en la Tabla N°1 ;uno de los microtubos se utilizó
para observar el componente experimental, y el otro para tener el control negativo; al
finalizar de agregar se mezcló durante 5 segundos en el vortex para homogeneizar la mezcla,
se configuró el termociclador con las especificaciones mostradas en la Tabla N°2 esto con el
fin de que se consigan las condiciones ideales para que la reacción en cadena de la
polimerasa, al finalizar los 35 ciclos se procedió a visualizar por medio de electroforesis en
un gel de agarosa al 1% en TBE 0,5X. Como resultado se obtuvieron
2 35 = 3, 4359973837 x 1010 copias de ADN.

Palabras clave: ​Reacción en cadena de la polimerasa, ADN,​ ​Electroforesis.

Resultados:
Los resultados obtenidos se pueden evidenciar en el apartado Anexos.

Discusión:
El diagnóstico de enfermedades infecciosas ha sido revolucionado por el desarrollo de
técnicas moleculares como la PCR [1], la reacción en Cadena de la Polimerasa creada y
desarrollada por Millis y col. es un método enzimático in vitro que permite la amplificación
de una secuencia específica de ADN a partir de un conjunto complejo [2], cuya reacción
depende de tres fases: en primer lugar la desnaturalización del ADN para separar las dos
cadenas de ADN a 94°C, en segundo lugar se produce una disminución de la temperatura
para que los cebadores se unan por complementariedad al ADN molde (Fig. 1), esta segunda
fase se conoce como hibridación [3], normalmente la temperatura se encuentra entre 35°C y
60°C, en tercer lugar y por último se considera que en la fase de extensión, la enzima
polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir del extremo 3’ libre de la región
donde se han hibridado los cebadores, principalmente la temperatura depende de Taq
polimerasa la cual suele ser de 72°C (Tabla 2), dado a que es estable térmicamente. Estas tres
fases pertenecen a un ciclo de la PCR y pueden repetirse “n” veces, duplicando en cada ciclo
el número de cadenas delimitadas por los oligos [4], es decir que se genera una amplificación
exponencial o logarítmica, en nuestro caso sometimos la muestra de ADN a 35 ciclos de
PCR, por lo tanto obtendremos 2 35 = 3, 4359973837 x 1010 copias de ADN.
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Maria Juliana Garzón Villarreal, Daniel Alejandro Gonzalez Li Puma, Lesly Alejandra Roa Barbosa

Fig. 1​. Unión de los cebadores al ADN molde

En un solo ciclo de ADN se obtiene únicamente una copia de un pequeño fragmento de ADN
molde, donde los fragmentos generados no tienen el mismo tamaño [3], por consiguiente la
PCR se completa realizando 35 ciclos como se mencionó anteriormente, si se analiza lo que
sucede a partir del primer ciclo se comprueba que tras varios ciclos se forman fragmentos con
tamaños limitados por los puntos hibridados por los cebadores (Fig. 2), es decir que tras
transcurrir varios ciclos más, los fragmentos mayoritarios serán limitados en sus extremos por
los cebadores. Los cebadores o primers de PCR son secuencias específicas que entre más
largos, mayor es su especificidad y selectividad, sin embargo también será mayor la
temperatura de hibridación, la cual depende de la temperatura de fusión cuyo valor es la
mitad de las hebras de ADN desnaturalizadas y de la composición de las bases, por lo tanto el
cebador tendrá como mínimo 15 bases para asegurar su especificidad, generalmente se
encuentran entre 17 a 28 bases de longitud [5].
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Maria Juliana Garzón Villarreal, Daniel Alejandro Gonzalez Li Puma, Lesly Alejandra Roa Barbosa

Fig. 2.​ Formación de fragmentos con tamaños hibridados por cebadores

Ahora bien si se quiere saber si la PCR funcionó, la electroforesis en gel es una técnica
utilizada para separar fragmentos de ADN por su tamaño y carga, básicamente consiste en
aplicar una corriente a través de un gel, el cual posteriormente se debe poner en una cámara
donde los grupos fosfatos del esqueleto azúcar-fosfato le otorgan una carga negativa a las
moléculas de ADN [6] y se moverán hacia el polo positivo, es decir que conforme corre el
gel, los fragmentos más cortos de ADN viajaran más rápido a través de los poros del gel que
los fragmentos más grandes, por consiguiente los fragmentos más cortos estarán más cerca
del extremo positivo del gel. Cuando el gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN y se
coloca bajo la luz UV, los fragmentos brillarán (Fig. 3) donde una línea de ADN bien
definida se llama banda y cada una contiene gran cantidad de fragmentos del mismo tamaño,
de tal modo la banda que representa el fragmento más largo se encuentra en el carril 1 y la
banda del fragmento más corto será el carril 2.
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Maria Juliana Garzón Villarreal, Daniel Alejandro Gonzalez Li Puma, Lesly Alejandra Roa Barbosa

Fig. 3.​ Electroforesis en gel

Conclusiones:
● La reacción en Cadena de la Polimerasa es un método enzimático in vitro que es muy
importante para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, este se basa en tres fases
que permiten la amplificación exponencial de cadenas de ADN.
● Dependiendo del número de ciclos utilizados para la amplificación de cadenas de
ADN, se obtendrán un número fijo de copias de ADN; en nuestro caso se obtuvo
como resultado 3, 4359973837 x 1010 copias del ADN inicial.
● Para poder evaluar la eficiencia de la PCR, se debe realizar un proceso de
electroforesis en gel; en este caso el gel se obtuvo con una solución de 100 mL con un
1% de Agarosa, el ADN amplificado obtenido se tiñó con el reactivo Cyber Safe ™ y
se realizó electroforesis a 100 voltios durante cinco minutos. Para evaluar la presencia
de ADN se tomó la Agarosa y se puso en un transiluminador con una lámpara de luz
UV que reaccionaba ante la presencia de cadenas de ADN

Bibliografía:
[1] ​Danielle Alves Gomes Zauli ( 2019). PCR y enfermedades infecciosas, biología sintética: nueva
ciencia interdisciplinaria, Madan L. Nagpal, Oana-Maria Boldura, Cornel Baltă y Shymaa Enany,
IntechOpen, DOI: 10.5772 / intechopen.85630. Disponible en:
https://www.intechopen.com/books/synthetic-biology-new-interdisciplinary-science/pcr-and-infectiou
s-diseases
[2] ​Garibyan, L., & Avashia, N. (2014). Polymerase Chain Reaction (PCR). Retrieved 8 November
2020, from ​https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4102308/
[3] Perez de Castro, A. Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR).
Retrieved 8 November 2020, from
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la
%20polimerasa.pdf
[4] Dorado Perez, G. Amplificación de DNA mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).
Retrieved 8 November 2020, from
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/44%20PCR.pdf
[5] Mattos, J. (2014). Diseño primers. Retrieved 8 November 2020, from
https://es.slideshare.net/sottam/diseo-primers
[6] Khan Academy. Electroforesis en gel (artículo) | Khan Academy. Retrieved 8 November 2020,
from
https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophore
sis/a/gel-electrophoresis

Anexos
Tabla N°1. ​Componentes del cóctel de reacción de PCR
Componente Experimental Control Negativo

Agua Milli-Q ™ 13,2 µL 15,5 µL

Amortiguador 10X 5 µL 5 µL
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MgCl​2​ 25 mM 4 µL 4 µL

Cebador 5´50 µM 5 µL 5 µL

Cebador 3´50 µM 5 µL 5 µL

dNTP´s 1.5 mM 15 µL 15 µL

ADN Molde 2,3 µL -

​ DN polimerasa 5
Taq A 0,5 µL 0,5 µL
U/µL

​ ondiciones de amplificación
Tabla N°2. C
Fase No. Ciclos Temperatura Tiempo

Desnaturalización 1 94 °C 3 Minutos

Desnaturalización 94°C 30 s

Alineamiento 25 a 35 T.M de los cebadores 30 s

Polimerización 72°C 1 Min por c/kpb a

amplificar

Extensión Final 1 72°C 7 Min