1 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL

CENTRO DEL PERU

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA GAS NATURAL Y
ENERGIA
INGENIERÍA DE BIOPROCESOS

ECOLOGIA MICROBIANA
INTEGRANTES:

• ESPINOZA CHANCA, Max

• GAGO OBISPO, Jhon
• HURTADO VELIZ, Kevin
• RAMOS DE LA CRUZ, Jose

CATEDRÁTICO:

Ing. ÁVILA CARHUALLANQUI Gladys Maritza

 ECOLOGÍA MICROBIANA
• Análisis de comunidades microbianas basadas en
técnicas de cultivo.
• Análisis molecular de las comunidades microbianas.
• Medición de la actividad microbiana en la naturaleza.

2
3

La ecología microbiana trata de la interacción de los

microorganismos entre sí y su ambiente.
Los ecólogos microbianos se dedican principalmente a dos áreas de
estudio.

La biodiversidad
• Qué incluye el aislamiento, identificación y cuantificación
de microorganismos en hábitats diversos.

La actividad microbiana
• Es decir, lo que los microorganismos hacen en sus hábitats.
4 La ecología microbiana tiene dos grandes objetivos:

• Apreciar la biodiversidad de los

microorganismos y entender la interacción
entre los diferentes grupos que componen la
comunidad.

• Medir la actividad de los microorganismos en

la naturaleza y controlar sus efectos en el
ecosistema.
5 I. ANÁLISIS DE LAS COMUNIDADES
MICROBIANAS BASADOS EN
TÉCNICAS DE CULTIVO

Este proceso consiste en separar los organismos de

interés de una comunidad microbiana, un
procedimiento que se conoce como
ENRIQUECIMIENTO, y que permite aislarlos
después en un cultivo axénico. El aislamiento es
importante por que se obtienen cultivos para estudios
detallados y controlados de laboratorio y para su
aplicación en biotecnología y microbiología
ambiental e industrial.
6 ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO
En un ambiente natural no es frecuente encontrar un solo tipo
de microorganismo. Lo que existe son comunidades
microbianas, y el desarrollo de métodos y procedimientos que
permitan el aislamiento y cultivo de microorganismos interés
es un reto para el ecólogo microbiano.

El enfoque más corriente para alcanzar este propósito es la

TECNICA DEL CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO.
7 TÉCNICA DEL CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO
Este método requiere que el medio de cultivo y las
condiciones de incubación sean selectivos para el organismo
que se desea aislar y contra selectivos para los organismos no
deseados.

Por tanto se necesita reproducir lo más fielmente posible los

recursos y las condiciones que se dan en este nicho ecológico
y buscar luego los habitantes potenciales de aquel hábitat
capaces de desarrollarse en las condiciones de
enriquecimiento seleccionadas.
8 Para que un cultivo de enriquecimiento tenga éxito
es necesario contar con un inóculo apropiado (una
muestra que contenga el microorganismo). Por
tanto, la metodología del cultivo de
enriquecimiento se inicia con la elección del
hábitat adecuado.
El cultivo de enriquecimiento suele establecerse
sembrando el inóculo directamente en un medio
altamente selectivo; muchos de los procariotas más
frecuentes pueden aislarse de esta manera.
 Por ejemplo, el microbiólogo holándes Martinus Beijerink, a
9
quien se deben las primeras técnicas de cultivo de
enriquecimiento, aisló por primera vez la bacteria fijadora de
nitrógeno Azotobacter por medio de lo que después se convirtió
en una estrategia clásica de enriquecimiento.

Como Azotobacter puede crecer rápidamente fijando N2 del

aire, los medios de enriquecimiento carentes de amoniaco u
otras formas de nitrógeno fijado son muy selectivos para
este organismo; las bacterias no fijadoras de nitrógeno o las
bacterias fijadoras de nitrógeno anaeróbicas son contra
seleccionadas con este método.
10

Tanto el medio de cultivo como las condiciones de

incubación son críticos para que tenga éxito un cultivo
de enriquecimiento; es decir deben optimizarse tanto los
recursos como las condiciones para tener las mejores
posibilidades de enriquecer el microorganismo que
interesa.
11 LA COLUMNA DE WINOGRADSKY
Tradicionalmente, la columna de Winogradsky se ha utilizado en
el cultivo de enriquecimiento para el aislamiento de bacterias
fototróficas rojas y verdes, de bacterias sulfatoreductoras y de
muchos otros anaerobios.

El nombre corresponde al famoso microbiólogo ruso Sergei

Winogradsky, quien utilizó la columna por primera vez a finales
del siglo XIX para estudiar microorganismos del suelo.

La columna de Winogradsky es un ecosistema anóxico en

miniatura, que puede usarse como suministro a largo plazo de
bacterias para cultivos de enriquecimiento.
 La columna de Winogradsky se prepara con un cilindro
12 de vidrio grande que se llena aproximadamente hasta la
mitad con lodo rico en materia orgánica, y que
preferiblemente contenga sulfuro.

Los sustratos de carbono se mezclan previamente con el

lodo; éstos determinarán que organismos serán
enriquecidos, pero deben evitarse los sustratos
fácilmente fermentables (que pueden llevar a una
formación excesiva de gas). Al lodo se le añade CaCO3 y
CaSO4 como tampón y como fuente de sulfato
respectivamente.
 El lodo se compacta en el envase, cuidando de no atrapar
13 aire. El lodo se cubre con agua de un lago, embalse o
acequia (o agua de mar si se prepara una columna
marina), y se tapa el cilindro para evitar la evaporación.
Se coloca el cilindro cerca de una ventana donde reciba
luz solar atenuada y se deja durante varias semanas.
 En una columna de Winogradsky típica se desarrolla una
14 mezcla de organismos.

Las algas y cianobacterias ocupan rápidamente la parte

superior y al producir O2 ayudan a mantener esta zona
óxica.

El proceso de descomposición en el sedimento lleva

rápidamente a la producción de ácidos orgánicos, alcoholes
y H2, sustratos adecuados para las bacterias sulfato
reductoras.
 El sulfuro producido por las bacterias sulfato
15 reductoras provoca el crecimiento de bacterias
rojas y verdes del azufre.
Estos organismos aparecen generalmente como
zonas de crecimiento en el lodo de la columna,
pero también pueden desarrollarse profusamente
en el agua si los fotótrofos oxigénicos son
escasos.
 Para el muestreo de bacterias fototróficas de la columna
16 se introduce una pipeta larga con la que se recoge un
poco de lodo o agua coloreada. Estas muestras se pueden
usar para microscopía y para inocular medios de
enriquecimiento para aislamiento y caracterización.
17 SESGO EN EL ENRIQUECIMIENTO
Aunque el cultivo de enriquecimiento es una herramienta
poderosa, en muchos casos se produce un sesgo en el
enriquecimiento.

En los cultivos líquidos de enriquecimiento típicos, el organismo

más adaptado a las condiciones escogidas puede convertirse en la
población dominante.

Desgraciadamente, el organismo mejor adaptado en los cultivos

de laboratorio a menudo es sólo un componente minoritario del
ecosistema microbiano, en lugar de ser el mayoritario o el más
relevante desde el punto de vista ecológico.
18 El sesgo en el enriquecimiento puede demostrarse
cuando se comparan los métodos de dilución con el
clásico enriquecimiento en líquido.
La dilución del inóculo seguida de un
enriquecimiento a menudo da lugar a un organismo
diferente que cuando se enriquece un inóculo sin
diluir.
Se cree que la dilución elimina aquellas
poblaciones minoritarias pero de rápido
crecimiento, dando de este modo la oportunidad de
desarrollarse a otros miembros de la comunidad.
Por tanto, la dilución del inóculo es una práctica
común en el cultivo de enriquecimiento en la
microbiología actual.
19 AISLAMIENTO EN CULTIVO AXÉNICO
Los cultivos axénicos (o puros) se pueden obtener de
muchas maneras a partir de un enriquecimiento; los
métodos empleados más frecuentes son la siembra por
estría en superficie (en placa petri), la siembra en
profundidad (agar shake) y la dilución en líquido. Para
aquellos microorganismos que crecen bien en medio de
cultivo sólido (con agar), el método de elección es la
siembra por estría.
 A partir de una población mixta, mediante la
20
siembra por estría se obtienen colonias
separadas; repitiendo esta técnica con una de
estas colonias aisladas se consigue un cultivo
axénico, que puede ser transferido a un medio
líquido.
Las placas sembradas de este modo e incubadas
en las condiciones adecuadas (por ejemplo en
una jarra anóxica para anaerobios) nos permiten
aislar tanto microorganismos aerobios como
anaerobios.
 SIEMBRA EN PROFUNDIDAD Y NÚMERO MÁS PROBABLE
21
El método de siembra en profundidad consiste en la dilución de
un cultivo mixto en tubos de agar fundido; cuando el agar
solidifica, las colonias se desarrollan embebidas en el tubo de
agar en vez de en la superficie, como ocurre en la siembra por
estría en placa.

Es un método de gran utilidad para purificar determinados tipos

de microorganismos anaerobios, por ejemplo, las bacterias
fototróficas del azufre y sulfato reductoras de las columnas de
Winogradsky.
22

Es posible obtener cultivos axénicos mediante

diluciones sucesivas de una suspensión de células en
tubos de agar fundido. A partir de una colonia crecida en
el tubo de mayor dilución utilizada como inóculo, se
puede volver a hacer otro banco de diluciones, de tal
manera que se acabe obteniendo un cultivo axénico.
23
Un procedimiento similar sin usar agar es la dilución seriada de
un inóculo en un medio líquido hasta que el tubo o tubos finales
de la serie no muestran crecimiento.

Utilizando diluciones seriadas de diez en diez, por ejemplo, el

último tubo que muestre crecimiento tiene que haberse originado
a partir de 10 células o menos. Si se repite varias veces este
proceso se obtienen cultivos axénicos. Esta técnica se conoce
como la Técnica del Número Más Probable (NMP).
24

La Técnica del NMP se usa para estimar el número de

microorganismos en alimentos, aguas residuales y en otras
muestras donde hay que evaluar rutinariamente el número de
células. Se puede hacer con medios altamente selectivos y
condiciones de incubación dirigidos a uno o a un pequeño grupo
de organismos, como por ejemplo un determinado patógeno, o
usando un medio complejo para obtener una estimación del
número total de células.
25

Con independencia del método utilizado para purificar

el cultivo, una vez obtenido un supuesto cultivo axénico
es esencial comprobar su pureza. Se utiliza para ello una
combinación de técnicas microscópicas, observación de
las características de la colonia en placas, o en siembras
en profundidad en tubo, y comprobación del
crecimiento en medios donde el microorganismo que
nos interesa aislar crece muy poco, pero que favorecen
el crecimiento de los microorganismos acompañantes.
26

La observación microscópica de un solo tipo

morfológico de célula, junto con unas características
uniformes de la colonia y ausencia de contaminación en
test con diversos medios de cultivo, puede tomarse
como prueba de que un cultivo es axénico (puro).
27
CULTIVOS AXÉNICOS DE ALTA TECNOLOGÍA: LAS
PINZAS DE LÁSER
Además de los métodos clásicos descritos, los avances
tecnológicos han permitido la utilización de nuevas herramientas
para la obtención de cultivos axénicos; una de ellas son las pinzas
(ópticas) de láser.

Las pinzas de láser consisten en un microscopio óptico invertido

equipado con un laser infrarrojo enfocado con precisión y un
instrumento de micro manipulación.
 Una célula individual del campo de visión es atrapada
28 por el haz de rayos laser y separada del resto de
microorganismos. La célula queda atrapada por que la
fuerza creada por el láser que empuja hacia abajo los
objetos pequeños (como las células microbianas) y los
mantiene en el lugar; cuando el haz de láser se desplaza,
las células atrapadas se mueven junto con él. Si la
muestra está en un tubo capilar, se atrapa una única
célula que después se aísla rompiendo el tubo en un
punto entre la célula y el resto de la población.

La célula recogida se introduce entonces en un tubo

pequeño de medio estéril para iniciar su crecimiento
como cultivo axénico.
29

La tecnología de pinzas de láser es especialmente útil para el

aislamiento de bacterias de desarrollo lento, que pueden ser
superadas por el desarrollo rápido de otras poblaciones en los
cultivos de enriquecimiento típicos, o para los organismos
presentes en números tan bajos que podrían perderse con los
métodos de enriquecimiento a partir de la dilución. Y junto con el
uso de tinciones específicas capaces de identificar organismos
determinados en un campo del microscopio, las pinzas de láser se
emplean para seleccionar organismos a partir de una mezcla para
su purificación y posterior estudio en el laboratorio.
30 II. ANÁLISIS MOLECULAR DE LAS
COMUNIDADES MICROBIANAS

A.- VIABILIDAD Y CUANTIFICACIÓN

MEDIANTE TÉCNICAS DE TINCIÓN

B.- TINCIONES GENÉTICAS

C.- PCR: RELACIONANDO GENES

ESPECÍFICOS CON ORGANISMOS
ESPECÍFICOS.
31

A.- VIABILIDAD Y CUANTIFICACIÓN MEDIANTE TÉCNICAS DE TINCIÓN

1. Tinción Fluorescente con DAPI.

2. Tinción de viables.
3. Anticuerpos fluorescentes.
4. Proteína fluorescente verde para el etiquetado celular.
32 1.-Tinción Fluorescente con DAPI:

Las tinciones fluorescentes se han usado mucho para teñir

microorganismos en hábitats opacos. El colorante DAPI (4’,6-
diamido-2-fenilindo) se utiliza con frecuencia para este
propósito; las células teñidas con DAPI presentan fluorescencia
azul brillante y son muy fáciles de ver y enumerar. La tinción
DAPI se emplea para la enumeración de microorganismos en
muestras clínicas, del ambiente y de alimentos.

Dependiendo de la muestra, la tinción con colorantes

fluorescentes no específicos puede representar un problema, pero
el DAPI, que tiñe ácidos nucleicos, no suele reaccionar con la
materia inerte.
33

Por tanto, para muchas muestras de suelo y agua, la tinción DAPI

proporciona una estimación razonable del número de células
presente. Para muestras acuáticas, las células se tiñen en la
superficie de un filtro después de haber filtrado un volumen
determinado de líquido. Estas técnicas sencillas tienen la ventaja
de no ser específicas (tiñen todos los microorganismos de una
muestra), pero con el inconveniente de que no diferencian entre
células vivas y muertas, ni permiten el rastreo de organismos
específicos en el ambiente.
34 2.-Tinción de viables :

Se ha desarrollado una tinción con colorantes fluorescentes que

diferencia entre células vivas y muertas. Esto proporciona
información no sólo del número de organismos de una muestra
sino también de su viabilidad. Esta distinción se basa en la
integridad de la membrana citoplasmática celular.

A la muestra se añaden dos colorantes, verde y rojo; el colorante

fluorescente verde penetra en todas las células, viables o no,
mientras que el rojo, que contiene yoduro de propidio, penetra
sólo en aquellas células cuya membrana ya no se encuentra
intacta y por tanto, están muertas.
35

Las células verdes estaban vivas y las rojas muertas, lo

que ofrece una evaluación instantánea de la viabilidad.
Este método se utiliza con cultivos bacterianos de
laboratorio, pero no es adecuado para el examen
microscópico de hábitats naturales debido a problemas
de tinción inespecífica de los materiales inertes.
36 3.-Anticuerpos Fluorescentes:
Las técnicas de tinción con sustancias fluorescentes pueden
hacerse más específicas con el empleo de anticuerpos
fluorescentes.

La gran especificidad de los anticuerpos frente a los

constituyentes de la superficie de un organismo particular puede
explotarse para identificar o rastrear un organismo en un hábitat
complejo; por ejemplo, suelo o una muestra clínica que contenga
una mezcla de muchos organismos.
37

El método requiere la preparación de anticuerpos específicos

contra los organismos que interesan, lo cual es largo y laborioso.

Sin embargo, para el caso de microorganismos de importancia

clínica, se dispone comercialmente de anticuerpos de alta
especificidad.
38 4.-Proteína Fluorescente Verde para el Etiquetado Celular:

En el genoma bacteriano se puede insertar un gen que codifica

una proteína fluorescente verde (GFP, green fluorecens protein).
Al expresarse, las células que contienen la GFP aparecen de color
verde cuando se observan con un microscopio de luz ultravioleta.

Aunque no resulta útil para el estudio de poblaciones naturales

(por que estas células carecen del gen GFP), las células
etiquetadas con GFP se pueden introducir en un medio, como las
raíces de las plantas y seguir con el microscopio la cepa
etiquetada.
39

Con este método los ecólogos microbianos pueden estudiar in

situ la competencia microbiana entre la microbiota nativa y la
cepa con GFP introducida o evaluar el efecto de la perturbación
en el ambiente.
La GFP también se ha usado ampliamente en cultivos de
laboratorio como gen “indicador”.
40

B.- TINCIONES GENÉTICAS

1.- TINCIÓN FILOGENÉTICA CON HIBRIDACIÓN

FLUORESCENTE IN SUTU (FISH, fluorescen in situ
hybridization).

2.- TINCIÓN DE CROMOSOMAS Y TRANSCRIPCIÓN

INVERSA IN SITU.
41 1.-TINCIÓN FILOGENÉTICA CON HIBRIDACIÓN
FLUORESCENTE IN SUTU :

Los colorantes filogenéticos son oligonucleotidos fluorescentes

complementarios en la secuencia de base a las secuencias en el
ARNr 16s o 18s. Los colorantes filogenéticos penetran en la
célula, donde hibridan con el ARNr directamente en los ribosomas.

Como se han identificado sondas filogenéticas para especies

microbianas individuales, así como para dominios enteros de
organismos, el grado de especificidad de un colorante filogenético
puede controlarse mediante la secuencia de la sonda fusionada. La
FISH permite identificar o rastrear un organismo particular o un
grupo de organismos relacionados, dependiendo de la
especificidad de la sonda.
 2.-TINCIÓN DE CROMOSOMAS Y TRANSCRIPCIÓN
42
INVERSA IN SUTU:

La tinción de cromosomas se emplea para identificar genes

específicos de la microbiota de muestras naturales, mientras que
la transcripción se dirige a un ARNm específico (es decir genes
expresados).

La tinción de cromosomas se inicia con el marcado fluorescente

de una sonda de oligonucleótidos o del gen completo, de un
conjunto de genes, o incluso de un genoma completo digerido
para obtener sondas pequeñas. Las sondas se utilizan para
averiguar que organismo(s) de una muestra contiene(n) el gen o
los genes presentes en las sonda(s).
43

La tinción de cromosomas es útil para identificar bacterias que contienen genes

específicos, como los que codifican la nitrogenasa (responsable de la fijación del
nitrógeno), los componentes del centro de reacción fotosintético, o vías autotróficas
específicas.

Los números de células fluorescentes en cada caso darían una estimación de las
bacterias fijadoras de nitrógeno, fotótrofas o autótrofas, respectivamente, en una
muestra natural.
 A diferencia de la técnica anterior, la transcripción inversa in
44
situ, busca si un organismo está expresando un gen o genes
determinados en la naturaleza en un momento determinado.

El método utiliza una sonda que hibrida con un ARNm

específico previamente transcrito por las células en una
muestra.

Una vez que la sonda reacciona, tiene lugar la transcripción

inversa, produciendo un ADN complementario que es
amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).

Finalmente, el ADN amplificado reacciona con una sonda

fluorescente.
 C.- PCR: RELACIONANDO GENES ESPECÍFICOS CON
45
ORGANISMOS ESPECÍFICOS.

Muchos estudios en ecología microbiana no necesitan aislar los

microorganismos, ni siquiera identificarlos por microscopía con las tinciones
antes descritas.

Generalmente, el objetivo de un estudio es evaluar la biodiversidad de un

hábitat sin emplear técnicas de cultivo, ni observar células. Con este objetivo,
se han aislado y caracterizado genes específicos como medida de la
biodiversidad de la comunidad microbiana. Como los genes específicos están
ligados frecuentemente a organismos específicos la detección del gen implica
la presencia del organismo.
46 Las principales técnicas en este tipo de análisis microbiano
son:
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y análisis de la comunidad
microbiana.

Electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE):

Separación de genes similares.

Clonación molecular

Secuenciación y análisis de ADN

47
III. MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD MICROBIANA
EN LA NATURALEZA
Cualquier medición de la actividad microbiana (reducción de
sulfato, fotosíntesis, respiración etc.) en una muestra natural es
una estimación colectiva del conjunto de la comunidad
microbiana.

• Radioisótopos • Microelectrodos • Isótopos estables

48