Clonación por PCR

La clonación por PCR se basa en un proceso llamado ligación, el cual es un

método para insertar un fragmento de ADN dentro de un vector usando una ADN
ligasa. La razón por la cual la ligación es importante en este paso es porque es
responsable de insertar el producto de PCR dentro un un plásmido con una ¨cola
T¨.

A través de PCR se amplifican insertos que contienen un residuo de adenina en el

extremo 3’ de los fragmentos de ADN (extremos de ‘cola A’). Un plásmido vector
con una ¨cola T¨ contiene un único 3’ deoxitimidina (T) en cada extremo de los
brazos del plásmido lineal. Por tanto, estos productos de PCR pueden ser ligados
dentro de vectores con ¨cola T¨ usando una ADN ligasa, luego este paso es
seguido por transformación.

Puedes escoger este método cuando las enzimas de restricción no son

compatibles o existe un sitio de restricción interno en su inserto de ADN.

Una desventaja de este método es que necesitará un vector específico con ¨cola
T¨ para llevar a cabo el proceso de clonación. Sin embargo, los vectores con ¨cola
T¨ pueden no tener elementos de soporte para tu proteína de interés, como por
ejemplo la una región promotora o una etiqueta de proteína.
ETAPAS DE UN PROCESO PCR
La PCR se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para
replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas
temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí
tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN
vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente.

Actualmente, el proceso de la PCR se realiza mediante un equipo llamado

termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la
temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores
modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los
tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica.

Esta técnica por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de

temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes
temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de
temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque
térmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al
final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Las
temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran
variedad de parámetros. Estos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN,
la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la
temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se
desea amplificar. A continuación se mencionan las etapas que estan involucradas
en el proceso PCR.
- INICIO: Consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98
°C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene
durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran
activación por calor.

- DESNATURALIZACIÓN: En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan

las dos cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de
diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más
habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende,
por ejemplo, de la proporción de guanina y citosina que contenga la cadena, como
también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica
de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la
desnaturalización.

- ALINEAMIENTO O UNIÓN DEL CEBADOR: A continuación, el cebador se unirá

a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la
temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así
el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN
(unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar
a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y
el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de
la región de la molécula que va a ser amplificada.

- EXTENSIÓN O ELONGACIÓN DE LA CADENA: En esta etapa actúa la

polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y
partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo
ADN.
La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra
molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo
5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN
creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN
polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima
actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende
tanto de el ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que
se va a amplificar. Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima,
la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.

- ELONGACIÓN FINAL: Se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante

5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN
de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

- CONSERVACIÓN: Este paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo

indefinido para conservar la reacción a corto plazo.
Aplicaciones de la PCR
Mediante el uso de la PCR, una secuencia de ADN se puede amplificar
millones o miles de millones de veces y producirá suficientes copias de
ADN para que se analicen mediante otras técnicas. Por ejemplo, el ADN
se puede visualizar por electroforesis en gel, enviar a secuenciar o digerir
con enzimas de restricción y clonar en un plásmido.

La PCR se utiliza en muchos laboratorios de investigación, y también

tiene aplicaciones prácticas en medicina forense, pruebas genéticas y
diagnósticas. Por ejemplo, la PCR se utiliza para amplificar genes
asociados con trastornos genéticos a partir del ADN de los pacientes (o
de ADN fetal, en el caso de pruebas prenatales). La PCR también puede
utilizarse para detectar el ADN de una bacteria o un virus en el cuerpo de
un paciente: si el patógeno está presente, es posible amplificar regiones
de su ADN de una muestra de sangre o tejido.

Problema de ejemplo: la PCR en ciencias

forenses
Imagina que trabajas en un laboratorio forense. Acabas de recibir una
muestra de ADN de un cabello encontrado en la escena de un crimen
junto con muestras de ADN de tres posibles sospechosos. Tu trabajo es
examinar un marcador genético determinado y ver si alguno de los tres
sospechosos coincide con el ADN del cabello para este marcador.

El marcador se presenta en dos alelos o versiones. Uno contiene una

secuencia repetida una vez (región marrón en la siguiente imagen) y el
otro contiene la secuencia repetida dos veces. En una reacción de PCR
con cebadores que flanquean la región con las secuencias repetidas, el
primer alelo produce un fragmento de ADN de 200200200 \
text{pb}pbstart text, p, b, end text y el segundo produce un fragmento
de 300300300 \text{pb}pbstart text, p, b, end text:
 Alelo marcador 1: los cebadores que flanquean la región de secuencias
repetidas amplifican un fragmento de 200 pb de ADN.

Alelo marcador 2: los cebadores flanquean la región de repetidas

amplifican un fragmento de 300 pb de ADN

Realizas PCR para las cuatro muestras de ADN y visualizas los

resultados por electroforesis en gel, como se muestra a continuación:
 El gel tiene cinco carriles:

Primer carril: marcador de ADN con bandas de 100, 200, 300, 400 y 500
pb.

Segundo carril: ADN de la escena del crimen, banda de 200 pb.

Tercer carril: ADN del sospechoso #1, banda de 300 pb.

Cuarto carril: ADN del sospechoso #2, bandas de 200 y 300 pb.

Quinto carril: ADN del sospechoso #3, banda de 200 pb.

¿Cuál es el sospechoso cuyo ADN coincide con el de la escena del

crimen para este marcador?
Escoge 1 respuesta:
Escoge 1 respuesta:

El sospechoso 111


El sospechoso 222


El sospechoso 333


Ninguno de los sospechosos

[Pista]
Comprobar

Más sobre PCR y análisis forense

En pruebas forenses reales de ADN para una escena del crimen, los
técnicos harían un análisis conceptualmente similar al del ejemplo
anterior. Sin embargo, se compararía un número de diversos marcadores
(no solo un marcador como en el ejemplo) entre el ADN de la escena del
crimen y el ADN de los sospechosos.

Además, los marcadores utilizados en un análisis forense típico no tienen

solo dos formas diferentes. Por el contrario, son
altamente polimórficos (poli = muchos, morfo = forma). Es decir, se
presentan en muchos alelos que varían en pequeños incrementos de
longitud.

El tipo de marcador más usado en el análisis forense,

llamado repeticiones cortas en tándem (STR, por sus siglas en inglés),
consiste en muchas copias repetidas de la misma secuencia corta de
nucleótidos (de 222 a 555 nucleótidos de largo, por lo general). Un alelo
de un STR puede tener 202020 repeticiones, mientras que otro podría
tener 181818 y otro solo 101010^11start superscript, 1, end superscript.

Al examinar múltiples marcadores, cada uno de los cuales presenta

muchas formas alélicas, los científicos forenses pueden construir una
"huella dactilar" genética única a partir de una muestra de ADN. En un
análisis típico de STR que utiliza 131313 marcadores, la probabilidad de
un falso positivo (que dos personas tengan la misma "huella dactilar" de
ADN) ¡es menor a 111 en 101010 \text{mil millones}mil millonesstart
text, m, i, l, space, m, i, l, l, o, n, e, s, end text^11start superscript, 1, end
superscript!

Aunque se pueda pensar que las pruebas de ADN se usan para condenar
a los criminales, también han jugado un papel crucial en exonerar
personas falsamente acusadas (incluso algunas que tenían muchos años
encarceladas). El análisis forense también se usa para determinar
paternidad y para identificar restos humanos en escenas de desastre.