TECNICAS BASICAS PARA EL

ANALISIS DE ACIDOS
NUCLEICOS
 ELECTROFORESIS DE DNA

Fragmentos de DNA

Migración

Gel de Agarosa o Poliacrilamida Separación por tamaño

 (ELECTROFORESIS DE DNA-continuación)
Marcador (Estándar)

Tinción con
Bromuro de Etidio

Observación en un
transiluminador de
luz UV.

Gel de Agarosa Gel de Poliacrilamida

Determinación del
tamaño de
fragmento de DNA
por electroforesis
Mediante la electroforesis
se logran separar
fragmentos de diferentes
tamaños.

¿Cómo saber
cuál de aquellos
fragmentos
contiene el gen
de interés?
La electroforesis de ácidos
nucleicos, sea estándar o de
tipo PFGE , permite separar
fragmentos de DNA y
determinar su tamaño.
Sin embargo, esta
información no es
suficiente para saber en
cuál de los fragmentos se
encuentra un gen o
secuencia de DNA en
particular.

Siguiente paso:
Hibridación con una
sonda específica
 HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS

El DNA puede sufrir un proceso reversible de separación y

reasociación de hebras

DNA en estado nativo Denaturado Renaturado

Sonda : molécula de hebra simple (DNA o RNA) de
secuencia conocida, con una marca radioactiva o fluorescente

Sonda de
DNA
marcada

DNA o RNA
inmovilizado
 Southern blot
• Animación:
https://www.youtube.com/watch?v=-
SaKbLTQ4WI
• Filmación:
https://www.youtube.com/watch?v=-
SaKbLTQ4WI
 DETECCION Y ANALISIS DE BIOMOLECULAS

Molécula Detección específica

transferida con:
Southern DNA sonda marcada
(DNA o RNA)
Northern RNA sonda marcada
(DNA o RNA)
Western Proteína Anticuerpos

Luego de la separación por tamaño mediante electroforesis,

las moléculas de DNA, RNA o Proteínas pueden ser
transferidas del gel hacia una membrana o filtro de
nitrocelulosa o nylon, para luego ser detectadas con sondas o
anticuerpos especìficos.
 La hibridación con sondas específicas
permite determinar la ubicación o identidad
de un fragmento de DNA

Southern
HIBRIDACION EN NORTHERN

Paso 1:
Separación de fragmentos
de RNA por electroforesis
en gel.
Paso 2: Transferencia del RNA al
filtro o membrana. Las
moléculas de RNA son
arrastradas por el buffer
que sube por capilaridad.
Paso 3: Hibridación de la sonda marcada con el
mRNA inmovilizado (interacción específica por
complementariedad de bases)

Sonda de
DNA
marcada

Membrana
de nylon
RNA
inmovilizado
Paso 4: Lavado (se elimina el
exceso de sonda no hibridada)
y Detección de la marca de la
sonda (localización del mRNA
específico)
La hibridación en
condiciones de mayor
estringencia garantiza
una mayor especificidad
en la interacción.
 TIPOS DE HIBRIDACION

1. Tipo de interaccion: DNA – DNA

DNA – RNA
RNA – RNA
2. Hibridación en filtro:
- Southern o Northern
- Colony Hibridization
- Dot-blot
3. Hibridacion en solución
4. Hibridacion in situ (en tejidos fijados sobre láminas
portaobjeto)
FISH: hibridación in situ fluorescente

Sonda de DNA
con marca
fluorescente
 La electroforesis convencional en gel de
agarosa, no logra resolver moléculas de
DNA mayores a 10-20 Kb
¿Cómo hacer para separar fragmentos de
DNA de tamaño mas grandes (por ejemplo
cromosomas enteros)?

PFGE : Pulse Field Gel Electrophoresis

(Electroforesis en gel de campo pulsado)
 Principio de separación por PFGE
(Electroforesis en gel de campo pulsado)
-
- -

+ +
+
La migración de los fragmentos de DNA cambia de dirección, según el
campo eléctrico que se active. La activación se da por tiempos cortos
(“pulsos”)
Fig 1: Electrode configuration of commonly used
pulsed field gel electrophoresis (PFGE) units.
Figure 2. Increased
separation of the 20-50 kb
range with field inversion gel
electrophoresis (FIGE).
Run conditions: 230 V, 7.9 V/cm, 16
hrs., 50 msec. pulse,
forward:reverse pulse ratio = 2.5:1,
1% GTG agarose, 0.5X TBE, 10
C.a) 1 kb ladder, 0.5-12 kb; b)
Lambda/Hind III, 0.5-23 kb; and c)
High molecular weight markers,
8.3-48.5 kb
Fig. 3. Rotating gel
electrophoresis (RGE)
separation Saccharomyces
cercevisiae chromosomes (245-
2190 kb). Run conditions: 180 V,
5.1 V/cm, 34 hrs., 120 angle, 60-
120 sec. pulse ramp, 0.5X TBE,
1.2% GTG agarose, 10 C. Two
combs were used on the same gel
to load 32 samples, a maximum
of 72 are possible
Fig. 4. Rotating gel electrophoresis
(RGE) separation of 3000 to 6000 kb DNA
Schizosaccharomyces pombe chromosomes.
Run conditions: 50 V, 1.4 V/cm, 100 hrs,
100 angle, concatamated multiple runs:
2500 sec./50hrs, 3000 sec./50hrs,
0.5X TBE, 0.8% megarose (Clontech),
10 C.
Preparación de PLUGS de agarosa para PFGE
SECUENCIAMIENTO DE SANGER
• Uso de dideoxinucleótidos (ddNTPs)
• Se coloca el mismo DNA templado en 4 tubos, para
realizar las reacciónes de secuenciamiento en
paralelo.
• Separación de fragmentos producidos por
electroforesis en gel de secuenciamiento
Secuenciamiento de ADN

• El método Sanger permite secuenciar

fragmentos de 1000 bp.
• El método utiliza di-deoxi-
ribonucleótidos, que interrumpen la
replicación, lo que da como resultado
fragmentos de diferentes tamaños.
• Se colocan en solución ddNTPs con
marcadores fluorescentes ATCG. Cada
tamaño, con 1nt de resolución, debe dar
un color diferente.
 LE 20-12
DNA Primer Deoxyribonucleotides Dideoxyribonucleotides
(template strand) 3 (fluorescently tagged)
5

5

DNA
polymerase

3

DNA (template Labeled strands

5 strand) 3

3

Direction
of movement
of strands

Laser Detector

SANGER:
http://www.youtube.com/watch?v=AV35C36bBto

Illumina:
http://www.youtube.com/watch?v=Zqr8_KiuzHU
Nanopore
• El genoma humano se resolvió mediante el
camino de mapeo de ligamiento, mapeo físico,
y secuenciamiento de ADN.
• Un camino alternativo comienza con el
secuenciamiento de fragmentos de ADN.
Requiere mayor redundancia y capacidad de
cómputo.
• Los sistemas informáticos pueden ensamblar
las secuencias identificando las regiones de
superposición.
LE 20-13
Cut the DNA from
many copies of an
entire chromosome
into overlapping frag-
ments short enough
for sequencing

Clone the fragments

in plasmid or phage
vectors

Sequence each fragment

Order the
sequences into one
overall sequence
with computer
software
 El mismo DNA templado en 4 tubos en paralelo

Oligonucleótido o Primer
Templado
 LECTURA RECOMENDADA

1. Nelson D. &Cox M.- LEHNINGER Principles of Biochemistry

Capítulo 8 – Nucleotides & Nucleic Acids

2. Mathews, Van Holde & Ahern - Bioquímica (3era edición

Capítulo 25 - Sección Herramientas de la Bioquímica
- Tema 25C – Secuenciamiento de DNA
- Tema 25D – Transferencia en Southern & Hibridación