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  • Molecular Secuenciacion

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    AGUILAR HERNANDEZ MARIANA ITZEL
    12 vistas2 páginas
    Este documento describe diferentes técnicas de biología molecular como PCR anidada, multiplex, RT-PCR y secuenciación. La PCR anidada utiliza el producto de una primera PCR como molde para una segunda PCR. La multiplex permite amplificar múltiples regiones de ADN en una sola reacción. La RT-PCR determina la presencia de ARNm. La secuenciación de Sanger usa dideoxinucleótidos terminales que detienen la elongación y producen fragmentos de diferentes tamaños.

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    MOLECULAR

    PCR anidada:
     utiliza como templado un producto de PCR
     La primera PCR se usa para amplificar un fragmento de mayor longitud que servirá como
    molde de ADN para la segunda PCR

    MULTIPLEX:
     meter primer para región 1-2, región 3-4….
     Ubicados en el mismo genoma
     Como para e. coli, salmonela…
     Sondas Taqman
    -------------------------------------------------------------------------------------------------
    Punto final: presencia de la banda
    RT-PCR: si no hay amplificación el ARNm no existe
    QUE NO CONOCES: iniciadores consenso entre secuencias muy parecidas entres distintas
    especies.
    RT: es en donde las moléculas se aparean, temperatura depende del primer y de su tamaño
    SE COMPLETA POR ADN POIMERASA.

    SECUENCIACION
    INTERPRETACION DE LA ELECTROFORESIS (permite ver en que onde quedan los
    fragmentos)
    ENZIMATICO DE SANGER
    CLASICA
    ddntp: Dexininuclotidos: LIBRE EL C3’ PARA SEGUIR AÑADIENDO FALTA UN OXIGENO
    EN CARBONO EM 2’
    ELIMINAN CARBONO EN 3’
    Dide: separa en electroforesis veríamos en una solo banda, veríamos bandas de diferente tamaño sin
    meter restricción (enzimas)
    No se saben donde se van a añadir y donde se junte, ya no se añade mas
    Truco:
    - Hacer PCR igual para todos, tomas una muestra y lo divides entre 4 tubos, llevan
    polimerasa, dntp.. Pero para cada uno agrega un dixinucleotidos agregas uno en cada uno
    (A.G.C.T)
    - Resultado pasa por el resultado
    - Mas ligeros al final
    - Mas pesados cerca del pozo
    - Ir reconstruyendo la secuencia
    - Ultima banda (mas ligera y pequeña) mas cercano al extremo 5’

    -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

    AUTOMATIZADO

    ELECTROFORESIS GEL CAPILAR

    - Agrega todos los ddntps


    - Material es muy poco, no tantas copias para un banda
    - Lector laser
    - Inter. Software
    - Dide: no tienen el O en C3’ pero tiene flosrofolo añadido, se pueden meter en misma
    mezcla porque tienen color distinto
    - Pico mas alto de cada uno de los fragmentos que caen en el capilar por gravedad bajan los
    mas pequeñitos
    - Tamaño: hubo muchas copias
    - 1983 PCR

    HOMOLOGIA GENES: RATON Y HUMANO


    CRAIG VENTER: PRIMER ORGANISMO SINTETICO
    FRANCIS COLLINS
    E.COLI: 4000 BASES
    CONSORCICO: TELOMERO UNO POR UNO, ALINEADO EN COMPU, MAS CARA
    CELERA SHOTGUIN: DE ESCOPETA, FRAGMENTAN ADN Y LANZABAN PRIMERS
    EN ADN, MILES DE COMPUTADORAS RENDIRIZANDO LA ALINEACION
    AGARRABA FRAGMENTOS, LOS CLONABA Y CORTABA CON ENZIMA, USABA
    BAC PARA MUY GRANDES

    CADENA LARGA
    ESPECIE DEPENDE LA CANTIDAD DE ADN

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