Trabajo práctico N°2: Enzimas.

Microbiología II
Profesores : Sergio Estévez.
Curso : 7mo química.
Alumnos :
 Armada, Julián.
 Savorani, Facundo.
 Sánchez, Bautista.
 Vatt, Santiago.
Tema : Enzimas que participan en la detección de virus en pacientes
sospechados de COVID-19.
Año: 2020
Ejercicio 1.
Reacción en cadena de la polimerasa.
La técnica de PCR (polymerase chain reaction) una técnica de replicación o amplificación masiva
de sectores específicos (llamados target) de una cadena de ADN. Se generan millones de copias
(llamadas ampliaciones) para facilitar el análisis de la misma.
La idea básica de la técnica es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando
una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria
Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79ºC a 85ºC), de ahí su nombre comercial más
conocido: Taq polimerasa. Cuando hacemos una reacción de PCR simulamos lo que sucede en una
célula cuando se sintetiza el ADN.

Preparación de la solución.
Como primer paso, se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo en un tubo de ensayo
o de microcentrifugado: la muestra genética del organismo que queremos estudiar, la polimerasa,
los primers (también llamados cebadores, iniciadores, partidores, etc.) necesarios para que se inicie
la transcripción, dinucleótidos (dNTPs) necesarios para formar la cadena, y las condiciones para
que la enzima trabaje adecuadamente (una solución buffer, cofactores necesarios para la enzima,
como lo pueden ser el MgCl 2, el KCl, el MgSO4 u otros, dependiendo de la polimerasa, otros
coayudantes como el glicerol, la formamida, etc.).
La muestra de material genético se puede obtener de las células objetivo por un proceso de
purificación realizado en máquinas automatizadas de purificación de ácidos nucleicos.
Se necesita un primer porque la mayoría de ADN polimerasas, enzimas que catalizan la replicación
del ADN, no pueden empezar a sintetizar una nueva cadena de ADN de la nada, sino que solo
pueden añadir nucleótidos a una hebra preexistente. Se necesitan dos para la reacción de PCR, uno
en el extremo 3' y el otro complementario para la otra hebra (llamados forward y reverse,
respectivamente). Son de aproximadamente 20 nucleótidos, porque es la cantidad necesaria para
que de manera probable se una a un sitio específico de la cadena de ADN.

Desnaturalización.
El siguiente paso es colocar los tubos en una máquina conocida como termociclador, que
básicamente sirve para calentarlos o enfriarlos a temperaturas muy precisas y programadas por el
usuario. Este instrumento lo que hace es, primero, realizar un calentamiento a aproximadamente 95
°C durante periodos de entre 1 y 5 minutos. Este paso es llamado desnaturalización inicial, y
permite la activación de la polimerasa, que, comercialmente, trae acoplados anticuerpos que inhiben
la amplificación no específica a bajas temperaturas al prepararse la solución problema. Acá también
se incluye el paso de la desnaturalización de las cadenas bicatenarias, considerándose entre 30 y 60
segundos.

Alineación.
Luego, se disminuye la temperatura a aproximadamente 62 °C para dar comienzo al paso de
alineación (30-60 segundos). A esta temperatura se forman y se rompen constantemente los puentes
de hidrógeno entre los primers y la cadena, y aquellas uniones más estables (las que son
complementarias) durarán mayor tiempo, quedando estos “alineados” al material genético y
formando una pequeña sección de doble cadena. La polimerasa se une a este pequeño pedazo y
comienza a copiar, agregando las bases nitrogenadas (los dNTPs) que se encuentran en la solución;
al agregar unas bases más, los puentes de hidrógeno que se forman entre las bases estabilizan más la
unión y el primer permanece en este sitio para el siguiente paso.

Extensión.
Después la temperatura sube a 72ºC (temperatura en la cual la polimerasa alcanza su máxima
actividad) para dar comienzo a la extensión (30-60 segundos), y continúa la síntesis de los
fragmentos de ADN a partir de los primers que ya se habían alineado. Éste es el último paso de lo
que es llamado un ciclo.
De acá en adelante se repiten los ciclos entre 30 y 40 veces, duplicándose la cantidad de ADN por
cada uno de ellos. Se aprecia un crecimiento prácticamente exponencial, siendo de
aproximadamente 2n (n= número de ciclos). Sin embargo, la eficiencia de la reacción rara vez es
perfecta. Generalmente, en los últimos ciclos, comienza a haber una inhibición debido a la falta de
reactivos u otros factores.

Visualización y análisis de resultados.

Para visualizar los resultados de la reacción existen principalmente dos métodos: electroforesis e
inmunofluorescencia.
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un
campo eléctrico. En este caso, se realiza la separación de los polipéptidos de la cadena de ADN
recombinante. Los ácidos nucleicos tienen carga negativa, por lo que se dirigirán al polo negativo
del campo. Según su nivel de ionización y carga eléctrica, se acercarán más o menos al polo. Esto
es específico para cada gen.
La inmunofluorescencia es una técnica de inmunomarcación que hace uso de anticuerpos unidos
químicamente a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una determinada
molécula. Para el caso de análisis viral, se realiza la incubación de su ADN en un cultivo de células
previamente analizadas y preparadas, luego, se realiza el agregado de anticuerpos específicos para
las proteínas virales. Según qué anticuerpos se activan se dan los resultados.

Tipos de PCR.

PCR Anidada:
TécnicamuysensibledelaP
CRenlaqueelproductode
unaamplificaciónesutilizadac
omomoldeparauna
segundaamplificaciónconcebad
oresqueseubicandentrodel
aprimerasecuenciaamplificada.
Estetipode
PCResmuyespecífica.
PCR Multiplex:
EsuntipodePCRenelcual
seamplificamásdeunasecu
enciaenunamismareacción,e
nestetipodePCR
seutilizanmúltiplesparesdep
rimers(hasta8)loquedauna
seriedeproductos,losamplifi
cadospueden
versecomomúltiplesbandasen
ungel,estetipodePCRes
comúnmenteusadaendiagnósti
cosmédicos.
PCR In Situ:
EsunaPCRrealizadasobrepr
eparacionesfijassobreunporta
objetos,consisteenunareacci
óndePCRen
secciones  histológicas  o 
células,  donde  los  productos
 generados  pueden 
visualizarse  sobre  el  sitio 
de
amplificación,enlatécnicade
inPCRinsituserealizaprim
erolaamplificacióndelADN
blancoyluegola
detección  mediante  hibridación
 in  situ  convencional  con 
sondas  ADN/ARN.  De  esta 
manera  pueden
detectarsecantidadespequeñísimas
degenomas.
RT-PCR:
DondeelmoldeinicialesARN
yserequieredeunaenzima
denominadatranscriptasainversa
,pararealizarla
conversióndeARNauntipo
deADNllamadaADNc(ADN
complementario).Esespecialme
nteútilcuando
solosedisponendepequeñasc
antidadesdeARN,estatécnica
seutilizaparaamplificargene
sespecíficos.
EnestaPCRserequierende
dostiposdecebadores:unce
badordenominadoAntisentido
queinicia la
reaccióndeRT-
PCRyelcebadordenominado
sentido(SENSE)querealizael
dúplexdeDNAc,además
requieredeunaDNApolimeras
adependientedelARN,laRT-
PCRpuedeserusadaparacons
truirbibliotecas
deDNAc
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PCRpuedeserusadaparacons
truirbibliotecas
deDNAc
 PCR anidada: el producto de una amplificación es utilizada como molde para una segunda
amplicación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Es
muy específica.
 PCR multiplex: es un tipo de PCR en el cual se amplifica más de una secuencia en una
misma reacción.
 PCR in situ: se realiza sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos, en secciones
histológicas o células.
 RT-PCR: El molde inicial es ARN, y necesita traducirse a una cadena doble de ADN. Esto
se realiza a través de la enzima retrotranscriptasa (RetroTranscriptase-PCR).
 qPCR o ReTi-PCR: llamada PCR de tiempo real o PCR cuantitativa (no confundir Real
Time-PCR con RetroPolimerase-PCR). En esta PCR, hay una molécula fluorescente
añadida a los primers, que se encuentra inhibida por otra molécula. Cuando el primer
genera una nueva cadena, la molécula inhibidora se desprende, por lo que empieza a emitir
luz. Esta luz es medida por un sensor dentro del termociclador, que traduce los datos.
Estas técnicas pueden, luego, combinarse.

Coronavirus, bioquímicamente.
El SARS-CoV-2 es un virus de la subfamilia de los coronavirus (Orthocoronavirinae), de la familia
de los coronavíridos (Coronaviridae), a su vez del orden de los Nidovirales.
Tiene un tamaño aproximado de 50 a 200 nm. Están cubiertos por una estructura lipídica llamada
cápside, que forman a partir de la membrana celular de las células infectadas. Poseen genoma
monocatenario, es decir, ARN. Éste es de sentido positivo, es decir, que posee la misma polaridad y
codificación que el ARN mensajero del virus. En resumen, transcribe su código genético
directamente a la célula invadida. Esto permite que pueda, apenas se adhiere a la célula y luego de
inyectar su genoma, actuar sobre los ribosomas para producir proteínas específicas o para replicarse
a partir de mecanismos propios de la misma (a diferencia de los de sentido negativo que requieren
la presencia de ARN mensajero que traduzca la información contenida en su genoma). De esta
forma puede actuar rápidamente sobre el organismo invadido.
Respuesta a la pandemia.
De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud (OMS), su oficina principal en China fue
informada de casos de neumonía de etiología desconocida en la ciudad de Wuhan, en la provincia
de Hubei, el 31 de diciembre de 2019. Un recién descubierto coronavirus, llamado primeramente
2019-nCoV fue oficialmente anunciado a los agentes de causa por las autoridades chinas el 7 de
enero. Una secuencia genómica viral fue puesta a inmediata disposición del público capacitado vía
comunidades científicas online el 10 de enero, seguida por otros cuatro genomas depositados el 12
de enero en la base de datos de secuencias virales comisariada por la GISAID.

Coronavirus y PCR.
El protocolo instaurado por la OMS es un protocolo determinado por el hospital universitario
Charité – Universitätsmedizin de Berlín, que es la Facultad de Medicina de la Universidad Libre de
Berlín. En este protocolo se determinan los siguientes procedimientos:
Toma de muestras: Las recomendadas son las del tracto respiratorio inferior, incluidos el esputo, el
lavado broncoalveolar y el aspirado traqueal (cuando sea posible según los criterios médicos).
Cuando la toma de una muestra del tracto respiratorio inferior no es posible, las muestras del tracto
respiratorio superior también son útiles. Se recomienda la toma de hisopados nasofaríngeo y
orofaríngeo combinados. No se recomienda el muestreo de contactos asintomáticos de forma
rutinaria; si se considera necesario de acuerdo con las guías nacionales, se deben considerar la toma
muestras de las vías respiratorias superiores para este tipo de muestreo.
El laboratorio ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, redactó un protocolo propio respecto al personal
que realiza la toma de muestras. Estos deben estar capacitados respecto al procedimiento y a las
medidas preventivas. Deben estar cubiertos por cofia, protección ocular, máscara de calidad N95,
guantes de látex y camisolín de cuerpo entero.
De acá en adelante, el protocolo nacional indica que los análisis se realizarán en laboratorios BSL2-
OMS, que presenten Cabina de Seguridad Biológica tipo 2 certificada.
Transporte y almacenamiento de muestras: Las muestras deben mantenerse refrigeradas (4 ‐8 °C) y
enviarse al laboratorio (central, nacional o de referencia) donde se procesarán dentro de las 24-72
horas de la toma. Si no se pueden enviar muestras dentro de este período, se recomienda
congelarlas a ‐70 °C (o menos) hasta que se envíen (asegurando que se mantenga la cadena de frío).
El envío de muestras sospechosas a laboratorios de referencia o centros colaboradores fuera del país
y por vía aérea debe cumplir con todas las normas internacionales (IATA) para Sustancias
Biológicas de Categoría B. En Argentina, el protocolo indica que, para el transporte al laboratorio,
el hisopo utilizado debe ser colocado en tubo de muestra con solución fisiológica u otra apta para el
transporte. Este a su vez, cerrado herméticamente, debe ser identificado y luego envasado en un
doble envase también hermético. Luego deberá abrirse bajo campana de flujo laminar, con la
utilización de los EPP apropiados.
Amplificación del material genético: Se recomienda la amplificación de la cadena de ARN por RT-
PCR a tiempo real. Los kits de análisis son provistos por una serie de laboratorios permitidos, y
contienen las enzimas necesarias (polimerasa y transcriptasa), cantidades necesarias cada uno de los
desoxiribonucleótidos trifosfato (dNTPs), cofactores (solución de sulfato de magnesio y albúmina
de suero bovino no acetilada) y solución buffer (pH entre 8,1 y 9,1). Los ciclos descritos en el
informe recomendado a seguir por el protocolo indican: 10 minutos a 55 °C para la transcripción
inversa, seguido por 95 °C por 3 minutos, y luego 45 ciclos de 95 °C por 15 segundos y 58 °C por
30 segundos.
followed by 95 °C for 3 min and then 45 cycles of 95°C for 15 s, 58°C for 30 s.

Análisis genético: Este protocolo se basa en la detección de 3 marcadores diferentes: genes N, E y

RdRp. Los ensayos para los genes E y N se entienden como protocolos de tamizaje para detectar
cualquier betacoronavirus asociado a murciélagos (no detectan coronavirus humanos comunes); el
ensayo para RdRp es específico para coronavirus SARS y tipo SARS (incluyendo el 2019-nCoV).
Con esto, para el flujo de trabajo de rutina, se sugiere correr primero el ensayo para el gen N o el
gen E (no es necesario correr los dos) como herramienta de tamizaje, seguido del ensayo de
confirmación con el gen RdRp.
Algoritmo de laboratorio (secuencia de operaciones para el trato con riesgos de contagio): Los
laboratorios deben continuar utilizando el algoritmo de laboratorio de influenza recomendado por la
OPS para la vigilancia rutinaria de la influenza y de los casos inusuales de IRAG. Las pruebas para
el nCoV deben considerarse sólo para pacientes que cumplan la definición del caso, una vez
descartada la influenza y la influenza aviar.

Ejercicio 2.
 ADN polimerasa: se utiliza la Taq polimerasa.
 Transcriptasa inversa o retrotranscriptasa.

Ejercicio 3.
Taq polimerasa.
La enzima Polimerasa Taq es un tipo de ADN polimerasa termoestable, nombrada de esta forma
debido a que es producida por la bacteria Thermus aquaticus (T-aq) y a partir de la cual fue aislada
en el año 1968 por Thomas D. Brock. A menudo suele abreviarse como "Taq Pol" (o simplemente
como "Taq"), y es frecuentemente utilizada en las técnicas de PCR, un método que se utiliza para
amplificar secuencias cortas de ADN.
Esta es una enzima termoestable de aproximadamente 94 kDa, aislada de la eubacteria Thermus
aquaticus, (posee forma de bacilo) cepa YT-1 (1). Esta enzima replica el DNA a 72 ° C. La enzima
cataliza la polimerización de nucleótidos en DNA de doble hebra en dirección 5' → 3', en presencia
de iones de magnesio, la concentración de trabajo de Mg 2+ es 2-3 mM, y el pH adecuado es 8,1-9,1.
y muestra actividad exonucleasa 5' → 3'. La enzima está altamente purificada y libre de
exonucleasas endonucleasas o nucleasas inespecíficas. La Taq DNA polimerasa deja extremos
libres 3' dA en sus productos de reacción.
Su característica esencial es su actividad polimerasa 5’ -> 3’, añadiendo bases nitrogenadas en ese
sentido de la hebra de ADN. Tiene una velocidad de 1Kb por minuto, no es la más rápida, y además
tiene una tasa de error más elevada que otras, como la Phusion. Los fabricantes recomiendan no
hacer secuencias de más de 5 Kb y su tasa de error es de 1 x 10-6. Al contrario que las polimerasas
naturales las de uso científico han sido modificadas para eliminarles su actividad 3’ -> 5’
exonucleasa que elimina las bases de la cadena que acaba de hacer (las polimerasas naturales tienen
esta actividad de la que se sirven para reparar sus posibles errores, trabajo que realizan en conjunto
con otras proteínas). Aunque la polimerasa fuera aislada de T. Aquaticus, la que se emplea en los
laboratorios proviene de bacterias E. coli a las que se les ha insertado el gen de la Taq polimerasa,
estas bacterias crecen en unas condiciones mucho más fáciles de conseguir, por lo que se ahorra en
su producción
Nombre corriente:

 Polimerasa Taq
Nombre sistémico:
Números EC 2.7.7.7
Árbol de números CE
2 transferasas
2.7 Transferencia de grupos que contienen fósforo
2.7.7 Nucleotidiltransferasas
2.7.7.7 ADN polimerasa dirigida por ADN

Retrotranscriptasa.
La transcriptasa inversa fue descubierta por Howard Temin en la Universidad de Wisconsin-
Madison, y de forma independiente por David Baltimore en 1970 en el MIT. Los dos compartieron
el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1975 con Renato Dulbecco por su descubrimiento.
Es una enzima de tipo ADN-polimerasa, que tiene como función sintetizar ADN de doble cadena
utilizando como molde ARN monocatenario, es decir, catalizar la retrotranscripción o transcripción
inversa. Esta enzima se encuentra presente en los retrovirus. Su nombre obedece a que el proceso
normal de la transcripción, la que se puede llamar "directa", codifica el ARN a partir de la secuencia
inicial de ADN, y no al revés.
Una forma sencilla de síntesis de ADN de doble cadena a partir de transcriptasa inversa, también
llamada ADN/ARN-polimerasa dirigida, sería partir de un cebador cola de poli-T que establecería
bases complementarias con la cola de poli-A del ARN transcrito de la hebra que se va a sintetizar,
lo que forma un híbrido ARN/ADN. Dicho híbrido podría separarse mediante ribonucleasas, y
después, con la acción de una ADN-polimerasa y un nuevo cebador, ser completada la hebra de
ADN de doble cadena.
En la biología molecular y la bioquímica, la transcriptasa inversa, también conocida como ADN
polimerasa dependiente de ARN, es una enzima ADN polimerasa que transcribe una sola cadena de
ARN en una sola cadena de ADN. También ayuda en la formación de una doble hélice de ADN una
vez que el ARN ha experimentado una transcripción inversa en una sola cadena de cDNA. La
transcripción inversa implica la síntesis de ADN a partir del ARN.
Nombre Corriente:

 Transcriptasa Inversa
 Retrotranscripatasa
 ADN polimerasa dependiente de ARN

Nombre Sistémico:
EC: 2.7.7.49
2. Transferasas
2.7. Incluye enzimas que transfieren grupo fosfato
2.7.7.Nucleotidiltransferasas
2.7.7.49. ARN-dirigida ADN polimerasa.

Bibliografía.
PCR:
 Espinosa, L. Guía práctica sobre la técnica de PCR. En: Eguiarte L, Souza V, Aguirre X
editores. Ecología molecular. México: INE, CONABIO y UNAM, 2007; p.520-36. (Cap.
17).
 https://es.wikipedia.org/wiki/Inmunofluorescencia
 https://www.gene-quantification.de/abi-rtpcr-pcr.pdf
 https://es.wikipedia.org/wiki/PCR_en_tiempo_real
https://es.wikipedia.org/wiki/RT-PCR
 https://es.wikipedia.org/wiki/Partidor
 https://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis

Protocolos y determinación específica.

 https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf
 Directrices de Laboratorio para la Detección y Diagnóstico de la Infección con el Nuevo
Coronavirus 2019 (PAHO):
 https://www.argentina.gob.ar/salud/coronavirus-COVID-19/laboratorio
 http://www.scielo.org.ar/pdf/medba/v65n1/v65n1a06.pdf
 https://www.eurosurveillance.org/docserver/fulltext/eurosurveillance/25/3/eurosurv-25-3-
5.pdf?
expires=1588378768&id=id&accname=guest&checksum=CC6990D66CA39CC2E93EC9
DA10E27C25
 https://www.iaea.org/es/newscenter/news/pcr-en-tiempo-real-covid-19
 http://www.scielo.org.ar/pdf/medba/v65n1/v65n1a06.pdf
 https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf
 https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/rt-pcr-panel-for-detection-
instructions.pdf

Taq polimerasa.
 http://www.sbsbio.com/news/englishnew/product_full.php?
y=3&cid=71&pid=44&gclid=CjwKCAjwv4_1BRAhEiwAtMDLsmXQxWAcsnIhvGHIo0
hG4ky1cQVy0t3RSXtWbvVtqCjpCJPuP8GipBoCmdAQAvD_BwE
 https://biologia.laguia2000.com/tecnicas-en-biologia/taq-polimerasa
 http://ddt.inr.gob.mx/indiscap/PDFIndiscap/2013/Num2/ir132d.pdf
 https://es.wikipedia.org/wiki/Polimerasa_Taq
 https://www.qmul.ac.uk/undergraduate/coursefinder/courses/2020/chemistry//

ADN polimerasa.
 https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=2.7.7.49
 https://es.wikipedia.org/wiki/Anexo:N
%C3%BAmeros_EC_2.7#EC_2.7.7,_nucleotidiltransferasas
 https://es.wikipedia.org/wiki/Transcriptasa_inversa