Universidad de Carabobo

Facultad de Ciencias de la Salud

Escuela de Ciencias Biomédicas y
Tecnológicas
Departamento de Microbiología

Tema 19:
Técnicas de Biología
Molecular

MSc. Liliana E Castro G

lilianae.castrog@gmail.com
 Tema 19: TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

CONTENIDO CONCEPTUAL CONTENIDO PROCEDIMENTAL

- Biología Molecular aplicada al - Define ácidos nucléicos,

Inmunodiagnóstico desnaturalización,
renaturalización, sondas e
- Hibridación de ácidos nucléicos hibridación.
- Southern Blot (ADN)
- Northern Blot (ARN) - De los diferentes métodos y
procedimientos conoce:
- Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):
- Modalidades: anidada (nested), semi-anidada - Fundamentos
(semi-nested), multiplex, RT-PCR, PCR en - Aplicaciones
tiempo real. - Ventajas y desventajas

- Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos

de Restricción (RFLP).

- Polimorfismo de la Conformación de Simple

Cadena (SSCP)

- Secuenciación automática.

- Estudio y Análisis de secuencias de ADN

(Bioinformática)
El concepto de “diagnóstico molecular” es un
término amplio que incluye Técnicas de biología
molecular en beneficio de la salud humana,
detectando y/o cuantificando secuencias
genéticas específicas de:

• ácido desoxirribonucleico (ADN),

• ácido ribonucleico (ARN) o
• proteínas.
Ácidos Nucléicos
 ADN
Es el nombre químico de la molécula que contiene
la información genética en todos los seres vivos.
Consiste en 2 cadenas que se enrollan entre ellas
para formar una estructura de doble hélice.

Cada cadena tiene una parte central

formada por azúcares (desoxirribosa)
y grupos fosfato.
Enganchado a cada azúcar hay una de
las siguientes 4 bases: adenina (A),
citosina (C), guanina (G), y timina (T).
Las 2 cadenas se mantienen unidas por
enlaces entre las bases;
la adenina se enlaza con la timina,
y la citosina con la guanina.

La secuencia de estas bases a lo

largo de la cadena es lo que codifica
las instrucciones para formar proteínas y moléculas de ARN.
ADN
ADN
ADN
 ARN
El ácido ribonucleico es una molécula de cadena sencilla.

Una hebra de ARN tiene un eje constituido por un azúcar (ribosa)

y grupos de fosfato de forma alterna.
Unidos a cada azúcar se encuentra una
de las cuatro bases: adenina (A),
uracilo (U), citosina (C) o guanina (G).

Hay diferentes tipos de ARN en la célula:

ARN mensajero (ARNm),
ARN ribosomal (ARNr) y
ARN de transferencia (ARNt).

Más recientemente, se han encontrado

algunos ARN de pequeño tamaño que
están involucrados en la regulación de
la expresión génica.
DESNATURALIZACIÓN
RENATURALIZACIÓN
RENATURALIZACIÓN
 SONDA
 Es una secuencia de ADN o ARN de cadena simple que se utiliza
para encontrar su secuencia complementaria en el genoma de una
muestra.

 La sonda se coloca en contacto con la muestra bajo condiciones

que permitan que la secuencia de la sonda se hibridice con su
secuencia complementaria.

 La sonda está marcada con un marcador radiactivo o químico que

permite visualizarla.

 Estas sonda marcadas son utilizadas para buscar donde un ARNm

determinado se expresa en una célula o en un tejido.

 Se pueden utilizar para analizar el genoma, por ejemplo para

saber si hay copias extras de una región en particular, como a
menudo ocurre en los cánceres, o en ocasiones para constatar la
falta de copias de ciertas partes del genoma, lo que sucede en
algunos síndromes hereditarios y también en cáncer.
HIBRIDACIÓN
HIBRIDACIÓN
HIBRIDACIÓN
 HIBRIDACIÓN
Es un proceso por el cual se combinan 2 cadenas complementarias
simples de ácidos nucleicos (ADN o ARN) y se permite que formen
una única molécula de doble cadena por apareamiento de sus bases.
Se emplean sondas de ADN, para detectar la presencia de genes
específicos únicos para un virus en particular.

La Hibridación es parte de
muchas técnicas importantes
en el laboratorio como:
 Hibridación de
Northern blot (para ARN)
Southern blot (para ADN).
 PCR
 Método de Hibridación de ADN
ramificado (branched DNA)
• Para la cuantificación de ácidos nucleicos
(ADN o ARN).
• El proceso comienza con la hibridación de las
sondas de captura a una fase sólida.
• Reacción de hibridación: “sandwich” entre las
sondas de captura y el ADN o ARN en estudio
• Introducción de la sonda de amplificación que
contiene múltiples sitios para las sondas de
revelado, las cuales están conjugadas con moléculas
quimioluminiscentes.
• La cantidad de luz emitida es proporcional a la
cantidad de ADN o ARN hibridado
Método de Hibridación de ADN
ramificado (branched DNA)
Hibridación reversa
• LiPA es un ensayo de
sondas en una tira de
nitrocelulosa (Line Probe
Assay)

• Es un ensayo de
hibridación reversa
utilizando sondas de
oligonucleótidos con una
secuencia específica
(SSOP reversa)

• Permite un ensayo
multiparamétrico
 Hibridación reversa
Principio de Hibridación Reversa o LiPA

 El material de ADN biotinilado amplificado se desnaturaliza

químicamente, y las hebras separadas se hibridan con sondas de
oligonucleótidos específicos inmovilizadas en bandas paralelas sobre
tiras basadas en membranas.

 Esto va seguido de una fase de lavado astringente a fin de eliminar

cualquier material amplificado incorrectamente emparejado.

 Tras el lavado astringente, se añade estreptavidina conjugada

con fosfatasa alcalina, que queda ligada a cualquier híbrido
biotinilado que se haya formado con anterioridad. La incubación con una
solución de sustrato que contiene un cromógeno produce un precipitado
de color púrpura/marrón. La reacción se interrumpe mediante una fase
de lavado, tras la que se registra el patrón de reactividad de las
sondas.
 Hibridación reversa
En términos generales el proceso es el siguiente:
 El ADN se desnaturaliza, la hélice de doble cadena del ADN blanco
o diana es separada mediante un proceso físico (calor) o químico (con
una base fuerte, como la sosa cáustica). Esto rompe los enlaces por
puente de hidrógeno que mantienen unidas las dos hebras del ADN.
 Las hebras de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezclan con
una muestra de cadenas simples de secuencia conocida (sonda) que se
encuentra unida a un soporte sólido (como nitrocelulosa).
 La muestra combinada se enfría lentamente, las moléculas sencillas
se van emparejando por las zonas complementarias y se va formando
una nueva molécula hibridada. Durante la hibridación se produce la
unión de las moléculas diana con las moléculas sonda.
 El ADN blanco o diana está marcado con una molécula (biotina) que
al unirse a la sonda produce una reacción química. Esta reacción
produce un color característico y este color es señal de que el ADN
diana o blanco corresponde al microorganismo o gen buscado.
Hibridación reversa
 Hibridación reversa

http://www.innogenetics.com
 Técnicas para la Detección de
Ácidos Nucleicos
• Southern blot (ADN)
• Northern blot (ARN)
• Hibridación in situ
• PCR (convencional, multiplex, en tiempo
real, etc)
• Otros métodos moleculares: RFLP, branched
DNA, hibridación reversa, secuenciación
automática, microarreglos.
Las técnicas moleculares se usan regularmente para
confirmar resultados positivos que arrojan las pruebas
serológicas debido a su alta sensibilidad y especificidad.
 Técnicas para la Detección de
Ácidos Nucleicos
Los altos valores de sensibilidad y de especificidad de la
técnicas de diagnóstico molecular, junto con lo rapidez con
la que se pueden obtener los resultados las han
transformado en las técnicas de elección para el
diagnóstico de enfermedades infecciosas y en muchos
casos se consideran los estándares de oro (gold standard)
para el diagnóstico de patologías infecciosas, sobre todo
en infecciones virales, desplazando al cultivo como método
de referencia
 Southern Blot
Es una técnica de laboratorio utilizada para detectar una
secuencia específica de ADN en una muestra de sangre
o tejido.

Pasos de la técnica:
 Una enzima de restricción se utiliza para cortar una
muestra de ADN en fragmentos que se separan mediante
electroforesis en gel.
 Los fragmentos de ADN son transferidos del gel a la
superficie de una membrana.
 La membrana se expone a una sonda de ADN marcada
con un marcador radiactivo o químico.
 Si la sonda se une a la membrana, entonces la
secuencia de la sonda está presente en la muestra.
 Southern Blot
El protocolo fue desarrollado por Edward Southern.

 Se separan los distintos fragmentos

de ADN de acuerdo al tamaño en un gel a
lo largo de un campo eléctrico.
 Los fragmentos más grandes, migran
a la parte superior y los fragmentos más
pequeños se van a encontrar en la
parte inferior.
 Cuando se termina de correr el gel, se
realiza la transferencia a una membrana.
Es como hacer un sandwich: gel, membrana
en la parte superior y muchas toallas de papel.

 Lo que se busca es permitir que una

solución haga que el ADN que se encuentra
en el gel pase a la membrana.
Southern Blot
 ADN digerido Southern Blot
con Enzimas de
Membrana con el
Restricción Papel absorbente ADN transferido

Membrana

Fragmentos de
Tamaño (Kb) conocido Gel de
(ADN marcado) agarosa Soporte
Solución de Recipiente cerrado
Transferencia

Separación de los
Transferencia
Fragmentos de
ADN
Sonda marcada en
Buffer de hibridación
Hibridación

Bandas
ADN marcado, hibridadas
Detección Fragmentos de a la sonda
Tamaño (Kb) conocido
(Autoradiografía)
 Northern Blot
 Es una técnica de detección de moléculas
de ARN de una secuencia dada dentro de una
muestra de sangre o tejido.

 Para ello, se toma la mezcla de ARN y se

somete a una electroforesis en gel a fin de
separar los fragmentos de acuerdo con su
tamaño. Luego se transfieren a una
membrana que normalmente es de
nitrocelulosa.
La transferencia se realiza bien por:
 un gradiente salino o
 por transferencia electroforética
 Northern Blot
 La membrana se expone a una sonda de
ADN marcada con una etiqueta radiactiva
o química.
 Si la sonda se une a la membrana,
entonces la secuencia complementaria
de ARN está presente en la muestra.
 Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
• Permite la amplificación exponencial de una secuencia de
ADN molde, utilizando oligonucleótidos sintéticos
(secuencias cortas de ADN), cuyas secuencias
corresponden a la secuencia blanco y delimitan el
segmento de ADN a amplificar

• La temperatura de la muestra se sube y se baja

repetidamente para ayudar a la enzima de replicación
del ADN a duplicar la secuencia del ADN que está
siendo copiada.

• Con esta técnica se pueden producir un billón de copias

de la secuencia en estudio en sólo unas pocas horas.
 Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
•Es un proceso que permite fabricar un número ilimitado de
copias de cualquier gen.
•A partir de una sola molécula de ADN, la PCR puede
generar 100.000 millones de moléculas idénticas en una
tarde.
•Es una reacción sencilla que requiere un tubo de ensayo,
reactivos y una fuente de calor.
•La muestra de ADN que se quiere copiar no tiene que ser
pura, puede proceder de un tejido, de un cabello, de una
gota de sangre coagulada (crimen) o de una momia.
•Las técnicas usadas hasta el momento: uso de enzimas de
restricción, Clonación e Hibridación tienen el inconveniente
de ser procesos largos, caros y no sirven cuando el ADN
está desnaturalizado.
Reacción de PCR
 Pasos en una Reacción de PCR
1 2 3

Extracción
Recolección y del ácido Amplificación
preparación nucleico Detección
(Síntesis
(Electroforesis)
de la muestra (ARN o del ADNc)
ADN)

Este proceso tiene lugar en un Termociclador, un instrumento que

automáticamente controla y alterna las temperaturas durante períodos
programados de tiempo para el número apropiado de ciclos de PCR
(generalmente entre 30 y 40 ciclos).
 Reacción de PCR

5
30 ciclos 10 copias
Luego de 30
Ciclo 3 ciclos el ADN es
amplificado cerca
de un millón de
veces

Ciclo 2
Ciclo 1

Amplificación Exponencial
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Ciclos de PCR

Desnaturalización: 94oC
Las hebras de ADN se separan

Hibridación: 40-65oC
Los primers se unen al ADN

Extensión: 72oC
El nuevo ADN es sintetizado
Hay 7 componentes esenciales en el
proceso standard de PCR

• ADN polimerasa termoestable

• Oligonucleotidos iniciadores (“primers”)
• Desoxiribonucleótidos trifosfatados
(dNTPs)
• Cationes divalentes
• Buffer (para mantener el pH)
• Cationes divalentes
• ADN molde (Templado)
 Componentes de la PCR
10XPCR Buffer (Tampón) 5,0 μl
dNTP’s (4mM ) 2,5 μl
MgCl2 (25mM ) 3,0 μl
Cebador sentido (10pmol) 5,0 μl
Cebador antisentido (10pmol) 5,0 μl
Taq Polimerasa (5 U/μl) 0,25 μl
H20 28,25 μl
ADN 1,0 μl
Vf.: 50 µl

Final

Inicio
 El ciclo de PCR
• Desnaturalización - 94-95°C por 45 segundos si G+C < 55%
• Temperatura de hibridización (Annealing) – debe ser calculada o
determinada empíricamente para cada par de primers
demasiado alta = poco o nada de producto
demasiado baja = annealing no específico = productos incorrectos
• Extensión - a la temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada
ej.: 72°C para Taq
1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min
solo a partir del 3r ciclo son producidos ADN duplex de la longitud
deseada, los cuales a partir de allí se tornan en el producto principal
• Número de ciclos -
- algunos componentes se tornan limitantes después de 30 ciclos (si
el número inicial = 105 moléculas)
- se necesitan >25 ciclos para amplificar un gen de copia única a
partir de ADN genómico de mamífero DNA
 ADN molde (templado)
• Puede ser ssDNA o dsDNA (simple o
doble cadena)
• ADN circular y cerrado es levemente
menos efectivo que el ADN lineal
• Usualmente se utilizan varios miles de
copias, ej: 1 µg de humano, 10 ng de
levadura, 1 ng de bacteriano o 1 pg de
plasmídico
• Se puede amplificar a partir de una sola
molécula de ADN molde, pero las
condiciones deben estar muy optimizadas
 Oligonucleótidos iniciadores
(primers)
• Se conoce su secuencia
• Es el factor mas importante para la eficiencia y
la especificidad del proceso
• Deben estar presentes en exceso (1013 = 30
ciclos, 1 kb)
• Requieren de un cuidadoso diseño
• Reglas de diseño:
(a) longitud = 18-25
(b) Contenido de G+C entre 40-60%
(c) Evitar las secuencias repetidas
(d) Valores de Tm de no mas de 5°C uno
del otro
 ADN Polimerasas termoestables
• Llevan a cabo la síntesis de ADN dependiente del
templado.
• Estabilidad – Taq: 9 min at 97°C, Pwo >2 hr a 100°C
• Fidelidad – Taq: baja, Pfu: alta
• Algunas presentan actividad transferasa terminal en el
extremo 3´, ej. Taq agrega una A al extremo 3´,
especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli
generan extremos romos
• Cantidad usada = 5 x 1012 moléculas (1.5 unidades)
• La mas comúnmente usada = Taq ADN polimerasa
Taq (Thermus aquaticus), Pwo (Pyrococcus woesei), Pfu
(Pyrococcus furiosus), Tli (Thermococcus littoralis)
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

PCR es básicamente una técnica de

amplificación del DNA.

DNA
PCR
Muchas
(molecula sencilla) Amplificación moléculas
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

• Síntesis por DNA polimerasa

5’ 3’
• -T A C G
• -A T G C A T G C A T G C * *

Primers cortos de DNA específicos hibridizan con la

cadena que tiene que ser copiada
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

• Síntesis por DNA polimerasa

5’ 3’
• -T A C G T
• -A T G C A T G C A T G C * *
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

• Síntesis por DNA polimerasa

5’ 3’
• -T A C G T A
• -A T G C A T G C A T G C * *
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

• Síntesis por DNA polimerasa

5’ 3’
• -T A C G T A C
• -A T G C A T G C A T G C * *
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

• Síntesis por DNA polimerasa

5’ 3’
• -T A C G T A C G T A
• -A T G C A T G C A T G C * *
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
Después del primer período de síntesis de
DNA, tenemos copiada una cadena de DNA

Primer 1 Extensión de la cadena

Cadena original de DNA

¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN?

 PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a
alta temperatura (~100°C)
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a

alta temperatura (~100°C)
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva

cadena con la DNA polimerasa
2

Al mismo tiempo, la cadena original se copia

nuevamente, dado que hay un exceso de Primer 1

Ahora tenemos dos copias de la molécula original

 PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
Para controlar el proceso, necesitamos controlar la
temperatura

Fusión Hibridización Extensión de 2do Ciclo

95°C 50-60ºC la cadena 95ºC
75ºC 50-60ºC
75ºC
Primer Ciclo
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Múltiples ciclos darán un incremento exponencial
en el número de copias
 Evitar las secuencias repetidas
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 5’-NNNNNNNNTATA-3’
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 3’-ATATNNNNNNNN-5’

3´ repetido
5´ 3´ PCR
3´ 5´

5´ 3´
3´ 5´

Dímero de primer
 Evitar las secuencias repetidas
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 5´-TATANNNNNNNN-3´
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 3´-NNNNNNNNATAT-5´

5´ repetido
5´ 3´ PCR
3´ 5´

5´ 3´
3´ 5´

no hay extensión
 Evitar las secuencias repetidas
5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’ 5’-NNNNNNNNNNNGCA
5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-CGT

Formación de horquillas
5´ PCR
3´

5´
3´ 5´ 3´

Productos de PCR no deseados

Técnicas basadas en PCR (variantes)
RT-PCR:
Nested PCR:
detección
amplificación
de mRNA
de una
secuencia
dentro de otra
previamente
amplificada
PCR Multiplex:
diferentes
blancos en
forma
simultánea
PCR en tiempo
real:
cuantificación
de copias
iniciales–en
tiempo real
 Transcripción Reversa - PCR (RT-PCR):
Detección de la expresión de un gen por
presencia de mRNA

• Para amplificar copias de cDNA de RNA

• Es especialmente útil cuando solo se dispone de pequeñas
cantidades de RNA
• Frecuentemente usada para amplificar genes específicos
(como cDNAs) si algo de su secuencia es conocida
• Requiere primer “antisense” y un DNA polimerasa
dependiente de RNA
• Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNA
• Primero se hace un cDNA a partir del templado de ARN
• Luego se usa un segundo primer (“sense”) para hacer el
duplex de cDNA por PCR
Transcripción Reversa - PCR (RT-PCR)

• Transcripción reversa del ARN a

ADNc

• Utiliza la enzima Transcriptasa

Reversa:
• AMV: Virus de la Mieloblastosis Aviar
• M-MuLV: Virus de la Leucemia Murina
Moloney)

• La molécula de ARN va a ser

eliminada por una RNasa.

Ej: Detección de VIH (ADN pro viral),

Hepatitis C, Dengue, Rotavirus,
Norovirus, Astrovirus
 Transcripción Reversa - PCR (RT-PCR)
mRNA AAAAAAAAAA-3’ Primer Antisense:
(sense) TTTTTTTTTT-5’ oligo(dT)o

Transcripción reversa

GSP1 (sense)
AAAAAAAAAA-3’
TTTTTTTTTT-5’
1ra cadena cDNA
GSP (antisense)

PCR usando
GSP+GSP1
GSP1

GSP
Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar
GSP y GSP1
 Transcripción Reversa - PCR (RT-PCR)

•Permite el análisis por PCR del RNAm.

•Ventajas: Versátil, Sensible, Rápido.

•Usa RNA Total, y así elimina el paso de Purificación del

RNAm Poly (A)

•RT- PCR In situ: Cortes de tejido.

 PCR anidada o Nested PCR:
amplificación de una secuencia dentro de
otra previamente amplificada

• A veces 1 ronda de PCR no da un producto único a

partir de un templado complejo, apareciendo un
“chorreado”
• Se puede resolver utilizando un segundo par de
primers que hibriden un poco mas internamente que
los primeros
• Realizar una segunda ronda de PCR usando el producto
de la primera (chorreado)
• Rinde un producto único porque solo el fragmento
correcto de ADN posee los sitios correctos de
hibridización para el segundo par de primers
 PCR anidada o Nested PCR

1ª Ronda

2ª Ronda
ADN molde
primers 1ª ronda

primers 2ª ronda
 PCR anidada o Nested PCR
•Suele usarse cuando hay problemas con la cantidad y
calidad del templado a ser amplificado (muestras muy
diluídas o poco puras)
•La muestra es primero amplificada 20-30 Ciclos, usando
un set de primers externos.
•Luego una alicuota muy pequeña de ésta reacción es
amplificada por 2da vez durante 15 a 25 Ciclos usando un
set de primers internos.
•Estos primers internos se ubican dentro del DNA de modo
tal que la secuencia complementaria para el par de primers
internos está presente en el producto de PCR obtenido en
la primera reacción de amplificación y está disponible para
formar el complejo primer-templado.
PCR anidada o Nested PCR

1era PCR

Chorreado de ADN

2da PCR

ADN específico
 Multiplex PCR
• Describe una PCR en la cual hay
presentes múltiples pares de
primers (hasta 8) lo que da una
serie de productos. Los mismos
pueden verse como múltiples bandas
en un gel de agarosa
• PCR Multiplex es frecuentemente
usada en diagnóstico médico
• Ahorra templado, tiempo y gastos
• Requiere una cuidadosa optimización
 PCR Múltiple o Multiplex PCR:
diferentes blancos en forma simultánea

D2 1ª Ronda
D1

511pb

TS2 TS3 TS1

2ª Ronda
TS4

D1 Patrón
S1 S4 S3 S2 S2pb

119pb S2
290pb S3
392pb S4
482pb S1

Lanciotti et al., 1992

 MULTIPLEX Sample ID B1: p 1931

501

(MENINGITIS VIRALES)
Internal Control

CMV

HHV6
• Virus Herpes simple 1 y 2
EBV

• Virus Varicella zoster. HSV2

• Virus Epstein barr. VZV

HSV1
• Citomegalovirus.
• Herpes Virus Humano 6.

Sensibilidad= 102 copias/5 µL

Especificidad= 100%
 PCR en Tiempo Real (qPCR):
cuantificación de copias iniciales – en tiempo real-

•Amplificación robusta y confiable (TAQ Polimerasa)

•Alta especificidad y sensibilidad.
•Se cuantifica el producto de PCR en cada ciclo.
•Hay una alta correlación entre la señal y la cantidad de
Target.
•Alta precisión y exactitud.
•Posibilidad de PCR Multiplex.
•No requiere de análisis posterior a la PCR (Electroforesis,
etc)
•Se puede realizar un mayor número de reacciones por día
•Sistema a tubo cerrado (Control de contaminación)
•Amplio rango de amplificación
 PCR en Tiempo Real (qPCR)
•Diseño de primers y sondas más exigentes.
•Los productos de amplificación se observan a medida que transcurren
los ciclos de la PCR
•Se basa en:
-La detección y cuantificación de un reporter fluorescente, cuya
señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de
PCR en la reacción.
-El empleo de un Termociclador que tiene acoplado un sistema de
detección que es capaz de adquirir y cuantificar la señal emitida
por el reporter al final de cada ciclo para cada muestra
-La química de la detección está dada por:Reactivos fluorescentes
•Agentes intercalantes fluorescentes (SYBR GREEN)
 PCR en Tiempo Real (qPCR)
Molde
original Detección de Fluorescencia
PCR
Round 1

2X
Molde

PCR
Round 2

4X
• Monitoreo continuo de la
Molde amplificación
• El análisis de cuantificación
30-40 ciclos emplea valores de la fase
exponencial de la reacción
Ventajas de PCR en tiempo real

Simple, rápida, sensible (semi-automatizada)

No hay manipulación post-PCR

Eliminación de contaminación por amplicones

Cuantificación del ADN o ARN molde inicial

Detección de más de un producto específico en una

misma reacción
Otros Métodos
Moleculares
Con el creciente desarrollo tecnológico en el
área de la biomedicina, existen varias
plataformas que han demostrado un gran
impacto en la investigación biomédica que
lentamente se están incorporando a la
práctica clínica.
 Otros Métodos Moleculares

• Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos

de Restricción (RFLP)
• Hibridación de ADN ramificado
(branched DNA)
• Hibridación reversa
• Secuenciación de ADN
Polimorfismos:
 Variaciones naturales producidas en un gen, secuencia
de ADN, proteína o cromosoma que no tienen efectos
adversos sobre el individuo y tienen lugar con una
frecuencia bastante alta en la población general.

 Variación natural (polimórfica) de una secuencia de

ADN entre los individuos. Se visualiza porque se
suprimen o se crean nuevos sitios de restricción
(corte) en el ADN, que cuando es digerido por una
endonucleasa da lugar a fragmentos de ADN de
diferente longitud.

 Polimorfismos de conformación de cadenas sencillas:

Técnica para el rastreo de mutaciones que identifica
segmentos de ADN de cadena sencilla que muestran
un patrón de migración anormal en la electroforesis
en gel.
 Estudio de Polimorfismos Genéticos
 Un polimorfismo de un solo nucleótido o SNP (Single Nucleotide
Polymorphism) es una variación en la secuencia de ADN que afecta a
un solo nucleótido A, T, C o G del genoma. Por ejemplo, un SNP
puede hacer que la secuencia AAGCCTA pase a ser AAGCTTA.

 Una de estas variaciones debe darse al menos en un 1% de la

población para ser considerada como un SNP.

 Los SNP forman hasta el 90% de todas las variaciones genómicas

humanas, y aparecen cada 100--300 bases a lo largo del genoma
humano.

 Dos tercios de los SNP corresponden a la sustitución de una

citosina (C) por una timina (T).

 Estas variaciones en la secuencia del ADN pueden afectar a la

respuesta de los individuos a enfermedades, bacterias, virus,
productos químicos, fármacos, etc.
 Polimorfismo de un solo nucleótido
(SNP: single nucleotide polymorphisms)

 Ha tenido un fuerte impacto en la biomedicina.

 Se debe a la presencia de pequeños cambios

en el ADN, lo cual puede tener un gran impacto
en la respuesta frente a un fármaco,
un microorganismo o explicar una condición
patológica particular.
 Polimorfismo de un solo nucleótido
(SNP: single nucleotide polymorphisms)
El estudio de variantes genéticas y su impacto en
la salud humana ha llevado a plantear el concepto de
“medicina personalizada”, que consiste en entregar
un tratamiento adecuado al paciente (genoma) adecuado,
basado en que cada individuo presenta una genética
diferente y única.

Actualmente, se han descritos cientos de SNPs, muchos

de ellos de importancia clínica.
En un principio la detección de los SNPs se basó en
técnicas de RFLP-RPC, sin embargo, debido al gran
número de SNP's descritos para una condición en
particular, fue necesario utilizar otras plataformas
diagnósticas como los microarreglos de ADN o microarrays.
 Polimorfismo de un solo nucleótido
(SNP: single nucleotide polymorphisms)
 Los SNP son de gran utilidad para la investigación médica
en el desarrollo de fármacos.

 Debido a que los SNP no cambian mucho de una

generación a otra, es sencillo seguir su evolución en
estudios de poblaciones.

 También se utilizan en algunos tipos de pruebas

genéticas.

 Los SNP se consideran una forma de mutación puntual

que ha sido lo suficientemente exitosa evolutivamente
para fijarse en una parte significativa de la población de
una especie.
 Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos
de Restricción (RFLP)

(del inglés: Restriction Fragment Length Polymorphism)

Es una técnica de biología molecular que nos permite

detectar fragmentos de ADN de diferentes longitudes.

La técnica fue desarrollada por Sir Alec Jeffreys en 1985.

Actualmente la técnica es obsoleta, pero su uso fue amplio

durante muchos años por lo económica y exacta.
 Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos
de Restricción (RFLP)

• Consiste en la diferencia en tamaño de los

fragmentos de las pares de bases que resulta al
cortar una molécula de ADN, mediante el uso de
enzimas de restricción.

• Así una mutación puntual dentro del sitio de

restricción, resultará en la pérdida o ganancia de una
secuencia de reconocimiento, dando origen a un
fragmento de restricción de diferente longitud a la
del original.
• Las mutaciones causadas por una inserción, deleción
o sustitución en el ADN, también llevan a variación en
la longitud de los fragmentos de restricción.
 Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos
de Restricción (RFLP)
 En biología molecular, el término polimorfismos en la longitud de los
fragmentos de restricción o RFLP (del inglés Restriction Fragment
Length Polymorphism) se refiere a secuencias específicas de
nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las
enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de
restricción) y que varían entre individuos.

 Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de

distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN de diferentes
individuos de una población, por lo que se dice que la población es
polimórfica para estos fragmentos de restricción.

 La técnica RFLP se usa como marcador molecular para identificar:

 grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas
enfermedades genéticas,
 en ciencia forense,
 en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede mostrar
la relación genética entre individuos.
 Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos
de Restricción (RFLP)
Fundamento
Esta técnica se basa en la acción de las enzimas de
restricción, las cuales reconocen secuencias específicas de
nucleótidos del ADN y hacen un corte en la cadena.
Si exponemos dos cadenas que tengan diferentes alelos,
el corte de la misma enzima nos va a producir fragmentos
de ADN de diferentes longitudes.
Ya que los polimorfismos específicos de cada alelo
modificarán el reconocimiento por parte de la enzima y por
ende, su capacidad de corte.

Uso
En combinación con la electroforesis en gel o
Southern Blot se pueden apreciar patrones de bandeo
diferenciales entre individuos según los alelos que presenten
 Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos
de Restricción (RFLP)
Procedimiento:

1. Se extrae el ADN y se purifica. El ADN purificado puede ser

amplificado usando la técnica molecular PCR (Polymerase Chain Reaction).
2. Luego debe ser tratado con enzimas de restricción específicas para
producir fragmentos de ADN de diferentes longitudes.
3. Estas enzimas de restricción hacen un proceso de digestión restrictiva
en el cual reconocen cortas secuencias específicas en el ADN donde
cortan formando fragmentos de distintas longitudes.
4. Los fragmentos de restricción se separan mediante electroforesis en
geles de agarosa a través del cual se separan debido a un campo
eléctrico y su disociación obedece a la masa o a la carga eléctrica de
las muestras según la técnica utilizada.
5. Posteriormente se puede realizar un Southern Blot para hibridar y
marcar las cadenas obtenidas. Esto proporciona un patrón de bandas
que es único para un ADN en particular debido a la diferencia en las
secuencias del ADN en los individuos donde los sitios de restricción
varían.
Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos
de Restricción (RFLP)
original
fragmento
fragmentos
Polimorfismo de Longitud de los Fragmentos
de Restricción (RFLP)
Electroferotipos obtenidos por RFLP para cada
genotipo del Virus de Hepatitis C

Patrones de restricción obtenidos para cada genotipo del VHC

en gel de poliacrilamida.
 Aplicaciones RFLP
• Mapeo genómico (medición de tasas de
recombinación), identificación de cepas.
• Análisis de polimorfismo genético (mutaciones
puntuales funcionales)
• Determinación del riesgo-status de una
enfermedad
• Localización de genes en enfermedades genéticas
• Detección de variantes de cepas virales o
bacterianas: virulencia, patogenicidad, respuesta a
terapias.
• Estudios forenses, Pruebas de paternidad
 Polimorfismo de la Conformación
de Simple Cadena (SSCP)
Single-stranded conformational polymorphism (SSCP)

Es una técnica de rastreo de mutaciones basada en el

distinto comportamiento electroforético que presentan
las moléculas monocatenarias de ADN según su secuencia
en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante.

Al ser una técnica de rastreo o barrido es útil para

determinar de forma rápida la presencia de mutación,
pero no aporta información acerca de la mutación
concreta que presenta el ADN.
 Polimorfismo de la Conformación
de Simple Cadena (SSCP)

 Algunas implicaciones clínicas:

- La técnica SSCP se puede utilizar cuando las mutaciones están
distribuidas por todo el gen.
- El SSCP puede comprender el análisis de todo el gen o sólo de
regiones específicas.
 Secuenciación de ADN
Es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya
finalidad es determinar el orden de los nucleótidos
(A, C, G y T) que forman una cadena específica de ADN.
La secuencia de ADN constituye la información genética
heredable de un ser vivo.

El proceso de secuenciación más utilizado consiste en los siguientes pasos:

 Se preparan una mezcla que contiene cada uno de las nucleótidos (A,C,G y T),
una enzima que une estos nucleótidos (ADN polimerasa), un iniciador
o “primer”, que es una cadena pequeña de nucleótidos a partir de la cual
la enzima comienza la síntesis de las nuevas moléculas y terminadores de la
reacción (nucleótidos modificados llamados nucleótidos dideoxi, los cuales
están marcados con moléculas fluorescentes diferentes para cada uno de los
nucleótidos).
 Se agrega el ADN desnaturalizado (separado en cadenas simples), que nos
interesa conocer, en la mezcla de reacción para que la ADN polimerasa
lo utilice como molde y empiece a unir nucleótidos, produciendo así una serie
de fragmentos de ADN de diferente longitud marcadas fluorescentemente.
 Secuenciación de ADN
 Los fragmentos de ADN sintetizados y marcados son separados por
tamaño mediante electroforesis en un capilar con poliacrilamida.
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según
la movilidad de estas en un campo eléctrico. Esta movilidad depende
del peso de la molécula.

 El tamaño de las moléculas se diferencia solamente por un nucleótido,

y estas son detectadas por un láser, dependiendo del nucleótido
incorporado se detecta una emisión de luz a una longitud de onda
diferente según el fluoróforo unido al nucleótido.

 La aparición de una señal de luz en una posición concreta del

histograma nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN
está la base correspondiente al nucleótido marcado según la
emisión de luz detectada para el fluoróforo unido al mismo.
Secuenciación Automática de ADN
La secuenciación de nueva generación
(NGS: Next-Generation sequencing)

 Ha sido recientemente adaptada para su uso como

herramienta de diagnóstico molecular

 Las diferentes plataformas de NGS tiene la capacidad

de secuenciar una gran cantidad de material genético en
horas a diferencia de los métodos de secuenciación
tradicionales (Sanger) en los que se requerían días a
semanas.
Secuenciación Automática de ADN
Secuenciación Automática de ADN

 Las enfermedades infecciosas y cáncer son las áreas

donde se ha iniciado la implementación de estas
herramientas, principalmente en el estudio de brotes y
el diagnóstico de neoplasias, respectivamente.

 A diferencia de las plataformas ya existentes, la NGS

entrega una gran cantidad de información, la que debe ser
cuidadosamente analizada por bioinformáticos en conjunto
con el equipo médico para enfocar la búsqueda de lo que
se quiere diagnosticar.
 Aplicaciones de la secuenciación de ADN
• Detección de mutaciones
Localizar mutaciones previamente descritas o como método
de screening en la localización de nuevas mutaciones.

Mutación en cadena ß
Hb A - pro - glu – glu -
Hb S - pro - val - glu -

• Diagnóstico prenatal / Diagnóstico preimplantación

Diagnóstico de enfermedades hereditarias o

determinación del sexo del feto previamente a
su implantación en procesos de fecundación in
vitro.
 Aplicaciones de la secuenciación de ADN
• Identificación de especies linajes y genotipos.

• Estudios filogenéticos.

ADN mitocondrial
ADN ribosomal

Secuencias variables
Secuencias conservadas

• Secuenciación de ADNs fósiles

• Especimenes de descubrimientos
arqueológicos
Aplicaciones de la secuenciación de ADN
 Microarrays (microarreglos)… Era
postgenómica
Los microarreglos de ADN o microarrays:
Esta plataforma consiste en un chip compuesto de una
superficie sólida del tamaño de un portaobjetos a la cual
se une fragmentos de ADN, los que se unirán o no al
encontrarse con una secuencia de ADN complementaria
presente en la muestra a analizar.

En cada chip es posible analizar cientos

de SNPs en un lapso de un día (Chau y Thomas, 2015).
 Microarrays (microarreglos)… Era
postgenómica
• La palabra microarray deriva del griego mikro
(pequeño) y del inglés array (distribución
ordenada).

• Los microarreglos de ADN son soportes sólidos en

los cuales se encuentran inmovilizados, en un área
pequeña, cientos a miles de genes de manera
ordenada. Los soportes sólidos pueden ser
laminillas de vidrio para microscopio, laminillas de
silicón o membranas de nylon. En los microarreglos,
el ADN puede ser impreso, depositado o
sintetizado directamente sobre la superficie sólida.
 Microarreglos
• Combinan las técnicas de
hibridación de ácidos nucleicos
y la detección por
fluorescencia.

• Sólo en los puntos del portaobjeto donde

haya ocurrido hibridación habrá
fluorescencia y la intensidad de la
fluorescencia detectada será proporcional al
nivel de expresión del gen en estudio.
Aplicaciones de los microarrays
• Estudio de genes que se expresan
diferencialmente entre varias condiciones:
Sanos/enfermos, mutantes/salvajes,
tratados/no tratados.
• Clasificación molecular en enfermedades
complejas
• Identificación de genes característicos de una
patología (firma o “signature”)
• Predicción de respuesta a un tratamiento
• Detección de mutaciones y polimorfismos de
un único gen (SNP)