Laboratorio Nº2: PCR

INTRODUCCIÓN

En 1983, Kary Mullis en la Corporación Cetus desarrolló la técnica de biología molecular que revolucionó
la investigación genética y con esto ganó el premio Nobel en 1993. Esta técnica, llamada reacción de la
polimerasa en cadena (PCR), transformó la biología molecular en una herramienta de investigación
multidisciplinaria en un plazo de 5 años a partir de su invención. Muchas de las técnicas de biología molecular
usadas antes del PCR, eran laboriosas, consumidoras de tiempo y requerían un alto nivel de maestría técnica.
La técnica de PCR ha tenido un alto impacto en cuatro áreas principales: mapeo génico, clonación,
secuenciación del DNA y detección de genes. El PCR ahora se utiliza como una herramienta de diagnóstico
médico para detectar mutaciones específicas que pueden causar enfermedades genéticas, se utiliza en
investigaciones criminales para identificar sospechosos a un nivel molecular y ha sido una poderosa
herramienta en la secuenciación del genoma humano. Antes del PCR, el uso de las técnicas de biología
molecular para el diagnóstico terapéutico, forense, farmacéutico o médico no era práctico o rentable, el
desarrollo de la tecnología de PCR cambió estos aspectos de la biología molecular, convirtiéndola en una de
las herramientas más accesibles y más usadas en la investigación genética y médica.

El objetivo del PCR es producir una cantidad relativamente grande de un fragmento específico de DNA a
partir de una cantidad muy pequeña. Técnicamente hablando, esto significa la amplificación enzimática
controlada de una molécula de DNA que contiene una secuencia específica de interés y el templado puede
ser cualquier forma de DNA doble hebra como el DNA genómico. La amplificación por PCR requiere la
presencia de al menos una molécula de DNA templado.

Una de las razones principales que hacen de la técnica de PCR una herramienta de tan gran alcance es
su simplicidad y especificidad. Todo lo que se requiere es tampón de reacción, cuatro nucleótidos
(desoxinucleótido trifosfatos de adenina, guanina, timina y citosina), una DNA polimerasa, dos partidores o
cebadores y minúsculas cantidades del templado que se desea amplificar. La especificidad viene de la
capacidad de dirigir y amplificar un segmento específico de DNA (o de un gen) a partir de un genoma
completo.

La técnica de PCR hace uso de dos principios básicos:

1.- La hibridación por complementariedad del DNA.

2.- La síntesis de DNA por la DNA polimerasa.

La hibridación por complementariedad del DNA ocurre cuando dos diferentes oligonucleótidos (partidores)
se unen a sus secuencias complementarias respectivas en el templado. Los dos partidores son diseñados y
sintetizados en el laboratorio con una secuencia nucleotídica específica de manera tal que pueden unirse a
los extremos de la secuencia de DNA doble hebra que se amplificará. Antes de que una región de DNA pueda
ser amplificada, uno debe identificar y determinar la secuencia de una región río arriba y otra río abajo del
fragmento de interés. Estas regiones se utilizan entonces para diseñar los partidores que servirán como
puntos de partida para amplificar el DNA. Como se muestra en la Figura 1, el DNA doble hebra del fragmento
de interés es denaturado para separar ambas hebras antes de que la síntesis comience, para ello se usan
altas temperaturas (94ºC), luego la temperatura se baja para que se unan los partidores (64ºC). La DNA
polimerasa usada en PCR, debe ser una polimerasa termoestable debido a que para denaturar ambas hebras
del DNA se utilizan altas temperaturas (94 °C). La DNA polimerasa termoestable (Taq), que realiza la
polimerización, fue aislada de una bacteria termofílica (Thermus aquaticus), que vive a altas temperaturas en
forma natural y que funciona a 72ªC.
Las dos hebras se crean a partir del templado original en cada ciclo completo de la reacción. Esto crea
una situación de crecimiento exponencial. Una vez que el DNA de interés ha sido amplificado suficientemente,
este puede ser visualizado por electroforesis en geles de agarosa. Esto permite determinar la presencia o la

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ausencia de los productos de PCR deseados y que eventualmente podrían determinar las semejanzas y las
diferencias entre individuos.

Figura 1: Representación esquemática de la técnica de PCR

Se estima que solamente el 5% del DNA humano contiene genes, el otro 95% es DNA no codificante. Este
DNA no codificante se encuentra no solamente entre los genes sino que también en medio de ellos,
dividiéndolos en exones e intrones (Figura 2)

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 Las secuencias de los exones son similares entre individuos. Sin embargo, los intrones varían a menudo
de tamaño entre individuos. Son estas diferencias las que permiten que se pueda determinar la diversidad
genética humana. La identificación de estas características distintivas en el DNA representa la base molecular
para la genética humana de identificación y de poblaciones.

Figura 2: Transcripción y traducción de genes eucariontes

A través de la evolución, las secuencias de los intrones han sido el blanco de inserciones al azar por
elementos repetitivos cortos, también conocidos como SINES. Las SINES se han insertado aleatoriamente
dentro de nuestros intrones durante millones de años. Uno de estos elementos repetitivos son las secuencias
Alu. Ésta es una secuencia de DNA, de cerca de 300 pares de bases, que está repetida casi 500.000 veces
dentro del genoma humano. El nombre de Alu viene del sitio reconocido por la enzima de restricción Alu 1
que es común en esta secuencia.

Hay un elemento Alu presente dentro del intron 8 de un gen situado en el cromosoma 16 que codifica para
la proteína activador de Plasminógeno de tejido o TPA (Figura 3). Esta proteína ayuda a la ruptura de
coágulos. El gen TPA contiene 14 exones separados por 13 intrones. El gen entero contiene 28 repeticiones
Alu aleatoriamente dispersas a través de sus intrones. La secuencia Alu del intron 8 de este gen presenta
dimorfismo, es decir está presente en algunos individuos y en otros no. Algunos individuos poseen este
elemento en una copia de su cromosoma 8 (un alelo), otros pueden poseer dos copias en ambos cromosomas
homólogos (dos alelos), mientras que otros individuos no poseen esta secuencia. La presencia o la ausencia
de este inserto se puede detectar mediante PCR seguido de la electroforesis del producto amplificado.

Figura 3: Esquema de la secuencia a amplificar:

Electroforesis en Geles de Agarosa

La electroforesis separa fragmentos de DNA según su tamaño relativo. Los fragmentos de DNA se cargan en
un gel de agarosa, que se coloca en un compartimiento llenado con una solución tampón conductora. Una
corriente continua se pasa entre los electrodos de cada extremo del compartimiento. Los fragmentos de DNA
están cargados negativamente, y cuando están colocados en un campo eléctrico son atraídos hacia el polo
positivo y rechazados por el polo negativo. La matriz de gel de agarosa actúa como un tamiz molecular a
través del cual los fragmentos más pequeños de DNA pueden moverse más fácilmente que los más grandes.

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En el tiempo, los fragmentos más pequeños migrarán más lejos que los más grandes. Los fragmentos del
mismo tamaño permanecen juntos y migran en la misma "banda" de DNA. Los fragmentos de DNA en el gel
no pueden ser observados a simple vista porque el DNA no posee color, así que una tinta azul de carga se
agrega a la solución de DNA. La tinta de carga no tiñe el DNA sino que genera un “frente de migración”
coloreado (tinta azul) que migra hacia el extremo positivo del gel apenas delante de los fragmentos más
pequeños de DNA. Esto permite que el progreso de la electroforesis pueda ser monitoreado. Para visualizar
fácilmente las bandas de DNA, este debe ser teñido con compuestos especiales como son el bromuro de
etidio o el gel red que son fluorescentes y por lo tanto deben ser observados con luz ultravioleta en un equipo
llamado transiluminador. Cuando las bandas son visibles, se pueden comparar los patrones de restricción de
las diferentes muestras de DNA.

Observe atentamente el video (https://www.youtube.com/watch?v=SWicw3NyI68)

En esta actividad, usted aislará su propio DNA genómico y utilizará partidores que flanquean ambos lados
de la inserción Alu (300 pares de bases) y 660 pares de bases del intron del gen TPA para amplificar un
fragmento de 960 pares de bases si el elemento está presente, de lo contrario, si el elemento Alu no está
presente, se amplificara un fragmento de 660 pares de bases. La electroforesis de los productos de PCR es
suficiente para distinguir entre homocigotos (+/+) para la presencia de la repetición Alu (producto de 960),
entre homocigotos (-/-) para la ausencia de la repetición Alu (producto de 660 solamente), y heterocigotos (+/-
) que tienen los productos de 660 y los 960 pares de bases (Figura 4 y Figura 5)

Figura 4: Esquema de las posibilidades de dimorfismo genético

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Figura 5: Ejemplo del producto del PCR de la secuencia Alu en una población muestreada y visto en un gel
de electroforesis

Objetivos del laboratorio:

1. Comprender los pasos involucrados en la técnica de PCR

2. Reconocer los reactivos y materiales necesarios
3. Desarrollar ejercicios de PCR in silico y de diseño de partidores
4. Analizar resultados de PCR

ACTIVIDAD PRÁCTICA

Preparación de DNA

1. Obtenga un tubo con tapa de rosca y márquelo. Mezcle bien el contenido

del tubo con la matriz de Insta-Gene. Agregue 200 µl de Insta-Gene al
tubo con la tapa de rosca.

2. Utilizando una punta estéril de 2-20 µl, cuidadosamente raspe con la

punta el interior de ambas mejillas (10 veces cada mejilla). Debe de
ver un volumen pequeño de células blancas en la punta. (2 mm).

3. Coloque la punta que contiene las células bucales en el tubo con tapa rosca
con el Insta-Gene. Ponga la punta a una pipeta que este ajustada a 20 µl.
Presione arriba y abajo con la pipeta dentro del Insta-Gene 5 veces para
transferir las células bucales a la mezcla de la matriz.

4. Atornille la tapa de los tubos y colóquelos en el soporte de espuma e

incúbelos en el baño Maria a 56 °C por 10 minutos. Después de 5 minutos
mezcle el contenido de los tubos agitándolo un poco y regréselo al baño
de incubación a 56 °C por los siguientes 5 minutos.

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5. Remueva los tubos, mezcle de nuevo el contenido agitándolos y
colóquelos en el baño de agua hirviendo (100 °C). Incube los tubos a 100
°C por 6 minutos.

6. Remueva los tubos del baño de agua hirviendo y mezcle el contenido.

Precipite la matriz de Insta-Gene centrifugando por 5 minutos a máxima
velocidad.

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Amplificación por PCR

1. Marque un tubo de PCR y un adaptador con las iniciales de su grupo. Coloque

el tubo de PCR en el tubo adaptador y colóquelo en el soporte de espuma.
Obtenga el tubo con su muestra de células y colóquelos en el soporte.

2. Transfiera 20 µl al tubo de PCR del molde (o muestra) de DNA el cual se

encuentra en el sobrenatante de su muestra centrifugada. Tenga mucho
cuidado de evitar por completo la transferencia de la solución Insta-Gene.

3. Localice el tubo con la mezcla maestra en el hielo y transfiera 20 µl de la mezcla

maestra al tubo de PCR. Cierre el tubo de PCR. Realice lo mismo para sus
controles positivos (+/+), (-/-), (+/-) y su control negativo (0/0). Realice una
centrifugación por 10 segundos para asegurarse de mezclar el contenido de los
tubos.

4. Coloque los tubos de PCR en el termociclador y proceda con el siguiente

protocolo de amplificación:
Denaturación inicial: 95°C por 2 minutos
Luego 30 ciclos de amplificación por PCR a las siguientes temperaturas y tiempos, respectivamente, para
cada etapa:
- Denaturación (denaturation): 95 ºC por 30 segundos
- Alineamiento (annealing): 56 ºC por 30 segundos
- Elongación (extend): 72 ºC por 1 minuto
Extensión final: 72°C por 2 minutos

Electroforesis del producto de PCR

1. Obtenga sus tubos de PCR del termociclador y colóquelos en un soporte para microtubos y a todos ellos
agregue 10 µl de buffer de carga (de color azul).

2. Prepare un gel de agarosa al 1 % p/v en buffer TAE1x con red gel (10ul/100ml) y colóquelo en una cámara
de electroforesis con la peineta. Cuando esté gelificado, retire la peineta y llene la cámara con buffer TAE
1X suficiente para cubrir el gel. Esto requerirá 750 ml de buffer aproximadamente.

3. Asegúrese que los carriles del gel estén cerca del electrodo negativo (negro) y que la base del gel esté
cerca del electrodo positivo (rojo).
4. Utilizando una punta nueva para cada muestra cargue los carriles del gel con las muestras en el siguiente
orden Línea Muestra Volumen
1 MMR-DNA Standard 5ul
2 Control (+/+) 20ul
3 Control (-/-) 20ul
4 Control (+/-) 20ul
5 Control (0/0) 20ul
6 Estudiantes 20ul

5. Asegure la tapa en la cámara de electroforesis. Conecte los terminales eléctricos a la fuente de poder.
Realice la electroforesis de su muestra a 100V por 30 minutos.
6. Cuando termine la electroforesis, apague la fuente y remueva la tapa de la cámara. Con cuidado
remueva la bandeja del gel de la cámara. Tenga cuidado que el gel es muy resbaloso, y obsérvelo en un
transiluminador.

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