UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE NICARAGUA

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

MEDICINA
Componente: Biología molecular.

Tema: Secuenciación de Sanger.

Elaborado por: Osmit Usiel Salazar Cáceres. #180.

Año: 3ro.

Docente: Lic. Elohina Campos.

Fecha de entrega: Viernes 30 de junio del 2023.

¡A LA LIBERTAD POR LA UNIVERSIDAD!

 ¿Cuál es el principio de la secuenciación de Sanger?
La secuenciación de Sanger consiste en hacer muchas copias de una región blanco de ADN. El primer método de
secuenciación ampliamente utilizado fue desarrollado por Frederick Sanger en 1977. Este método, llamado secuenciación de
Sanger, le valió a Sanger el Premio Nobel de 1980 y fue la base de las técnicas utilizadas para secuenciar todo el genoma humano,
una hazaña que se completó en 2001 como la culminación del Proyecto Genoma Humano
El método de Sanger se basa en el uso de la ADN polimerasa para sintetizar cadenas de ADN con una terminación específica.
Con este método se generan fragmentos de ADN de todos los tamaños posibles que se puedan distinguir entre sí, por el tipo de
marcaje que llevan o por la incorporación de un terminador específico. Las enzimás del tipo de la ADN polimerasa requieren
de un templado de ADN de cadena sencilla, y realizan la síntesis de la hebra complementaria extendiéndola a partir de un
iniciador en dirección 5' a 3'. Entre los componentes de la reacción se incluyen nucleótidos que no tienen un grupo hidroxilo
en su extremo 3' (ddNTP), para poder obtener una terminación especifica en las cadenas. Una vez que el ddNTP se incorpora
como el residuo terminal, evita que la cadena de ADN sintetizada continúe extendiéndose. La incorporación de los ddNTPs es
al azar, de tal forma que se obtienen fragmentos de todos los tamaños posibles que terminan en un residuo especifico.

Pasos de la secuencia de Sanger:

1. Amplificación del ADN: Lo primero que hay que hacer para secuenciar una molécula por el método de Sanger
es amplificar el ADN que queremos estudiar. Esto servirá para obtener muchas copias del fragmento que queremos analizar.
Actualmente lo que se hace es amplificar el ADN mediante una PCR.
2. Preparación de la muestra: El segundo paso es añadir el ADN amplificado a las 4 reacciones independientes que se
han de preparar, cada una de ellas con: Una ADN polimerasa, Un primer específico, Uno de los cuatro tipos de
nucleótidos (A, C, T y G) marcado radiactivamente, El resto de nucleótidos no marcados , En cada una de las disoluciones
añadiremos una pequeña cantidad de un solo tipo de didesoxinucleótido.

3. Acción de la ADN polimerasa: El siguiente paso será propiciar la síntesis de nuevas cadenas de ADN a partir de las
dobles cadenas problema, amplificadas en pasos anteriores. Para ello, se aumenta la temperatura de las reacciones, lo que
provoca la separación de las dos cadenas del ADN del que queremos conocer la secuencia. Luego dejaremos enfriar para
favorecer la unión de los primers o cebadores.
Una vez unido el cebador, comenzará la reacción de la ADN polimerasa, que irá añadiendo nucleótidos marcados, hasta que
inserte un didesoxinucleótido, se detenga la síntesis y la nueva cadena se suelte. Entonces, la ADN polimerasa empieza de
nuevo. De este modo, en cada una de las reacciones obtendremos fragmentos de diferentes tamaños, acabados en el
didesoxinucleótido que hayamos empleado en ellas.

4. Electroforesis: Tras la actuación de la ADN polimerasa, el resultado de cada una de las cuatro reacciones se somete a
una electroforesis, una electroforesis consiste en colocar una mezcla de moléculas con diferente tamaño y/o carga eléctrica
en un “filtro” o soporte poroso, que puede ser un papel, en un gel o en acetato de celulosa. Este filtro se introduce en una
solución y se somete a un campo eléctrico. De este modo, las moléculas se moverán por bandas más o menos rápido por el
filtro según su carga y tamaño. Por ejemplo, el ADN, que tiene carga negativa, migrará hacia el polo positivo.

1. Sanger utilizó didesoxinucleótidos

para provocar la terminación de la
cadena durante la síntesis de ADN in
vitro.
2. La electroforesis de los productos
en cada tubo de reacción clasificaría
las cadenas terminadas por tamaño.
3. El análisis de la posición de los
fragmentos en el gel revelaría la
secuencia. El nucleótido en el
 extremo 3' del fragmento recién sintetizado
más largo sería complementario al primer
nucleótido en el extremo 5' de la plantilla
desconocida. El siguiente
fragmento más largo terminaría
con el complemento del siguiente
nucleótido, y así sucesivamente.
2. Al configurar una reacción
de secuenciación de Sanger,
cada reacción debe incluir:

Sus ingredientes son similares

a los necesarios para
la replicación del ADN en un
organismo o para la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), que copia el ADN in vitro. Los ingredientes son:
• ADN a secuenciar
• ADN polimerasa
• Primer o cebador (una secuencia de ADN que servirá como base para comenzar la síntesis de ADN) cebadores
directos e inversos.
• Nucleótidos (A, T, C y G). Uno de ellos, marcado radiactivamente.
Didesoxinucleótidos (ddA, ddT, ddG y ddC), desoxirribonucleótidos con una pequeña modificación en el grupo
unido al carbono 3 de la ribosa.
• Tampón

3. ¿Qué son los didesoxinucleótidos? Echa un vistazo a las figuras y explica:

El método de Sanger implica la síntesis de ADN in vitro utilizando didesoxinucleótidos. In vitro significa "en un tubo de
ensayo", en lugar de en una célula viva. El prefijo "dideoxi" significa "desoxigenado dos veces". Esto se debe a que los
monómeros del ADN, los desoxirribonucleótidos (o simplemente "desoxinucleótidos") se han desoxigenado una vez: tienen
un átomo de oxígeno menos que los ribonucleótidos, el monómero del ARN.

Los nucleótidos didesoxi son similares a los nucleótidos normales, o desoxi, pero con una diferencia clave: no tienen grupo
hidroxilo en el carbono 3' del anillo de azúcar. En un nucleótido normal, el grupo hidroxilo 3' actúa como un"gancho" que
permite que un nuevo nucleótido se añada a una cadena existente.Una vez que se añade a la cadena un nucleótido didesoxi,
ya no hay un hidroxilo sobre el que se puedan agregar más nucleótidos. La cadena termina con el nucleótido didesoxi, que
está marcado con pigmento de un color particular dependiendo de la base (A, T, C o G) que lleve.

En la molécula "A", es un desoxinucleótido di, el átomo de Carbono numero 3 tiene 1 átomo

de Hidrógeno unido a él y al compararlo con el Carbono número 3 de la desoxirribosa que
tiene 1 -OH unido a él, por lo tanto, la molécula "A" se ha desoxigenado 2 veces y es un
didesoxinucleótido.

En la molécula "B", el numero 2 representa 1 átomo Carbono en la desoxirribosa y con 1

átomo de Hidrógeno unido a él.

En los ribonucleótidos "C", se encuentra 1 -OH en ese lugar, por lo

tanto, la desoxirribosa es ribosa desoxigenada.
 Hay que tener en cuenta Todas las moléculas anteriores tienen 3 grupos
fosfato unidos a ellas, cuando se sintetizan los polímeros de ácido
nucleicos: ADN y ARN, 2 de estos grupos fosfato se romperán y
formarán enlaces
con las moléculas
H20, esta
reacción libera
energía libre
importante para
la célula para
crear ADN o
ARN.

4. ¿Cómo se produce la incorporación de ddNucleótidos

durante la replicación del ADN causando la terminación
de la cadena? Echa un vistazo a la figura y explica:

La diferencia química entre los desoxinucleótidos y los didesoxinucleótidos está en el corazón de la secuenciación de Sanger.
Esto se debe a que cuando los didesoxinucleótidos (molécula "A", a la derecha) se incorporan a una cadena de ADN recién
sintetizada (d) por la ADN polimerasa (que no se muestra), no pueden formar un enlace azúcar-fosfato (e) entre el
didesoxinucleótido y el siguiente nucleótido (b) en el extremo 3 'de la cadena en crecimiento. Eso causa la terminación de la
cadena. Esa terminación de la cadena es la base del método de secuenciación de Sanger.

Sanger introdujo in vitro un nucleótido con una variación química para lograr un efecto especifico. En lugar de usar
desoxirribonucleosido trifosfato(Dntps), que finalizan la polimerización, uso didesoxirribonucleosido trifosfato (Ddntps).
Ambos son idénticos a excepción de que el ultimo, carece de un grupo hidroxilo en la porción '3. El efecto hace que un nuevo
nucleótido no pueda introducirse, por lo que sirve como herramienta para finalizar la polimerización de una hebra en
crecimiento. Por esa característica los didesoxinucleótidos, una vez que se agregan a la cadena (los ddNTP) que se está
sintetizando, no puede unirse otro nucleótido se frena la síntesis, siendo entonces el nucleótido terminal. Obtenemos de
este proceso de replicación de DNA, fragmentos de cadenas de DNA de distintas longitudes.

5. ¿Cómo la terminación de la cadena de ddnucleótidos revela las secuencias de ADN? Imagina que eres
Frederick Sanger, tratando de averiguar la secuencia de una hebra de ADN de 9 nucleótidos de largo. Para
ayudar a tu aprendizaje, te voy a decir que la secuencia que te interesa se muestra en azul. Dibuje un
diagrama del experimento.

A Sanger no le preocupaba el 5′ ACAA 3′, que se muestra en negro. Esto se debe

a que esos nucleótidos representan sitios de unión de cebadores conocidos.

Lo que hizo Sanger fue clonar muchas copias de esta secuencia, utilizando técnicas de clonación de genes. Después
de 1983, este tipo de clonación podría haberse realizado mediante PCR. Con mucho ADN en la mano, Sanger dividió
el ADN en cuatro fracciones, que colocó en cuatro tubos de reacción separados. Cada tubo contenía el ADN que
Sanger estaba tratando de secuenciar. Cada tubo también contenía muchas copias de cada uno de los ingredientes
necesarios. Estos fueron:

1. Una secuencia blanco del cebador. Este es un corto tramo de ADN que se unirá al sitio de unión del cebador.
En este caso, el cebador 3′ TGTT 5′ se unirá con 5′ ACAA 3′. El cebador se creó con nucleótidos radiactivos para que
los fragmentos de ADN con los que se uniría pudieran visualizarse exponiéndolos a una película de rayos X.

2. ADN polimerasa. Esta es la enzima clave en la replicación del ADN

 3. Desoxinucleótidos libres. Sanger habría añadido
desoxinucleótidos con cada una de las cuatro bases a cada
tubo: dATP (con adenina), dTTP (con timina), dGTP (con g
uanina) y dCTP con citosina). Tenga en cuenta dos cosas: 1)
"dATP", "dTTP" y así sucesivamente indican el
desoxirribonucleótido normal que se utiliza durante la
síntesis de ADN. 2) las letras "TP" indican que cada
nucleótido tiene tres grupos fosfato unidos a él, lo que permite
que sea incorporado por la ADN polimerasa en una nueva
hebra. Por ejemplo, la molécula "B" en la figura 3 anterior es
trifosfato de guanina o dGTP.

4. Cada tubo contendría un tipo diferente de

didesoxinucleótido. Esta es la forma de nucleótido que está
doblemente desoxigenado, lo que causa la terminación de la
cadena. Cada tubo contenía uno de los siguientes: ddATP (con
adenina), ddTTP (con timina), ddGTP (con guanina) y ddCTP con citosina).

Ahora, tratemos de imaginar lo que habría sucedido en el tubo # 4, el que tiene

ddCTP. El imprimador se uniría con el sitio de unión del imprimador al comienzo
de la hebra de la plantilla, en el extremo 3 'de la plantilla.

Cuando la ADN polimerasa llegó a la primera G (inmediatamente después del

cebador) pudo insertar ddCTP. Eso resultaría en el fragmento más corto posible:
solo un nucleótido más allá del cebador, como se muestra a continuación.

Pero también es posible que la ADN polimerasa hubiera insertado un dCTP (el nucleótido "normal") y continuara
alargando la nueva hebra hasta que llegara al 7º nucleótido de la cadena plantilla, que es la 2ª "G". En ese momento,
la ADN polimerasa podría insertar otro ddCTP, que se vería así:

6. Estás haciendo la secuenciación de Sanger en la plantilla 5'CTGACTTCG3'. En el

tubo de reacción que tiene ddGTP, ¿cuántos fragmentos se producirán?

Se producirán 3 fragmentos.
Si estás realizando la secuenciación de Sanger en la plantilla 5'CTGACTTCG3' y en el tubo de reacción se encuentra presente
el ddGTP, se producirán tres fragmentos de ADNde diferentes longitudes.

El ddGTP corresponde al didesoxinucleótido de guanina (G). Cuando se encuentra en el tubo de reacción y se incorpora
durante la síntesis de la cadena de ADN, detendrá la elongación de la cadena en las posiciones en las que debería haber una
guanina. En la secuencia 5'CTGACTTCG3', hay tres guaninas (G) en las siguientes posiciones: 3°, 7º y 10º. Por lo tanto, la
terminación de la cadena ocurrirá en estas tres posiciones cuando se utilice el ddGTP.

Como resultado, se generarán tres fragmentos de ADN de diferentes longitudes:

• El primer fragmento se extenderá desde la posición I hasta la posición 3, y tendrá una longitud de 3 nucleótidos (CGA).
• El segundo fragmento se extenderá desde la posición 4 hasta la posición 7, y tendrá una longitud de 4 nucleótidos
(CTTC).
• El tercer fragmento se extenderá desde la posición 8 hasta la posición 10, y tendrá una longitud de 3 nucleótidos (G).

Estos fragmentos de ADN de diferentes longitudes se separarán mediante electroforesis en un gel, y la lectura de los fragmentos
y la identificación de los fluoróforos correspondientes revelarán la secuencia de bases del ADN original.
 7. En el tubo número 3, el tubo con ddGTP, obtendrías tres posibles productos de reacción. Por favor,
revele cuáles son:

REACCIONES EXTRA
Usos y limitaciones

La secuenciación de Sanger arroja secuencias de a la calidad para

segmentos relativamente largos de ADN (de hasta
aproximadamente 900900900 pares de bases). La técnica suele
utilizarse para secuenciar fragmentos individuales de ADN, como
plásmidos bacterianos o ADN copiado en la PCR

Sin embargo, la secuenciación de Sanger es costosa e ineficiente

para proyectos a gran escala, como la secuenciación de un genoma
completo o un metagenoma (el "genoma colectivo" de una
comunidad microbiana). Para tareas como estas, las nuevas
técnicas de secuenciación a gran escala son más rápidas y menos
costosas.

EN BASE A LA PREGUNTA #5 En el método de Sanger (1977), la

estrategia es hacer cuatro reacciones diferentes de síntesis de ADN,
utilizando un ddNTP distinto en cada tubo. Con la mezcla del
nucleótido normal (dNTP) y su 21 terminador (ddNTP), se pueden
generar fragmentos complementarios de diferentes tamaños que
terminan en el mismo nucleótido. Después, estos fragmentos se
pueden separar en un gel de electrotoresis con cuatro carriles
distintos, para determinar la secuencia del templado.

PREGUNTAS EXTRAS:

¿Qué es la secuenciación de sanger?

El método de secuenciación de didesoxinucleótidos es una forma de secuenciar una secuencia de ADN relativamente
sencilla. Se trata de una técnica desarrollada por el bioquímico británico Frederick Sanger a mediados del siglo XX.

El método de secuenciación de Sanger se basa en la acción de las ADN polimerasas. Estas enzimas tan importantes para
nuestras células son capaces de unirse a una cadena de ADN a la que se le haya unido un fragmento corto de ADN
complementario (cebador) previamente e ir añadiendo nucleótidos. De este modo, a partir de una cadena simple, podemos
obtener una doble cadena. Este proceso que ocurre de forma natural en nuestras células es el que ocurre también en la
secuenciación de Sanger, salvo por un ingenioso detalle: la presencia de didesoxinucleótidos. Cuando una polimerasa
inserta un didesoxinucleótido, la síntesis de la nueva cadena se detiene.

En la actualidad la reacción de secuenciación se basa en una modificación de la PCR con dideoxinucleótidos marcados con
fluoróforos y se resuelve mediante una electroforesis capilar.

La secuenciación de ADN permite determinar el orden de los nucleótidos (A, G, C, T) en una molécula. El descubrimiento
de la estructura de la molécula de ADN como una doble hélice de cadenas complementarias y la demostración de que esta
molécula contiene la información genética puso en evidencia la importancia de descifrar el orden de los nucleótidos en la
cadena de ADN.
 ¿Cuál es la utilidad de la secuenciación de sanger?

LA CAPACIDAD DE SECUENCIAR GENOMAS DE FORMA RUTINARIA ABRE NUEVAS POSIBILIDADES EN LA

INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA Y EN APLICACIONES BIOMÉDICAS. POR EJEMPLO, LA SECUENCIACIÓN DE BAJO
COSTO ES UN PASO HACIA LA MEDICINA PERSONALIZADA: UN TRATAMIENTO MÉDICO A LA MEDIDA DE LAS
NECESIDADES DE UN INDIVIDUO CON BASE EN LAS VARIANTES GÉNICAS DE SU GENOMA.

La secuenciación de didesoxinucleótidos fue un bombazo científico en la década de los 70, que impulsó la creación de
proyectos tan importantes como el Proyecto Genoma Humano, que empezaba a “cocinarse” como una posibilidad entre los
científicos de todo el mundo. Después de unos años, en los años 90, comenzó formalmente este proyecto, gracias al avance
en este tipo de técnicas de secuenciación y a la aparición de la PCR.

Actualmente la secuenciación de Sanger sigue utilizándose en los laboratorios, pero tiene sus limitaciones. Por ello, se han
desarrollado diferentes técnicas de secuenciación de nueva generación, mucho más rápidas y económicas.

La secuenciación de Sanger es el estándar de oro para la tecnología de secuenciación ya que proporciona un alto grado
de precisión, capacidades de lectura prolongada y la flexibilidad para admitir una amplia gama de aplicaciones en muchas
áreas de investigación. La secuenciación de ADN nos ha aportado grandes avances en diferentes ambitos y sus aplicaciones
son muy variadas, llegando a ser aplicable a tecnologías ambientales (calidad de aire y contaminación).

¿En qué momento lo utilizamos y cómo se interpreta?

La secuenciación de Sanger se utiliza en diferentes momentos en la investigación biológica y médica ejemplo:

Determinar la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN.

Identificar mutaciones genéticas y variaciones en la secuencia de ADN.
Estudiar la evolución de las especies y las relaciones filogenéticas entre ellas.
Investigar la función de los genes y las proteínas.
Desarrollar terapias génicas y medicamentos personalizados La secuenciación de Sanger arroja secuencias de alta
calidad para segmentos relativamente largos de ADN (de hasta 900 pares de bases).

Esta técnica la utilizamos para secuenciar fragmentos individuales de ADN, como plásmidos bacterianos o ADN copiado en
las PCR. La interpretamos dando lectura en orden a A, C, G, T, (bases ligadas a cadenas fosfóricas), que simbolizan los
nucleótidos de una banda de ADN, (la lectura de las bandas de ADN obtenidas después de la electroforesis en gel. Cada
banda representa un fragmento de ADN de una longitud específica que termina en un nucleótido específico.)

La secuenciación de Sanger es útil para segmentos relativamente largos de ADN donde arroja secuencias de alta calidad. Las
técnicas suelen utilizarse para secuenciar fragmentos individuales de ADN, como plásmidos bacterianos o ADN copiado en la
PCR. Sin embargo, la secuencia de Sanger es costosa e ineficiente para provectos a gran escala, como la secuencia de un genoma
completo o un meta genoma (el "genoma colectivo" de una comunidad Microbiana). Para tareas como estas, las nuevas técnicas
de secuenciación a gran escala son más rápidas y menos costosas.
 BIBLIOGRAFIA
Karp G. Biologia celular y molecular. McGraw-Hill Interamericana;
2000.
Salazar A. Biología Molecular: Fundamentos y aplicaciones en las
ciencias de la salud. McGRAW-HILL INTERAMERICANA; 2013