Técnicas de hibridación: El proceso de hibridación molecular es aquel en el que dos

cadenas de ácidos nucleicos de distinta procedencia interaccionan mediante puentes de hidrógeno

entre bases complementarias.

Southern Blot: Esta técnica de hibridación se utiliza para detectar una secuencia específica de DNA
en una mezcla de DNA. El propósito principal de la transferencia de Southern es detectar una
secuencia de ADN específica en una muestra. La técnica se utiliza en la toma de huellas dactilares
de ADN, pruebas de paternidad, identificación de víctimas e identificación criminal. También ayuda
en la identificación de genes específicos, en RFLP (polimorfismo de longitud de fragmento de
restricción), mutación e identificación de reordenamiento de genes, enfermedades genéticas y
agentes infecciosos.

Pasos:

1. Electroforesis: Previamente se debe hacer una extracción de DNA de algún tejido, luego una
digestión del DNA mediante enzimas de restricción. Luego de estos pasos, esta muestra de
fragmentos de DNA se manda a electroforesis para separar la muestra de DNA en distintas
bandas según el tamaño por electroforesis en gel de agarosa. Las moléculas de DNA con
carga negativa migran hacia el electrodo positivo, las moléculas más pequeñas se mueven
más y más rápido por el gel, produciendo una separación continua de los fragmentos de
DNA de acuerdo con su tamaño.
Luego de la electroforesis, el DNA tiene que desnaturarse mientras permanece en el gel de
agarosa que se encuentra impregnado con una disolución alcalina que puede ser urea,
formamida, o agentes caotrópicos. Ya con el DNA desnaturado y monocatenario (y
neutralizado) se lleva al paso siguiente
2. Transferencia: En este paso, una membrana de nitrocelulosa se coloca en contacto con el
gel y las bandas de DNA se mueven hacia la membrana a través de la acción capilar. En esta
transferencia se mantiene la distribución espacial de los fragmentos de DNA obtenidos de
la electroforesis.
3. Detección: La secuencia objetivo que se encuentra en la membrana se hibrida con una
secuencia de oligo-nucleótidos marcada específica llamada sonda de hibridación. Los
factores que afectan a la especificad de unión entre la sonda y la secuencia de DNA objetivo
son: la temperatura (alta T°= especifidad y baja T°= inespecificidad) y fuerza iónica (alta
fuerza iónica= especificidad y baja fuerza iónica= inespecificidad), presencia de agente
desnaturantes (especificidad). Una forma de detección es con un isótopo radiactivo para
facilitar su detección, luego se de la hibridación se lava el exceso de sonda no unida de forma
que la única radiactividad que quede en la membrana sea la de la sonda unida al gen de
interés. Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo
de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, la membrana de nailon
se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de
la luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su
exposición y el revelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern se
conoce como autorradiografía

Colony Blot: Esta técnica consiste en que una huella de las colonias cultivadas en la superficie de
un medio nutritivo sólido se transfiere a una membrana y las células se lisan o rompen, lo que
permite que el ADN o la proteína se unan a la membrana. Después del tratamiento apropiado, la
membrana puede exponerse a una sonda de hibridación para la identificación de colonias que
contienen una secuencia de ácido nucleico específica o un anticuerpo para la identificación de
colonias que contienen una proteína específica.
Dot Blot: Esta técnica es una versión simplificada de las demás ya que en esta no se necesita hacer
una electroforesis ya que solamente se coloca una gota, con la molécula objetivo, directamente
sobre la membrana y luego se agrega la sonda (DNA, cDNA, anticuerpos). Esta técnica ahorra
tiempo, pero no ofrece información acerca del tamaño de la molécula objetivo, además que
tampoco puede diferenciar entre moléculas, por lo que esta técnica solamente permite detectar la
presencia o ausencia de la molécula objetivo y no los tamaños o cantidades.

Nortern Blot: Esta técnica de hibridación se utiliza para detectar una secuencia específica de RNA
en una mezcla de RNA. Dado que la transferencia Northern puede identificar una secuencia de ARN
específica en una muestra, se puede utilizar en los estudios de expresión génica. También puede
ayudar en el diagnóstico de enfermedades.

Pasos:

1. Electroforesis: Se manda a electroforesis para separar la muestra de RNA en distintas

bandas según el tamaño por electroforesis en gel de agarosa. Las moléculas de RNA con
carga negativa migran hacia el electrodo positivo, las moléculas más pequeñas se mueven
más y más rápido por el gel, produciendo una separación continua de los fragmentos de
DNA de acuerdo con su tamaño.
Cómo el RNA es de una sola hebra, no se necesita desnaturar después de la electroforesis,
lo que se hace es agregar formamida durante esta para mantener un ambiente
desnaturante evitando que los RNA de una sola hebra se peguen entre sí.
2. Transferencia: En este paso, una membrana de nitrocelulosa se coloca en contacto con el
gel y las bandas de RNA se mueven hacia la membrana a través de la acción capilar. En esta
transferencia se mantiene la distribución espacial de los fragmentos de RNA obtenidos de
la electroforesis.
3. Detección: La secuencia de RNA objetivo se detecta por hibridación con una sonda marcada
oligo nucleotídica marcada formada por cDNA (DNA complementario obtenido de un
transcrito de mRNA). Las sondas requieren ser marcadas bien con isótopos radiactivos (32P)
o con quimioluminiscencia, ya sea con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rábano, las
cuales, tras la adición de su sustrato específico producen una emisión de luz detectable. El
marcaje por quimioluminiscencia puede hacerse de dos formas: Por un lado, la sonda puede
estar unida a la enzima o bien unida a un ligando (p.ej, biotina) para la cual hay un
anticuerpo (avidina o estreptavidina en este caso) está unido a la enzima que revelará el
marcaje. Los Rayos X pueden detectar tanto las señales radioactivas como las
quimioluminiscentes, siendo preferida por muchos investigadores la segunda, dada su
mayor rapidez, sensibilidad y reducción de los riesgos para la salud que conlleva trabajar
con compuestos radioactivos.

Western Blot: Es una técnica de transferencia utilizada para detectar una secuencia de
aminoácidos específica en una mezcla de proteínas. La transferencia de Western también se llama
transferencia de proteínas o inmunotransferencia. Puede identificar la cantidad de proteínas en una
muestra, la presencia de bacterias y virus en el suero y la presencia de anticuerpos contra el VIH en
el suero. También puede detectar proteínas defectuosas. Además, el Western Blot es la prueba
definitiva para la hepatitis B, la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, la enfermedad de Lyme y el
herpes.

Pasos:

1. Electroforesis: En este caso, se ocupa un gel de poliacrilamida debido a las características

que tiene este (SDS PAGE) que son otorgar carga negativa constante mediante un campo
eléctrico además de que el SDS TIENE LA CARACTERÍSTICA E DE DESNATURAR LAS
PROTEÍNAS, y debido a esto es que se ocupa para separar proteínas presentes en una
 muestra, haciendo que migren de manera que mientras más grandes van más lentas y se
mueven menos y mientras más pequeñas se mueven más y más rápido
2. Transferencia: Las bandas de proteínas en el gel se transfieren a una membrana mediante
transferencia eléctrica creando un polo positivo en la membrana haciendo que la proteínas
se peguen a estas.
3. Detección: La membrana con proteínas separadas se incuba con un anticuerpo primario
que solo se une a la proteína específica. Aunque el anticuerpo primario puede ser un
anticuerpo monoclonal o un suero policlonal, el monoclonal tiene solamente un sitio de
reconocimiento para la proteínas por lo que entrega más especificidad, mientras que el
policlonal contiene varios sitios de reconocimiento para la misma proteína por lo que
entrega más sensibilidad. Un anticuerpo secundario, que está marcado con una enzima
como la peroxidasa de rábano picante (HRP) o fosfatasa alcalina, se utiliza para detectar el
anticuerpo primario. Cuando se incuba con el sustrato, la acción de la enzima visualiza la
unión de anticuerpos a una región específica en la membrana.

Vectores de expresión: Un vector de expresión es un vector plasmídico de clonamiento

con un promotor que regula la expresión del gen. Entran a la bacteria mediante electroporación
inducido por cloruro de calcio, sirve para gram positiva como para gram negativas. Un gen clonado
no siempre se expresa en la célula huésped. Para que ocurra transcripción este gen recombinante
debe contener un promotor que sea reconocido por la RNA polimerasa (La ARN polimerasa es una
enzima de unidades múltiples que sintetiza moléculas de ARN a partir de una plantilla de ADN a
través de un proceso llamado transcripción. La transcripción de información genética en ARN es el
primer paso en la expresión génica que precede a la traducción, el proceso de decodificación de
ARN en proteínas.) La mayoría de los vectores de expresión son derivados del vector pBR322 pero
con las señales de inicio de transcripción y traducción necesarias. La función de estos vectores es la
expresión de proteínas. Cómo se explicó anteriormente, a este vector de clonamiento se le agrega
un promotor (T7), un operador, un sintetizador del represor para regular la expresión del gen, pero
esto solamente asegura la transcripción, lo que asegura la traducción es la caja Shine-Dalgarno.

1. pET: Este plásmido funciona con el IPTG (o lactosa) que induce la ARN polimerasa del fago
T7 que está en el cromosoma bacteriano de cepas de E.coli generadas en el laboratorio
como la BL21 y todos sus derivados. Estos últimos vectores se conocen con el nombre de
pET tienen el promotor dependiente de la T7 río arriba del gen de interés. Estos plásmidos
funcionan en base al operón lac.
2. Operón Lactosa (sistema inducible con control negativo): Está compuesto por un gen
sintetizador del represor (LacI), un promotor, un operador, y 3 genes estructurales: LacZ:
codifica la beta galactosidasa que hidroliza la lactosa
3. LacY: codifica para permeasa que es una sistema de transporte membranal para la difuciín
facilitada y LacA: codifica para transacetilasa que es una enzima que transfiere un grupo
acetilo desde una molécula de acetil CoA.
 Este operón funciona de manera inducible por lo que el inductor en este caso es la lactosa.
Por lo que si no hay presencia del inductor (lactosa) el represor se une al operador y no deja
actuar a la RNA polimerasa por lo que no se genera transcripción. Si hay presencia del
inductor (lactosa), el represor se une al operador, pero la lactosa se una al represor
haciendo que baje la afinidad entre el represor y el operador, haciendo que el operador que
libre y quede el represor unido al inductor en el medio, permitiendo así que funcione la RNA
polimerasa y exista transcripción.

Glucosa Lactosa Se une CAP Se une el Nivel de

represor transcripción
+ - - + Sin transcripción
+ + - - Nivel bajo de
transcripción
- - + + Sin transcripción
- + + - Transcripción
fuerte

4. pBAD: Este vector de expresión funciona mediante el operón arabinosa, pero contiene los
mismos elementos que un pET, pero cambiando el operador.
5. Operón Arabinosa: Está compuesto por un gen regulador (araC), dos operadores (araO1 y
araO2), un sitio de unión (araI), un promotor, un sitio de unión para la CAP-AMPc y 3 genes
estructurales:
 a. araB: sintetiza ribulokinasa ,
b. araA: sintetiza isomerasa y araD: sintetiza epimerasa. Esta regulación permite la
transcripción cuando hay presencia de arabinosa y bajos niveles de glucosa, por lo
que el complejo CAP-AMPc es abundante, haciendo que este último se una a su sitio
en el operón, además la arabinosa se une con araC activando así la RNA polimerasa
y permitiendo la transcripción, si hay mucha glucosa y bajos niveles de arabinosa,
no se realiza la transcripción.

6. pNICE: Las características de estos vectores, es que son a partir de bacterias seguras,
mientras que los demás son provenientes principalmente del e. coli, una bacteria muy
estudiada pero aún así no es inofensiva como los vectores pNICE, otra característica es que
sirven solamente para bacterias gran positivas. En estos plásmidos se utiliza la nisina, que
es un antibiótico que es sintetizada de forma natural por la bacteria gran positiva y segura
llamada lactococcus lactis, este antibiótico es muy efectivo contra las bacterias gran
positivas. Cómo este antibiótico es peptídico significa que es sintetizado por una secuencia
de ácidos nucleicos, compuestos por tres proteínas, nisA, nisR y nisK, dónde nisK es la
proteína que censa la presencia de nisina en el medio, nisR es el regulador de la respuesta
y nisA el promotor que se ve inducido si es que hay nisina, provocando así el inicio de la
transcripción. Sin olvidar que el regulador debe estar fosforilado para que inicie la
transcripción.
Vectores de Levadura: La levadura más importante en la tecnología de recombinación
genética es la Saccharomyces cerevisiae, que prácticamente es la E. Coli de las levaduras.

1. YEP: Plásmidos episomales (que no se integran al genoma de la levadura) de levadura estos

son más similares a los plásmidos bacterianos. Este es un plásmido lanzadera, por lo que
contiene los elementos para poder replicarse tanto para levadura como para bacteras:
Promotor (puede ser G3PD o actina), un MCS, un Yeast ori (ARS o 2μori), un ori bacteriano,
un marcador de selección para eucariota (mediante auxotrofía) y un marcador de selección
de procariota (resistencia a antibiótico). Su tamaño es de alrededor de 10kb

2. YAC: Más conocidos como cromosoma artificial de levadura, son populares debido a que
pueden transportar cantidades muy grandes de material genético debido a que simulan la
estructura de un cromosoma. Estos vectores son segmentos de DNA que contienen todos
los elementos necesarios para propagar un cromosoma en levaduras: un origen de
replicación de levadura (ARS o Yeast Ori), un centrómero para segregar las cromátidas en
las células hijas, 2 telómeros que indican los extremos del cromosoma. Además de tener los
 componentes necesarios de un plásmido que son u sitio de múltiple clonamiento (MCS),
marcador de selección para levaduras (mediante auxotrofía puede ser URA3, LEU2 o HIS3).
Pero además estos vectores al ser del tipo lanzadera (shuttle: que pueden ser usados para
transfeirr genes y para ser expresados tanto en eucariota como las levaduras como en
procariota como las bacterias), contiene las partes necesarias para genera la replicación en
las bacterias que son: un origen de replicación para procariota (ori)y un marcador de
selección de procariota (mediante resistencia a antibióticos) Pueden clonar entre 300 y
1000kb.

3. YIP: Más conocidos como plásmidos de levaduras de integración, estos vectores pueden
replicarse por si mismas en bacterias debido a la característica de shuttle, pero en las
levaduras solamente se replican si se integran al DNA cromosomal de la levadura, esta
integración ocurre en el sitio de integración (SI) y ocurre mediante recombinación homóloga
(se intercambian secuencias de nucleótidas idénticas de DNA levadura por la secuencia
idéntica del plásmido contenida en el sitio de integración). Estos vectores contienen un
promotor, un MCS, un marcador de selección de procariota, un marcador de selección de
eucariota, un origen de replicación bacteriano y un sitio de integración. El tamaño de estos
vectores es usualmente entre 5 y 6 kb.

Consideraciones: Los vectores YEP son los que tienen la mayor tasa de transformación, alrededor
de entre 10 y 1000 k células transformadas. En términos de número de copias por célula, YEP tiene
entre 20 y 50 , mientras que el YIP solamente cuenta con una copia por célula ya que se integra al
genoma del huésped. El YIP gana en estabilidad debido a que forma parte del genoma del huésped
PCR: Sus siglas significan Reacción en cadena de la polimerasa, esta ténica permite obtener in
vitro (de manera acelular) múltiples copias de un fragmento específico de DNA, incluso en presencia
de otra moléculas de DNA y sin necesidad de clonación. Algunas de las características de esta técnica
son su elevada especificidad, extrem sensibilidad y gran reproducibilidad y rapidez. Su fundamento
es mimetizar in vitro el proceso de síntesis de DNA que se produce en la naturaleza. Los fragmentos
de DNA amplificados (productos del PCR) se les llama amplicones.

PCR: Los componentes y sustratos del PCR son: DNA molde (template), Primers (18 a 22 bp): Primer
Reverse, que va en dirección 3’ a 5’ y un Primer Forward, que va en dirección 5’ a 3’, dNTPs (A, G,
C, T): estos nucleótidos serán los ocupados para crear la nueva cadena, DNA polimerasa: que será
la encargada de sintetizar el DNA en dirección 5’ a 3’ y la encargada de corregir los errores mediante
endo o exonucleasas en dirección 3’ a 5’, agua libre de nucleasas: para que no haya interferencias
de enzimas que puedan degradar algo en nuestro DNA objetivo, Mg2+: la función de este ion es
como cofactor para la DNA polimerasa para que comience su funcionamiento, buffer: se requiere
una solución tampón para mantener un pH adecuado para que funcione la DNA polimerasa,
opcionalmente se pueden agregar adyuvante que aumentarían la especificidad (capacidad de
identificar la secuencia perfectamente homóloga) y la fidelidad (porcentaje de error) que serían:
dimetilsulfóxido (DMSO): añadido para disminuir las estructuras secundarias del ADN, detergentes
como el Tween 20 o el Tritón X-100: que ayudan a estabilizar la enzima y finalmente polietilenglicol
(PEG), glicerol, formamida y seroalbúmina bovina, cuya función es también estabilización de
enzimas.

En el ámbito científico e industrial se ocupa la enzima DNA polimerasa de la especie Thermus

aquiaticus, o más conocida como Taq Polimerasa. Se ocupa esta debido a sus características termo
estables capaces de soportar altas temperaturas sin desnaturalizarse en el proceso, el único
problema es su baja fidelidad, ya que esta polimerasa no tiene la función correctora 3’-5’.
Pasos:

1. Desnaturalización: Normalmente el primer paso de un PCR es desnaturalizar entre 94 y

95°C, durante 5 minutos para desnaturalizar en toda la molécula de DNA y relajar las
estructuras secundarias y de otros tipos. Luego cuando el ciclo vuelve a repetirse se ocupa
una desnaturalización a 94°C por 1 minuto. Esta desnaturalización provoca que se separan
las hebras de DNA, haciendo que cada cadena sirva como molde para la síntesis de cadenas
complementarias
2. Alineamiento: Esta etapa consiste en la hibridación de los primers con las cadenas moldes
del DNA, mediante complementariedad entre las bases del DNA con los primers. Estos
rpimers deben de tener el grupo OH- en el extemo libre, ya que desde ahí comienza la
síntesis de DNA, el alineamiento de los primers ocurre entre 40 y 70°C y varía dependiendo
del tipo de primer, pero normalmente la temperatura oscila entre 50 y 65°C (55°C para la
Taq pol) y por 15-30 segundos. Una consideración muy importante es que la Tm de ambos
primers debe ser con una diferencia de +-5°C, o si no no puede ocurrir alineamiento y por
lo tanto no puede ocurrir pcr.
3. Extensión: Luego de que los primers estén unidos comienza el último paso que es el de
extensión, dónde comienza la síntesis de DNA, este paso se debe hacer a la temperatura
óptima de la polimerasa a ocupar, en el caso de la TAq polimerasa la temperatura óptima
es de 72°C, y el tiempo depende del tamaño de las hebras, de la distancia entre ellas y de la
velocidad de la DNA pol, la Taq realiza 1000 nucleótidos en 30 segundos, usualmente en el
último ciclo se hace una extensión de 72°C por 5 minutos para asegurarse que todos los
amplicones estén terminados y tengan la misma longitud.
RT-PCR: Esta técnica consiste en amplificar moléculas de RNA, se ocupa en el estudio de la expresión
génica. El RNA a amplificar debe ser de alta pureza y no degradado. Aquí el material de partida es el
mRNA y el amplicón es una molécula de cDNA. En esta técnica el primer que se ocupa al comienzo
es un primer reverse (con una cadena poli T) que se hibrida en la cola poli A del extremo 3’ del mRNA
y la enzima transcriptasa reversa para iniciar la sísntesis de la primera cadena de cDNA. Ya con esta
primera cadena de cDNA, esta sirve como molde en una reacción PCR convencional.

Por lo que un RT-PCR es la mezcla de un PCR normal con unos pasos previos que son la obtención
de cDNA mediante transcriptasa reversa y un primer.

qPCR: Es una modificación del PCR convencional, ya que ofrece la posibilidad de cuantificar la
cantidad inicial del fragmento a amplificar. Esta cuantificación se obtiene mediante el uso de
fluorescencia, que permiten monitorear en cada ciclo la aparición de DNA, debido a que cada vez
que se realiza una copia del DNA molde se libera fluorescencia de manera que el incremento en la
intensidad de luz es proporcional a la cantidad de DNA generado. En un PCR convencional la
detección se hace en la etapa final de la amplificación, mientras que en el qPCR la detección se hace
simultáneamente con la amplificación.