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REACCIÓN EN

CADENA DE LA
POLIMERASA(PCR)

INTEGRANTES:
Naysha Nina Dilas
Alexandra Mamani Chávez
Cristhyan Mita Chara
Anderson Flores Yufra
¿QUÉ ES LA PCR?
Es una técnica de biología molecular desarrollada en
1986 por Kary Mullis

El objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de


ADN particular, partiendo de un mínimo.

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es


que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una
muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad,
identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el
ADN amplificado.
COMPONENTES DE LA PCR
 Iniciadores: son moléculas de ADN
Equipos Reactivos
de pequeño tamaño,cada uno son
 Termociclador:el aparato complementarios a una de las dos
que va a mantener la  ADN que contenga la región(es)
que se desea amplificar hebras del ADN, son secuencias
temperatura necesaria en
 Buffer o solución amortiguadora : cortas, de entre seis y cuarenta
cada una de las etapas
mantiene el pH adecuado para el nucleótidos, permiten que la
que conforman un ciclo.
 Vortex funcionamiento de el ADN polimerasa inicie la reacción .
 Micropipetas polimerasa.  ADN polimerasa o mezcla de
 Microcentrífuga  Cloruro de Magnesio (MgCl2): lo distintas polimerasas con
necesita la Taq para actuar, es un temperatura óptima alrededor de
cofactor. 70 °C (la más común es la
 Desoxirribonucleótidos trifosfato polimerasa Taq)
(dNTPs):son los nucleótidos  Agua destilada
necesarios para formar o producir  Iones monovalentes, como el
las copias de ADN durante los potasio.
2018].
diferentes ciclos de la PCR.
ETAPAS DE LA PCR
DESNATURALIZACIÓN: en esta etapa HIBRIDACIÓN: en esta etapa participan los
las cadenas de ADN son calentadas a primers, los cuales son secuencias de
95 C° durante un tiempo promedio de oligonucleótidos que delimitan la secuencia
20 a 30 segundos, con el objetivo de blanco que se quiere amplificar. En la etapa de
separar ambas cadenas. Si la cadena hibridación los primers se alínean al extremo 3’
de ADN contiene gran cantidad de de la cadena molde, para lo cual se necesitan
uniones g-c será necesario mayor dos secuencias diferentes, una denominada
tiempo, ya que la unión de éstas se forward, o sentido, y otra reverse, o antisentido.
hace mediante tres enlaces, uno más Para que esto suceda es necesario que el
que las bases a-t. Al final de esta etapa termociclador alcance una temperatura entre 50-
tendremos las cadenas separadas, las 60 C°, generalmente se necesitan 30 segundos
cuales servirán como molde. en este ciclo.
EXTENSIÓN: en esta etapa se necesita una
enzima con la función de ADN polimerasa, la
cual se encargará de la catálisis de la
reacción, sintetizando nuevas cadenas de Los dntp’s son las bases nitrogenadas que
ADN a partir de una cadena molde. La normalmente se utilizan a una
enzima más usada es la Taq ADN polimerasa, concentración entre 0.2 a 1.0 mM, para
con capacidad de soportar temperaturas muy obtener un producto de amplificación de 1
altas. Proviene de una bacteria termófila 000 pb se requiere de un minuto.
llamada Thermophilus aquaticus. En la etapa Al final de cada ciclo se habrán duplicado
de extensión la Taq polimerasa actúa sobre el dos cadenas de ADN a partir de una, y de
complejo templado-primers a una esta forma la replicación de una cadena
temperatura óptima de 72 C°, y a una blanco por cada ciclo se realiza de manera
velocidad muy rápida agrega los exponencial y logarítmica.
desoxirribonucleótidos libres (dntp’s)
complementarios, creando así las cadenas
completas de ADN.
ELONGACIÓN FINAL: Se lleva
a cabo a una temperatura de
70-74 °C durante 5-15 minutos
tras el último ciclo de PCR. Con
ella se asegura que cualquier
ADN de cadena simple restante
sea totalmente ampliado.

CONSERVACIÓN: Este paso


que se lleva a cabo a 4-15 °C
durante un tiempo indefinido
para conservar la reacción a
corto plazo.
NÚMERO DE CICLOS
Este número de ciclos depende de la
cantidad de ADN que existe en la muestra
una vez que el resto de factores han sido
optimizados (normalmente de manera
empírica).
Hay que tener en cuenta que la reacción está
producida por una enzima que sufre el efecto
meseta que describe la atenuación en la tasa
de la acumulación del producto. Después de
un número determinado de ciclos la
amplificación deja producirse de manera
exponencial y llega a una fase estacionaria.
Generalmente cuando el efecto meseta se
produce, la cantidad de ADN sintetizado es
suficiente para su posterior utilización.
CONTAMINACIÓN EN LA PCR

La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica muy sensible, por lo que es


de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado
(aunque se encuentre en una cantidad muy pequeña) se amplifique y obtengamos un
resultado que no es real. Vemos que una de sus mayores ventajas de la técnica, se
convierte a la vez en el principal inconveniente .
Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones. En el caso de
trabajar con muestras de ARN las precauciones se deben extremar al máximo:

Realización de
Uso de controles de
Lugar físico
instrumental
Utilización de Uso de guantes blanco (se añade
exclusivo para reactivos y por el agua en lugar de
exclusivo para
realizar la PCR tubos estériles manipulador ADN, no debe
la PCR existir
amplificación).
TIPOS DE PCR
PCR IN SITU: La PCR in situ consiste en una
PCR EN TIEMPO REAL O PCR
reacción de PCR en secciones histológicas o
CUANTITATIVA (QPCR): Reacción
células, donde los productos generados pueden
de PCR cuya principal característica
visualizarse en el sitio de amplificación. En la
es que permite cuantificar la cantidad
técnica de PCR in situ se realiza una primera
de ADN o ARN presentes en la
amplificación de ADN blanco y luego detección
muestra original, o para identificar con
mediante hibridación in situ convencional con
una muy alta probabilidad, muestras
sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden
de ADN específicas a partir de su
detectarse cantidades pequeñísimas de genoma.
temperatura de fusión .Se puede
Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad
dividir en las técnicas basadas en
de amplificar específicamente una población de
fluorocromos no específicos
secuencias de menor representación.
PCR ANIDADA: Técnica muy sensible de PCR
en la que el producto de una amplificación es
PCR MÚLTIPLE: PCR en la cual se amplifica utilizado como molde para realizar una segunda
simultáneamente más de una secuencia. amplificación con cebadores que se ubican
Para ello, se combinan dos o más pares de dentro de la primera secuencia amplificada, es
cebadores en un mismo tubo, junto con el decir, cuando tenemos el primer amplicón se
resto de los reactivos de la reacción en pueden unir los cebadores y se hace de nuevo
cantidades suficientes, para amplificar una amplificación dentro del amplicón inicial.
simultáneamente varios segmentos de Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta
ADN. Ventajas: información sobre varios sensibilidad y especificidad. La especificidad
locus en una sola reacción, menor cantidad aumenta porque como es amplificación de un
de molde para el análisis, menor cantidad de amplicón obtenido previamente, los cebadores
reactivos, rápida construcción de bases de sólo van a hibridar en un sitio dentro de la
datos. Desventajas: para llevarla a cabo molécula y el resultado será una única banda.
adecuadamente y sin errores, se requiere de Así, evitamos posibles hibridaciones
una cuidadosa optimización del proceso. inespecíficas de los cebadores. La
desventaja de esta técnica es que no nos
permite cuantificar la muestra.