TÉCNICAS BÁSICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

METODOS DE ANALISIS PARA ADN

Manipulación enzimática de los ácidos nucleicos
 Se utilizan las Enzimas asociadas a la replicación, transcripción y degradación del ADN
 Técnicas de manipulación de genes y organismos (clonación, transgénesis o CRISPR)
Hibridación de ácidos nucleicos
 Uso de capacidad de formar doble hebra por complementariedad de bases
 Hibridación en soportes solidos (Blots)
 Hibridación masiva (microarrays)
Síntesis y amplificación de ácidos nucleicos
 Amplificación de ADN por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
 Secuenciación de ADN ( Secuenciación Sanger y Secuenciación Masiva)

ENZIMAS EN BIOLOGIA MOLECULAR

MODIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 Nucleasas: modifican ácidos nucleicos
 Enzimas de restricción
 DNAsas, destruyen adn
 RNAsas destruyen arn
 ADN Ligasas unen adn
 Otras enzimas
 Polinucleótido quinasa agregan fosfatos
 fosfatasa alcalina n quita fosfatos
SÍNTESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
 ADN Polimerasas
 Taq polimerasa adnpolimersada bacteriana
 Klenow (Pol I)
 Transcriptasas
 Reversas
 ARN Polimerasas
 Las enzimas en Biología Molecular

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Imita replicación e ADN, para EOS necesita un adnpolimerasa, adn que va ser replicada, nucleótidos trifosfatos,
cebadores de adn con extremos 3´libre para adn polimerasa para unirse
En pcr, los cebadores son sustituido por fragmentos de adn con 18 pares de bases
ETAPAS
1. desnaturalización: los cebadores se ubican en su lugar, se da por calentamiento hasta 95°,
2. Ligamiento: se deja enfriar para que los cebadores encuentren secuencia complementaria. Los cebadores son la
manera de controlar qué se quiere amplificar. Al unirse los cebadores de adn complementarios para la zona que s
busca amplificar
3. Extensión: se calienta a 72° para que la taq polimerasa sea más efectiva, se da síntesis, la adnpolimerasa
complementa con nucleótidos. Los cebadores se unen a replicación también.
Situación cíclica, lo que hace que el fragmento crezca en cantidad de copias con mismo tamaño
Renatu se unem al enfriar xcomple
Reaspocia-

Se multiplica por 2 siempre, se hace 2 a la n

MÉTODOS DE ANÁLISIS
Para saber si se hayan y donde los tubitos amplificados
Indirectos: Cambios en la movilidad electroforética
• Fragmentos de digestión con enzimas de restricción
• Fragmentos Productos de PCR
A partir de un sólido, aplico muestra, y se genera cmapoc on both cmapos, adn carga negativa,
Directos: secuenciación
ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Separación de fragmentos de ADN/ARN en un gel de agarosa utilizando un
campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga eléctrica neta
1) Preparación de la solución de gel, agarosa
2) Armado del gel, se pone en molde de ladrillo fino (?)
3) Armado de la cuba ycarag de als muestras, posillos en polo negativo
4) Separación de ellos fragmentos
5) Visualización de ellos fragmentos separados, tinción de componente que en luz uv es fluorescente. ADN
migrado, si son mismo tamaño migran juntos, si es más grande va más lento. Se ve si hubo amplificación y su
tamaño, NO sabemos nada de su frceuencia

SECUENCIACIÓN
MÉTODO DE SECUENCIACIÓN DEL ADN SANGER
En replicación de adn se tiene nucleótidos trifosfatos,
que se van air agregando al replicar
Sanger plantea intercambiar un desixidinucloetido por un
desoxidinucloetido (cambiar H por OH en pentosa), se
bloquea reacción, no se sintetiza más adn

Si a esos desoxinucleotidos se los marca a cada uno con

un fluorocromo diferente, la cadena se va a ir elongando
y probando hasta que encuentra el que va (A,C, G, T)
puede poner una desoxi y ahí se bloquea la síntesis, así
que en el segundo ciclo ya no va a poder si no
sintetizada esa, peor sí la hebra bloque. Se acaba con
cadena scortadas y s etiene marcqado cómo y dónde se
cortaron. Se ilumina con laser el trayecto en
elctroforesis, y s even de distinto colores cada uno de
los 4 desoxi. Como la introducción de estos es al azar.
Cada pico es una base diferente
Hoy en día con máquinas, se pudo genoma humano, no
se puede pedazos largos.
TECNICAS MASIVAS
Miniaturizar proceso en una placa.400 pares de bases. Se va midiendo cada nucleotido que s eva agregando encada
punto y se ve con coso optico. 300
Genoma, se parte nepedacitos con adaptador
DE TERCERA GENERACION
Se coloca muetsra de adn, pasa por un poro con sensores que mide cambios electricos de cada nucleotido y se ve a
cuál se corresponde, cone ste covid

MANIPULAR ADN
ENZIMAS DE RESTRICCION
Las enzimas de restricción cortan el ADN cuando
reconocen secuencias cortas específicas (palíndromes),
produciendo fragmentos de ADN de diferentes longitudes.
Deja etxremos pegajosos (secuencia monocatenaria libre)
ECOR1: 2 cadenas idneticas, que tinene distintos puntos de
union. Se reconocen en el surco mayor, la scarcateristicas a
nivel macromolecular, de etipo ii porque reconocen un lugar
de ecorte
los tipos de enzimas de restriccion

DETECCION DE SECUENCIAS EPSCIFICAS .

TECNICA DE SOUTHERN BLOT

Cortar adn con una enzima de restriccion y depsues

electroforesis. Se transfiere desde esa arosa auna mebrana tal como estaba. Lo bueno es que la membrana se puede
tratar de diversas maneras porque el adn queda fijo a la membrana . si se caliente, y se mete a coso con adn que queiro
estudiar(sonda), se van a unir a el adn fijo en la membrana cuando se enfria
ADN southern secunecia del gen, zona maracda que
se une al adn
ARN northern transcripcion, el mrna
PROTEINA western, las proteinas al as que da lugar
el gen

HIBRIDACION MASIVA DE ACIDOS

NUCLEICOS microarrays
Se pone enuna placa varais sondas pegadas, sobre esa placa se frgamenta el adn o arn, se marac con florocromo y se
deja que se hibride con las sondas que hay en el soprote, esos framentso se van apegar en algunos puntos, que se van a
concoer porque se sabe especificamnete la sonda

GENOMA
BACTERIA
Transformar una bacteria ocn palsmido (genes qu edan
reistencia a antibioticos, s epueden transmitir de una bacteria
a otra) recombiannte. Se tomaa es eplasmiod “vectro”n ys e
introduce el segmento de adn que queremos medinate
adnligasa.

GENERACION DE ANIMALES TRANSGÉNICOS

Se intorduce al gen que nos interesa otro gen, y a eso se
inserta e celulas embrionarias, ys eobliga que por recombinacion homologa se introduce ese nuevo gen, que lo que
hace es paagrlo. Hibridos, celulas de ellos, más als introdcidas.

AGREGAR COVID Y PCR