@Melbako.

lp 2022 Segundo cuatrimestre

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DIAGNOSTICO MOLECULAR E
INMUNOLOGICO DE COVID-19.
El SARS-Cov2 tiene un genoma de ARN
monocatenario que codifica para proteínas virales.
En base a la estructura y a los componentes virales,
es que se desarrollaron muchos métodos de
diagnostico.
Dentro de los métodos de detección de ácidos
nucleicos (moleculares) hay dos estrategias:
1. RT PCR (real time PCR): es la utilizada en
FMED.
2. Isothermal PCR: es la que se utiliza en NEOKIT
de desarrollo nacional.
Detectan el ARN viral en circulación o en hisopados
nasofaríngeos o aspirados traqueales.
PCR: Polymerasa chain reaction.
Esta técnica se desarrollo en 1986 por Kary Mullis.
Permite la amplificación de un segmento especifico
de ADN de interés en millones de veces (se selecciona
un fragmento que nos interese y se replica millones
de veces obteniendo muchísimas muestras del
mismo fragmento). Se basa en la capacidad que
poseen las ADN polimerasas de replicar el ADN, y se
utilizan aquellas que sean de microorganismos
termoestables. Para la reacción se necesitan: dNTPs,
primers, un buffer optimo y cofactores como Mg+2,
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una polimerasa termoestable, ADN molde y un
termociclador.
Se utilizan ADN polimerasas termoestables ya que
para separar las cadenas de ADN se eleva la T° y
necesitamos que las ADN Pol resistan esa
temperatura ↑. Hay que conocer por lo menos una
pequeña porción de la secuencia porque
necesitamos que los primers sean complementarios
al ADN que queremos replicar.
PASOS:
1. Identificado el fragmento de ADN que se
quiere replicar, se sube la T° hasta los 90°C
aprox para desnaturalizar y separar las
hebras.
2. Se baja la temp a un rango entre 50°C-65°C, lo
que permite a los primers encontrar sus
secuencias complementarias.
3. La temperatura vuelve a subir a 72°C, la T°
optima de trabajo de la Pol, entonces se
empieza a sintetizar el fragmento.
4. Se vuelve a ↑ la T° hasta 94°C-96°C, las
cadenas nuevas se separan
5. La T° se baja a un rango entre 50°C-65°C para
que se vuelvan a unir nuevos primers y
comienza el ciclo 2.
El numero de cadenas del amplicon aumenta de
manera exponencial. En resumen, los pasos de la PCR
(ciclos de amplificación):
1. Desnaturalización del ADN (98°C)
2. Unión del cebador (48°C-72°C)
3. Elongación de la cadena (72°C)
4. Repetición de los ciclos 32 veces.
Para ver si funciono se hace una electroforesis de
ácidos nucleicos en un soporte de agarosa o
poliacrilamida y se detectan con colorantes
fluorescentes. Observamos si aparece la bandita de
ADN que quisimos amplificar y si el tamaño de ese
tamaño de ADN se corresponde al tamaño teórico
que quisimos amplificar. (tiene los mismos principios
que una electroforesis de proteínas).
PCR en tiempo real (qPCR - PCR cuantitativa)
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Permite amplificar y simultáneamente cuantificar de
forma absoluta el producto de la amplificación. Se
utilizan fluorocromos que se intercalan a la doble
hebra de ADN u otros. La fluorescencia es detectada
a través de un termociclador apto para q PCR La
diferencia sustancial esta en que en la PCR
convencional tenemos que esperar que se completen
los ciclos para la detección, y en la qPCR se da durante
la amplificación. Esto se puede mediante el uso de
sondas que tienen un fluorescente con una molécula
que extingue la fluorescencia ya que se encuentran
en forma de horquilla. Cuando se unen al fragmento
de ADN a identificar se estiran separándose y de esta
manera el fluorforo puede brillar, lo que permite
identificar el aumento de fluorescencia a medida que
avanza la PCR.
El parámetro que buscamos calcular es el CT: que es
el ciclo al cual la fluorescencia despega de la
fluorescencia umbral (viene definido en cada
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equipo). Mientras mayor sea la cantidad de ADN con
la que iniciamos más rápido llegaremos al CT.
Baseline: límite de detección, por debajo hay
amplificación, pero el equipo no lo detecta.
Esto llevado a las PCRs por SARS-Cov2, si hay mayor
carga viral, alcanzamos la CT de manera más rápida y
viceversa.
Sonda de hibridizacion: tiene la secuencia
complementaria a la zona que se quiere detectar.
En caso de que se quisiera cuantificar (ARNm) o
cuantificar un genoma de ARN como el del SARS-
Cov2, hay que partir de ARN. Entonces primero lo
pasamos a ADN mediante una trascriptasa inversa
previo a la PCR, donde se obtiene un ADN
complementario al ARN molde. Luego, se continua
con una rtPCR.
En FMED firma de convenio de cooperación entre
UNLP y Min de Salud de la Provincia de Buenos Aires
que involucra al Centro de Investigaciones
Cardiovasculares (CIC), Centro de Endocrinología
Experimental y Aplicada (CENEXA), Centro de
Investigaciones inmunológicas Básicas y Aplicadas
(CINIBA) y al Instituto de Investigaciones Bioquímicas
de La Plata (INBIOLP). En este momento en FMED se
analizan pruebas del distrito 11 y principalmente de La
Plata (SAME, Htal italiano; Sor Maria Ludovica, Noel
Sbarra La Plata y Nueva Clínica del Niño La Plata),
pero también muestras de Brandsen, Berisso y
Ensenada.
La primera etapa consiste en la recepción de la
muestra que viene en un triple empaque junto con la
planilla con los datos de lxs pacientes.
Luego, continua la etapa de extracción de ARN en la
que se debe romper la envoltura del virus para
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acceder a él. Esta es la primer etapa de cualquier kit
de extracción. Se toma una pequeña fracción de la
muestra (generalmente de hisopados nasofaríngeos)
y se incuba con una solución que principalmente
tiene detergente que rompe la envoltura y libera
contenido viral. Luego, se intenta que el genoma del
ARN se pegue a una especie de matriz con afinidad
• ELISA indirecto: el antígeno se encuentra en
por ácidos nucleicos y así “purificar” la muestra. Un
la superficie y a este se le une un anticuerpo
ejemplo, es usar moléculas magnéticas que se unan a
al cual se le une una enzima que cuando se
los ácidos nucleicos y ahí con un imán separarla del
agrega el sustrato, la intensidad del color
resto de la muestra. Finalmente se “lava” para
marca la velocidad de formación del Ac
separar las moléculas magnéticas de los ARN. Todos
especifico. Sirve para detectar el Ac
los kits funcionan bajo este mismo principio y van
circulante (anti-COVID, HIV, HCV).
variando en pequeños detalles.

La tercera etapa consiste en la detección de las

cantidades de ARN por qPCR. Y se finaliza con la
carga de datos en el SIISA (Sistema Integrado de
Información Sanitaria Argentino).

ANALISIS DE MICROSATELITES (STR)

Importante en la genética forense, se utilizan para los
datos de filiación (utilizados en la identificación de
nietxs e hijxs recuperadxs). Son secuencias de ADN
en las que un fragmento de 1 a 6 pb se repite de
manera consecutiva. Son regiones no codificantes de
ADN, altamente polimórficos. Se utilizan como
marcadores moleculares, gracias a la capacidad de
generar un perfil genético personal. Se basa en que
en estas regiones microsatélites tiene repeticiones
en tándem, que no codifican nada, pero son
polimórficas, por ende, con mucha variabilidad. Es
decir que son bastante específicos de cada individuo
y su línea familiar.
INMUNOENSAYOS.
Métodos de detección de inmunológicos.
Aplicación clínica – ELISA
• Diagnostico de infecciones por Mo, al
detectar la presencia de Ag por agente
infeccioso.
• Confirmación de la presencia de Ac, pueden
ser Ac contra cualquier Mo, inclusive vacunas,
autoanticuerpos, etc.
• Cuantificación de la presencia de
metabolitos, hormonas, medicamentos etc.
Ejemplos:
• En mujeres embarazadas: medición de HGC-
cualitativa y cuantitativa, toxoplasmosis,
rubeola (inmunoglobulinas)
• Dx SARS-Cov 2, HIV
• Monitoreo de hormonas-tto, por ej transsex.

Es la unión especifica de un anticuerpo con su
antígeno y es la base de varias técnicas que
identifican/cuantifican un antígeno determinado en
una muestra compleja. El más común es el llamado
ELISA: donde uno “pega” en una superficie una
molécula de anticuerpo o de antígeno entonces esto
permite dos tipos de detección:
ELISA en sándwich: con el anticuerpo es esperable
que una molécula de antígeno se una a esta, y a este
antígeno otro anticuerpo. Sirve para detectar
antígenos es decir proteínas virales circulantes,
hormonas, marcadores tumorales.
Lateral Flow Immuno Assay (como los evatest)
La muestra se coloca con los anticuerpos de lo que
queremos ver, y se corre y va pegándose en sándwich
con los Ag según sea positivo o negativo el resultado.
Casi siempre tienen una tira control con Ac de conejo
o algo por el estilo. (funciona con ELISA tipo
sándwich).
EVOLUCION DE LA RTA A LA INFECCION POR
SARS- Cov 2 EN PACIENTES CON COVID 19.
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El virus se detecta en incubación y los primeros días
de síntomas, luego detectamos las Ig.
Hay tests de LFIA para COVID 19 donde tenemos
distintas bandas.
Inmunoblot: sirve para detectar anticuerpos Anti-
HIV. Funciona con el Western Blot:
1. Se separan las proteínas de un lisado de HIV
por electroforesis
2. Se transfieren las proteínas a una membrana
3. La membrana se corta en tiras.
4. Estas tiras se incuban con suero de pacientes
y anticuerpos anti-IgG humana conjugados
con una enzima y sustrato cromógeno.
Ventajas y desventajas de los inmunoensayos:
En la detección de anticuerpos, por ejemplo:
• No determina la presencia de virus circulante
• Hay que tener en cuenta el periodo ventana
• En general no distingue entre inf aguda,
crónica o resuelta
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• Hay falsos negativos en pacientes
hemodializados o inmunosuprimidos o por el
periodo ventana
• Hay falsos positivos en pacientes con otras
patologías o infecciones.
• No sirve para niñxs <18m con madres con
resultado positivo.
• Tiene alta sensibilidad y bajo costo, sobre
todo si lo combinamos con la detección de
Ag.
• No requiere mucho equipamiento ni
instalaciones o precauciones de un
laboratorio de biología molecular.
TERAPIA CON PLASMA DE CONVALECIENTES
EN PACIENTES COVID-19 EN LA PROVINCIA
DE BS AS.
Es una manera de inmunidad pasiva en la que un
paciente que tuvo COVID le “cede” su inmunidad a un
paciente que aun no curso la enfermedad. Se utiliza
en Argentina desde los años 70 por la fiebre
hemorrágica argentina. También se utilizo con la
gripe española.
Si un paciente tuvo COVID-19, no presenta síntomas y
tiene una qPCR negativa, puede donar plasma. Al
momento de donación, se detectan la cantidad de Ac
contra SARS-Cov-2 con un ensayo de ELISA (para
determinar la presencia de cierta cantidad de Ac
contra ciertas proteínas propias de este virus).
También se puede hacer por un test serológico
(realizado en Instituto Leloir), que te indica cantidad
de AC de paciente recuperado contra el virus. Una
vez que se selecciona al paciente recuperado, se
separan los componentes celulares de los no
celulares de la sangre mediante aféresis. Con los no
celulares (plasma completo), se lo dona a un paciente
con enfermedad de COVID-19 en proceso. Cada
paciente puede donar para 2 receptores. El titulo de
Ac necesario es 1/400. Del plasma donado,
aproximadamente el 17% no son viables.
La proteína SPIKE del SARS-COV-2 es la proteína más
inmunogenicamente atractiva para encarar los
posibles tto contra este virus, ya que es la que utiliza
el virus para entrar a las células humanas, es decir,
inicia la infección viral. Se une un receptor que es el
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AC2, receptor de la ECA, y ahí inicia la infección. Por ligarle este injerto.
esto, es importante buscar inhibir esta interacción
entre SPIKE-AC2, para de esta manera inhibir la
infección, mediante la inhibición de la capacidad del
virus de ingresar a la célula.

¿Qué Ac nos interesa que tenga ese paciente que va

a donar en el plasma? Son los que unen a la proteína
SPIKE, de esta manera compite y evite esta
interacción.

PRODUCCION DE PROTEINAS
RECOMBINANTES
Estas proteínas son aquellas que se producen
expresando un gen de un organismo en otro
organismo distinto.
Deben ser biológicamente activas y además se debe
evitar que sean inmunogénicas para el ser humano.
Es importante decidir para cada proteína
recombinante cual es el organismo de expresión más
adecuado:
Producción en bacterias
Producción en levaduras
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION (ER)
Son de origen bacteriano. Las tipo II pueden realizar
dos tipos de cortes:
Extremos cohesivos: hacen una muesca en punto
determinado de una hebra y en un punto diferente en
la hebra complementaria, dejando de 2 a 4 nt
desapareados en cada extremo, por lo tanto, las
porciones de simple hebra que quedan son
complementarias entre si por lo que tienden a unirse.

Producción en células de insectos

Producción en células de mamíferos

Diferencia entre la insulina actual y la porcina: la

ultima generaba mayor rta inmunogénica en
pacientes y además su proceso de producción era
más largo. La insulina fabricada es física y
químicamente equivalente a la insulina producida en
el páncreas humano. Extremos romos: la muesca se realiza en el mismo
En un vector de expresión se inserta el marco abierto lugar en ambas hebras en los enlaces fosfodiester
de lectura para una determinada proteína. Esta opuestos y por lo tanto no quedan hebras simples
proteína, se va a sintetizar en un tipo celular de los remanentes.
antes mencionados.

Se llama recombinante porque tiene ADN de dos

orígenes distintos.

¿Qué vectores debe tener? Un promotor para que

pueda unirse la ARN Pol y un poli linker son sitios
consenso para enzimas de restricción para poder

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REACCION DE UNION | ADN LIGADA

El ADN extraído se digiere con alguna ER quedando

fragmentado. Un determinado fragmento de ADN
aislado deberá unirse con un vector de clonación
digerido con la
misma ER.

El apareamiento de
extremos
cohesivos
complementarios
facilita el proceso
de ligación. Los
fragmentos de
interés se unen por la ADN ligada que da lugar a una
molécula de DNAr.

El fragmento de interés (DNAr) puede ser un

producto de PCR.

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REACCION DE UNION | ADN LIGADA

El ADN extraído se digiere con alguna ER quedando

fragmentado. Un determinado fragmento de ADN
aislado deberá unirse con un vector de clonación
digerido con la
misma ER.

El apareamiento de
extremos
cohesivos
complementarios
facilita el proceso
de ligación. Los
fragmentos de
interés se unen por la ADN ligada que da lugar a una
molécula de DNAr.

El fragmento de interés (DNAr) puede ser un

producto de PCR.