PROTEÍNAS

RECOMBINANTES
ANGELA JOHANA ESPEJO MOJICA PhD
IEIM -PUJ
 DOGMA CENTRAL
Diversidad
organismos
ADN ARN Proteína

✓Estructural → componentes de
membrana, citoesqueleto,
✓Defensa → anticuerpos, toxinas, venenos
✓Regulación → hormonas
✓Motilidad → miosina, actina
✓Transporte → hemoglobina y mioglobina
✓Catalizadores → enzimas
✓Señalización → receptores celulares
 Diversidad
organismos Paul Berg,
(Brooklyn, NY; 30/06/1926 – 15/02/2023)

ADN
Gen de
interés
ADN
recombina
nte
https://siar.minam.gob.pe/puno/sites/default/files/archivos/public/docs/copia_de_thiebiot.pdf
 Célula Hospedera

ADN
recombinante

PROTEÍNA
recombinante

Biomedicina
Medio
ambiente
Alimentos Procesos
industriales
https://www.jove.com/science-education/10808/recombinant-dna
 Biomedicina

THPdb: Database
of FDA-approved
peptide and protein
therapeutics
http://crdd.osdd.net/raghava/thpdb/

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181748
doi: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181748.g004
 FUENTES NATIVAS DE PROTEÍNAS
× Concentraciones muy bajas
¿POR QUÉ × Contaminación con toxinas u otras moléculas traza
× Altos costos producción
PRODUCIRLAS? × Aislamiento y purificación son bastante engorrosos
× Están deficientes en el organismo

VENTAJAS DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES
✓ Producción de proteínas específicas y auténticas
✓ Incrementar los niveles de producción
✓ Facilitar su purificación
✓ Mejorar o modificar las propiedades biológicas de
las proteínas por Ingeniería de proteínas

¿PARA QUÉ?
 En el comienzo todo era oscuridad y
Genentech dijo… hágase la insulina!!!
(1978)

Herbert W.Boyer

Humulina

Impurezas → alergias
Alto número de animales
Procesos largos y tediosos Primer fermentador para la producción de fármacos
de separación a partir de microorganismos genéticamente
modificados. Liverpool, 1982. (Eli Lilly).
 ¿Cómo se producen las proteínas recombinantes?
Vector de expresión
Sistemas de
expresión
Célula u organismo
hospedero

Selección de
clones
Introducir transformados
vector
modificado en
Inserción del el sistema
gen aislado en el expresión
vector

Aislamiento
de gen interés
(DNA)
 Clonación → inserción de un fragmento de ADN dentro de un vector o plásmido
Gen de
Promotor secreción Shine dalgarno
Kozak Vectores de expresión
Molécula de ADN de doble cadena (ADN), con
capacidad de albergar un fragmento de ADN exógeno
(de otro origen)

Marcador de
selección SMC • Plásmidos (10 kb)

• Bacteriófagos(20 kb)

• Cromosomas artificiales:
Parada ➢ Bacterias (BACs - 100 y 300 kb)
➢ Levaduras (YACs) (100 a 1000
ORI PoliA kb)
➢ Mamíferos (MACs).

https://www.youtube.com/watch?v=bTGFsILjZAQ
 Promotor Shine dalgarno Tag
N terminal ó C-terminal

• Facilitar la purificación de la proteína

• Facilitar la identificación de la proteína → gen
fluorescente

Marcador de
selección SMC

Parada ✓ His-Tag
✓ GST-Tag
ORI PoliA ✓ Strpt/biot
✓ Lectinas
✓ Epitope tags→ c-myc
✓ GFP
https://siar.minam.gob.pe/puno/sites/default/files/archivos/public/docs/copia_de_thiebiot.pdf
 PROCARIOTAS
Gen de interés • Extracción de ADN genómico
• PCR → adición sitios restricción
• Secuenciación
EUCARIOTAS
• Extracción de ARN
• Retrotranscripción
• Obtención de ADNc
• PCR → adición sitios restricción

Restricción o
Síntesis del gen digestión enzimática

Optimización de
codones

https://www.abyntek.com/optimizacion-de-codones/
 Clonación → inserción de un fragmento de ADN dentro de un vector o plásmido

ADN recombinante

Vector - plásmido Gen

Enzimas de restricción

ADN donante
Ligación

Restricción o digestión enzimática

 Selección de
clones
Introducir transformados
vector
modificado en
Inserción del el sistema
gen aislado en el expresión
vector

Aislamiento
de gen interés
(DNA)

¿Cómo se producen las proteínas recombinantes?

Selección de célula hospedera

Bacterias
Tipo de célula hospedera

Rendimientos de producción

Tamaño de la proteína
Levaduras
Capacidad de secreción de proteínas

Glicosilaciones Plantas

Modificaciones postraduccionales

Células insecto

Células mamífero
Lack of partial
glycosylations

Some improper
glysosylations

Lack of eukaryotic modifications

None Glysosylations

https://www.thermofisher.com/co/
 Sin embargo…

Co-expresión de los 3 genes requeridos para la

glicosilación (plásmidos). Basado en la
maquinaria de C. jejuni
https://doi.org/10.1101/118224
https://www.miragenews.com/stanford-engineers-reprogram-yeast-cells-to-become-microscopic-drug-factories/
 Ventajas de CFPS sobre el sistema de expresión in vivo

Disminución en tiempo en síntesis proteica

Flexibilidad de cambio en las variables

Control de glicosilaciones

Incorporación de elementos no naturales

(aminoácidos)

Mejoramiento en rendimientos
 Animales transgénicos
Animal que porta un fragmento de ADN exógeno en la
mayoría o totalidad de sus tejidos

Annie “resistente amastitis”

Proteína para tratamiento de

trombosis
https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0301-732X2004000200002
http://dx.doi.org/10.18845/tm.v32i4.4798
https://montoliu.naukas.com/2016/02/07/medicamentos-derivados-de-animales-transgenicos/
 Métodos de transformación

Células competentes
➢ Pretratamiento con CaCl2 ó MgCl2
➢ Aumentar permeabilidad membranal

Electroporación Choque térmico

• Aplicación de campo eléctrico • Cambio fuerte de T°

https://www.youtube.com/watch?v=7Ul9RVYG5CM
 Métodos de transformación

Bacterias

Levaduras Plantas Células insecto Células mamífero

Biolística
Choque térmico Lipofección

Bactofección
Electroporación Transfección
Microinyección
(Vectores virales)
 Aquellas que fueron
Selección de clones transformadas con el vector
Antibiótico de
transformados tendrán este nuevo gen que les
selección
confiere resistencia al antibiótico

Cómo verifico que mis células

fueron transformadas o
transfectadas

Medio de cultivo con

antibiótico de selección
 Producción
Transformación

Clonación

¿Cómo se producen las proteínas recombinantes?

PRODUCCIÓN

UPSTREAM DOWNSTREAM

• Inoculación de la célula transformada

• Recuperación
• Expresión a escala pequeña (shake-flask)
• Clarificación
• Expresión a escala de laboratorio

• Expresión en biorreactor (piloto) • Purificación

• Producción en biorreactor • Caracterización

 Cepa • Características del hospedero y
UPSTREAM transformada del vector usado

• Temperatura
Expresión de la • pH
Condiciones
proteína cultivo
• Medio de cultivo
• Inducción?
recombinante

• Shake flask • Escalar la

• Agitación producción
• Batch
Tipo de • Fed-batch
• Transferencia de O2
• Rendimiento
cultivo • Continuo
• Transferencia de
• Productividad
calor
• perfusión
Bacterias o levaduras
transformadas

Medio
Proteína soluble
cultivo

Proteína insoluble o
cuerpos de inclusión Pellet
(bacterias)
 Células mamífero
transfectadas

https://escovaccixcell.com/applications/recombinant-proteins/workflows
 80% de loscostos de producciónde una
DOWNSTREAM proteína recombinante

Pellet
Medio cultivo Proteína insoluble o
cuerpos de inclusión
(bacterias)
Proteína soluble

Solubilización

Procesos de filtración,
Concentración y Purificación
Proteína Proteína insoluble
soluble (agregados)
Procesos de Procesos de
Filtración Concentración

Centricones

membrane
0,45 um – 0,22 um

Amicon
 Procesos de Filtración, Cromatografía
Concentración y Purificación
Separación de una mezcla de proteínas de acuerdo a características
físico químicas

✓ Acondicionamiento de la matriz

✓ Carga de la muestra a purificar

✓ Lavado

✓ Elución o separación de las proteínas purificadas

 Procesos de Filtración, Cromatografía
Concentración y Purificación

✓ Punto isoeléctrico ✓ Tamaño ✓ Tag

pI = pH al cual la carga neta de la proteína es

igual a cero

https://www.youtube.com/watch?v=lp40a7mtc4E https://www.youtube.com/watch?v=Ymsb14WLlXU
 Procesos de Filtración, Cromatografía
Concentración y Purificación

✓ Punto isoeléctrico ✓ Tamaño ✓ Tag

https://www.youtube.com/watch?v=ZA6rgm8wnXE https://www.youtube.com/watch?v=rPRbqYWlSEo
 Procesos de Filtración, CROMATOGRAFÍA
Concentración y Purificación

✓ Punto isoeléctrico ✓ Tamaño ✓ Tag

Proteína

Tag

✓ His-Tag
✓ GST-Tag
✓ Strpt/biot
✓ Lectinas
✓ Epitope tags

https://www.youtube.com/watch?v=8_7cdfNO7OY
¿Cómo visualizar el proceso de purificación?

¿Cómo verificar específicamente su proteína?

✓Western blot

✓ELISA

✓Actividad enzimática

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS (SDS-PAGE)

 ¿Qué más evaluar?

➢ Estabilidad
➢ pH
➢ Temperatura

➢ Patrón de glicosilación

➢ Ensayos celulares in vitro

➢ Captura celular
➢ Localización celular
➢ Acción biológica

➢ Ensayos estructurales
➢ Cristalización
Evaluación de los patrones de
glicosilación
Pruebas de celulares de ingreso o captura celular
usando líneas celulares en el laboratorio
Pruebas de actividad biológica en células de
pacientes en el laboratorio

¿Qué sigue?
PRUEBAS EN
MODELOS
ANIMALES
Libro de biotec
• https://siar.minam.gob.pe/puno/sites/default/files/archivos/public/d
ocs/copia_de_thiebiot.pdf