P. 1
Extraccion y Purificacion de Dna de Celulas Eucariontes

Extraccion y Purificacion de Dna de Celulas Eucariontes

5.0

|Views: 6.260|Likes:

More info:

Published by: Miguel Angel Rodas Herrera on Dec 08, 2009
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/03/2013

pdf

text

original

Universidad Autónoma de Chiapas Facultad de Ciencias Químicas Campus IV

LABORATORIO DE GENETICA APLICADA

PRACTICA NO. 5

“EXTRACCION Y PURIFICACION DE DNA DE CELULAS EUCARIONTES”

TAPACHULA CHIAPAS A 15 DE OCTUBRE DEL 2009

INTRODUCCION
Todas las células, a excepción de las células anucleadas de los eritrocitos maduros en humanos, contienen ADN en sus núcleos celulares. También podemos encontrar ADN dentro de otros compartimentos celulares diferentes al núcleo, como las mitocondrias y los cloroplastos. La cantidad de ADN presente en algunos tejidos es muy pequeño; por este motivo no representa una fuente conveniente de extracción, aislamiento y purificación, para ser empleado en diferentes estudios de carácter genético, biológico. y/o bioquímico. Muchos tejidos contienen alta actividad de desoxirribonucleasa (DNAasa) que rompe la macromolécula en pequeños fragmentos. Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe reunir dos condiciones: contener gran cantidad de material genético y poseer baja actividad de DNAasa. El tejido linfoide, y en este caso el timo y el bazo representan materiales biológicos que son utilizados con mucha frecuencia como fuente de cantidades considerables de ADN para diferentes estudios. Después de extraído el ADN suele ser rápidamente desnaturalizado y por lo tanto se debe tener mucho cuidado en su remoción, aislamiento y purificación con el fin de obtener un producto que conserve la identidad e integridad estructural con el ADN de la célula de la cual proviene. El estrés o tensión mecánica o físico química, que acompañan los procesos de purificación de las moléculas de ADN deben ser evitadas al máximo y las nucleasas inhibidas. Factores como los iones Ca2+ y Mg2 son importantes para la actividad del las DNAasas .El citrato de sodio presente en las soluciones empleadas para la extracción y purificación del ADN, atrapa estos iones e impide, de esta forma, la acción de las enzimas que digieren estas moléculas. Con el fin de eliminar en forma definitiva la actividad de las nucleasas, las etapas de remoción de las proteínas deben ser llevadas a cabo tan rápido como sea posible y en frío. Las nucleoproteínas, son proteínas que aparecen asociadas con los ácidos nucleicos de las células eucariotas; son insolubles en agua y en soluciones de baja fuerza iónica pero solubles en soluciones de alta fuerza iónica; propiedad que debe ser tenida en cuenta durante los procesos de extracción inicial. El aislamiento de DNA genómico tiene diferentes aplicaciones. Estas incluyen la digestión de este DNA con enzimas de restricción, así como el realizar estudios de diagnóstico de enfermedades genéticas, y el análisis de polimorfismos de DNA para la identificación de individuos. Las técnicas de aislamiento de DNA se han hecho cada vez más rápidas y simples, principalmente con el fin de realizar análisis de diagnóstico. De esta forma un DNA genómico aislado por la técnica utilizada en este trabajo práctico, puede ser digerido con enzimas de restricción y analizado por la técnica de "Southern", o también puede amplificarse una zona específica de éste por la técnica de PCR, y analizar posteriormente por electroforesis directa o por secuenciación.

RESULTADOS
Al agregar TSNT se puso color rojo fuerte después se agrego fenol saturado el color fue café (chocolate).

Después se le agrego SEVAG no cambio

y se agrego TE no cambio.

Después de centrifugar 20 minutos salió color turbio, recuperamos la fase acuosa que está en la parte superior del tubo y salió color café (muy bajo)

Volvimos a centrifugar por que nos salió el color muy bajo esto fue porque al momento de extraer el DNA nos trajimos algo de proteínas; volvimos a extraer la fase acuosa de la parte superior del tuvo para quedarnos con de las fases de color blanco. Nos quedo una pastilla de ADN y agregamos etanol al 100% y observamos que se formo una hebra color blanco por que se precipito el DNA. Volvimos a centrifugar durante 5 minutos, lavamos la pastilla con etanol al 70% para eliminar sales, centrifugamos y decantamos, después se agrego TE 1X pH 8. Para hacer la cuantificación del DNA diluimos con agua milicu para poder separar la hebra blanca (DNA), y extrajimos un poco de esta hebra para poder leerlo en el espectrofotómetro, este dio un resultado de 35.6 ug / mL.

DISCUSIÓN
La cantidad de DNA obtenido fue muy variable entre diferentes equipos, y la purificación de DNA está dada si se utiliza o se siguen los paso para la extracción y purificación de manera muy correcta y precisa. El DNA que obtuvimos no estaba totalmente puro esto se debió a que acarreamos proteínas y esto altero los resultados por lo que tuvimos que centrifugar para que nos quedara un poco más puro por decirlo así.

CONCLUSION
 Se practico la técnica para la preparación de DNA genómico, la electroforesis en geles de agarosa y la cuantificación de DNA.

CUESTIONARIO
1.- EXPLICA QUE ES LA PARADOJA DEL VALOR C.

El valor C se defina como la cantidad de ADN por genoma haploide (un solo juego cromosómico) en estado de un cromatidio (en fase G1). En el caso de la especie humana con 2n=46 cromosomas, especie diploide (2n), con dos juegos de cromosomas, uno recibido del padre y otro de la madre, cada uno formado por 23 cromosomas, el valor C sería la cantidad de ADN correspondiente a un juego de 23 cromosomas en estado de un solo cromatidio. Una forma mucho más sencilla de definir el valor C, en el caso de las especies diploides, con dos juegos cromosómicos, sería el contenido de ADN de un gameto de la especie. La paradoja del valor C surge cuando se compara la cantidad de ADN o tamaño del genoma con las funciones para las que lleva información.

2.- DESCRIBE EL PROCEDIMIENTO QUIMICO Y ENZIMATICO, DETERMINACION DE LA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS EN UN GEN. Automated sequencing: secuenciación automática.

PARA

LA

Método de secuenciación de ADN basado en el método de Sanger que se realiza en unos aparatos automatizados especiales denominados secuenciadores. Se diferencia del método de Sanger sobre todo en que la marcación no se realiza con radioisótopos, sino con fluoróforos, que en los secuenciadores de segunda generación van unidos a los didesoxirribonucleótidos (‘terminadores de cadena’). En las secuenciaciones de segunda generación, pues, cada didesoxirribonucleótido lleva un fluoróforo distinto, de modo que la elongación del cebador se puede hacer en una única reacción (y no en cuatro reacciones paralelas como en el método original de Sanger). Por consiguiente, las bandas de electroforesis tampoco se revelan por autorradiografía como en el método de Sanger, sino que los fluoróforos son excitados con rayos láser y un sensor situado en la base del gel de electroforesis capta la fluorescencia que éstos producen. La secuencia de nucleótidos es ‘leída’ de forma automática por el aparato a medida que los fragmentos fluorescentes de ADN que se van separando electroforéticamente con arreglo a su tamaño específico desfilan delante del sensor. Cuando se trabaja con pequeñas cantidades de ADN se puede llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en presencia de los fluoróforos específicos. En la actualidad, es cada vez más frecuente la utilización de la electroforesis en capilar, dado que ocupa menos espacio (se desarrolla en un capilar de 20 a 200 mm de diámetro), acepta cantidades y volúmenes muy pequeños de la muestra

(picomoles, nanolitros), es muy rápida (en tres horas pueden leerse de 500 a 600 bandas) y tiene un gran poder de resolución.

3.- ¿QIUE ES UN VECTOR? Un vector génico es un agente que transfiere información genética, por algún medio, de un organismo a otro. Son utilizados en biotecnología para portar el ADN recombinante desde una célula donadora hasta la célula receptora en los que se inserta el gen que se quiere transferir. A continuación se infecta la célula hospedadora con ese vector recombinante, obteniéndose la célula transgénica. Un vector con el que los científicos experimentan son los plásmidos, con los que es posible insertar genes foráneos al núcleo de una célula. Otros vectores génicos son los bacteriófagos y cósmidos. También se puede considerar vectores genéticos a los virus, puesto que en el curso de su ciclo insertan información genética en las células que invaden. Los vectores deben llevar, además del gen protagonista, otros genes llamados marcadores, que puedan identificar a las células que sean resistentes al antibiótico marcado o que emitan luz, según los casos, serán las portadoras del ADN recombinante. La probabilidad de fracaso en la formación del transgénico es muy alta, debido al descontrol en la inserción de ADN foráneo, de manera que la célula puede desorganizarse y morir.

4.- EZQUEMATIZA EL MODELO DE CLONACION. Clonación molecular La clonación molecular se refiere al proceso de aislar una secuencia de ADN de interés, insertarlo en un plásmido y obtener múltiples copias de ella en un organismo. Frecuentemente, el término clonación es erróneamente utilizado para referirse a la identificación de una localización cromosómica de un gen asociado con un fenotipo particular de interés, como en la clonación posicional. En la práctica, la localización de un gen en un cromosoma o región geonómica no necesariamente habilita para aislar o amplificar la secuencia geonómica de interés.

La clonación de cualquier secuencia de ADN incluye los siguientes pasos:

¯ Fragmentación: Inicialmente, el ADN de interés necesita ser fragmentado para proveer un segmento relevante de ADN de un buen tamaño. La preparación de los fragmentos para la clonación se obtiene frecuentemente del PCR, pero también puede hacerse por medio de la digestión con enzimas de restricción y a veces fraccionando con electroforesis en gel. ¯ Ligación: Un procedimiento de ligación se emplea cuando el fragmento amplificado se inserta en un vector. Dicho vector (que generalmente es circular) se convierte en una secuencia lineal utilizando enzimas de restricción, y es incubado con el fragmento de interés bajo las condiciones apropiadas con una enzima llamada ADN ligasa. ¯ Transfección: Después de la ligación, el vector con el gen de interés se transfecta a una célula. Comúnmente se utiliza la electroporación, aunque existe un gran número de técnicas alternativas. ¯ Selección: Las células transfectadas se cultivan. Como este procedimiento actualmente se considera de baja eficiencia, se deben identificar las colonias de células que han sido exitosamente transfectadas con el vector que contiene el gen deseado.

5.- ¿COMO REALIZARIA LA EXTRACCION Y PURIFICACION DE UN TEJIDO ANIMAL? Ejemplo: IDENTIFICACIÓN CONSERVADOS Y TIPIFICACIÓN DE Mycobacterium bovis EN TEJIDOS

Para la extracción del ADN se siguió el procedimiento descrito por Miller, con algunas modificaciones. Se transfirieron 2 cortes de 5µm de cada TEP a un tubo de 1.5 ml y se adicionaron 200 μl de solución amortiguadora de digestión (Tris 0.05 M, pH 8.3, EDTA 1mM y Tween 20 0.5%). Las muestras se sometieron a dos ciclos de ebullición durante 10

min en baño maría y enfriamiento en nitrógeno líquido durante 1 min; seguido por una ebullición final en baño maría durante 10 min y centrifugación a 3,000 x g durante 20 min para remover la parafina. El ADN obtenido se cuantificó por fluorescencia. Muy parecido a lo que realizamos en esta práctica.

You're Reading a Free Preview

Descarga
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->