MICROSCOPIA Y CULTIVO IN VITRO
MICROSCOPIA de mayor tamaño.
1.-la detección inicial de microorganismos
2.-la identificación preliminar o definitiva de los mismos.
 detectar células bacterianas, elementos fúngicos,
parásitos (huevos, larvas o formas adultas) e
inclusiones víricas presentes en las células
infectadas.
 propiedades morfológicas utilizar para la
identificación preliminar de la mayoría de las
bacterias
 microorganismos teñidos con anticuerpos marcados
con colorantes fl marcadores ha sido muy útil
MÉTODOS MICROSCÓPICOS
MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO (ÓPTICA)
son una fuente de luz que se utiliza para iluminar la
muestra colocada en una platina, un condensador para
enfocar la luz en la muestra y dos sistemas de lentes
(lente del objetivo y lente del ocular) que se utilizan
para ampliar la imagen de la muestra.
 Se ve mediante transiluminación, de manera que la
luz procedente del condensador atraviesa la
muestra.
 se amplía la imagen, primero por la lente del
objetivo y después por la lente del ocular.
 La ampliación total de la imagen es el producto de
las ampliaciones de las lentes del objetivo y del
ocular.
se utilizan tres lentes del objetivo diferentes:
o bajo aumento (aumento de 10 veces): explorar una
muestra
o alto aumento en seco (40 veces): buscar
microorganismos grandes (parásitos y hongos
filamentosos)
o inmersión en aceite (100 veces) observar bacterias,
levaduras (fase unicelular de los hongos) detalles
morfológicos de los microorganismos y las células
o Las lentes del ocular pueden ampliar aún más la
imagen (generalmente de 10 a 15 veces).
 limitación de la microscopia de campo claro es la
resolución de la imagen, es decir, la capacidad de
distinguir que dos objetos están separados
 capacidad de resolución está determinada por la
longitud de onda de la luz utilizada para iluminar el
objeto y el ángulo de la luz que entra en la lente del
objetivo
 capacidad de resolución es máxima cuando se
interpone aceite entre la lente del objetivo
(habitualmente la lente de 100 × )
 mayoría de las bacterias y los microorganismos de
mayor tamaño se pueden ver mediante microscopia
de campo claro
 microorganismos se deben teñir con un colorante
para poder observarlos, o s un método
microscópico alternativo
MICROSCOPIA DE CAMPO OSCURO
 utilizan las mismas lentes del objetivo y del ocular
que en los microscopios de campo claro
 utiliza un condensador especial que impide que la
luz transmitida ilumine directamente la muestra.
 Sólo la luz oblicua y dispersa llega a la muestra y
atraviesa los sistemas de las lentes, lo que hace que
la muestra esté muy iluminada sobre un fondo
negro.
 ventaja es e mayor que la de la microscopia de
campo claro (es decir, 0,02 mm en comparación con
0,2 mm), lo que posibilita la detección de bacterias
muy delgadas
 desventaja de este método es que la luz pasa
alrededor de los microorganismos y no los
atraviesa, lo que difiere de su estructura interna.
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASES
 permite examinar los detalles internos de los
microorganismos.
 pasan haces de luz paralelos a través de objetos de
densidades diferentes, la longitud de onda de un
haz se «desfasa» en relación con el otro haz de luz
 el uso de anillos anulares en el condensador y en las
lentes del objetivo se amplifican las diferencias de
fases, la luz en fase parece más brillante que la luz
fuera de fase.
 crea una imagen tridimensional del microorganismo
o de la muestra y permite un análisis más detallado
de las estructuras internas.
MICROSCOPIA FL
 fluorocromos pueden absorber la luz ultravioleta o
ultra azul de longitud de onda corta y emitir energía
con una longitud de onda visible y mayor.
 algunos microorganismos tienen fluorescencia
natural (autofluorescencia)
 tinción de los microorganismos con colorantes
fluorescentes, y un microscopio fl, una lámpara de
vapor de mercurio, de un halógeno o de xenón a
presión elevada
 utiliza una serie de filtros para bloquear el calor que
genera la lámpara, eliminar la luz infrarroja y
seleccionar la longitud de onda adecuada para
excitar el fl
 luz que emite el fluorocromo se amplifica con las
lentes del objetivo y del ocular tradicionales.
 microorganismos y las muestra teñidos aparecen
brillantes sobre un fondo oscuro, aunque los colores
varían del fuorocromo seleccionado.
 contraste entre el microorganismo y el fondo es
grande como para realizar una búsqueda rápida del
microorganismo con bajo aumento y después el
material se explora con mayor aumento, una ver
que se ha detectado fuorescencia.
MICROSCOPIA ELECTRÓNICA
 utilizan bobinas magnéticas para dirigir un haz de
electrones desde un fi de tungsteno a través de una
muestra y hacia una pantalla.
 longitud de onda es mucho más corta que la de la
luz, la resolución y la ampliación mejoran
drásticamente.
 se pueden ver partículas víricas individuales
 muestras habitualmente se tiñen con iones
metálicos para crear contraste.
Hay dos tipos:
 microscopios electrónicos de transmisión: los
electrones, igual que la luz en los microscopios
ópticos, atraviesan directamente la muestra
 microscopios electrónicos de barrido: rebotan en la
superficie determinado ángulo y genera una imagen
tridimensional.
MÉTODOS DE ESTUDIO
 muestras clínicas y las suspensiones de
microorganismos se pueden colocar sobre un
portaobjetos de vidrio y se pueden explorar con el
microscopio
 se pueden ver microorganismos grandes (p. ej.,
elementos fúngicos y parásitos) y material celular, a
menudo es difícil el análisis de estructuras internas.
ESTUDIO DIRECTO
 son los más sencillos para preparar muestras para el
estudio microscópico.
 muestra se puede suspender en agua o suero salino,
mezclada con un álcali para disolver el material de
fondo o con una combinación de un álcali y un
colorante para generar contraste
 colorante tiñe de manera inespecífica contraste con
el fondo y permite el estudio de las estructuras
detalladas.
 variación es el método de tinta china, oscurece el
fondo y no la célula. Para detectar cápsulas
alrededor de microorganismos, como la levadura
Cryptococcus y la bacteria encapsulada Bccillus
cnthrccis.
TINCIONES DIFERENCIALES
 teñir microorganismos específicos o componentes
del material celular.
 tinción de Gram es la tinción mejor conocida y más
utilizada, forma la base de la clasificación de las
bacterias.
 levaduras también se pueden teñir con este método
(son grampositivas).
 tinciones de hematoxilina férrica y tricrómica útiles
para la identificación de Wright-Giemsa se utiliza
para parásitos sanguíneos y otros microorganismos
seleccionados.
TINCIONES ACIDORRESISTENTES
 utilizan al menos tres tinciones acidorresistentes
diferentes
 aprovecha de que algunos microorganismos
conservan una tinción principal incluso después de
exponerlos a agentes decolorantes potentes, como
mezclas de ácidos y alcoholes.
 método de Ziehl-Neelsen es el más antiguo que se
utiliza, aunque precisa el calentamiento de la
muestra durante el procedimiento de tinción.
 Muchos laboratorios han sustituido este método
por el de la tinción acidorresistente en frío (de
Kinyoun) o tinción fluorocrómica (de auramina-
rodamina).
 método del fluorocromo: es la tinción de elección
porque se puede estudiar rápidamente una gran
superficie de la muestra buscando microorganismos
fl fondo negro.
 Algunos microorganismos son «parcialmente
acidorresistentes» -> conservan la tinción principal
sólo cuando se descoloran con una solución ácida
débil.
TINCIONES FL
 tinción acidorresistente de auramina-rodamina es
un ejemplo
 se puede utilizar la tinción de naranja de acridina
para teñir bacterias y hongos, y el blanco de
calcoflúor tiñe la quitina de las paredes de las
células fúngicas.
 la tinción de blanco de calcoflúor ha sustituido a las
tinciones de hidróxido potásico.
 Otro es el estudio de muestras con anticuerpos
(tinciones con anticuerpos fluorescentes).
CULTIVO IN VITRO
 El éxito depende de la biología del microorganismo,
del lugar de la infección, de la respuesta inmunitaria
del paciente frente a la misma y de la calidad del
medio de cultivo.
 El hemocultivo siempre será negativo, mientras que
el cultivo de la lesión en la que crece el germen sí
permite detectarlo.
 En muchas infecciones ( gastroenteritis, uretritis,
faringitis), el germen responsable de la infección se
asocia a otros muchos gérmenes que son parte de la
flora microbiana normal de la región infectada.
 Se han desarrollado muchos medios de cultivo que
permiten suprimir estos gérmenes existentes en
condiciones normales y facilitan la detección de los
que tienen importancia clínica.
 La inmunidad innata y adaptativa del paciente
pueden suprimir el patógeno, de forma que con
frecuencia se necesitan técnicas de cultivo muy
sensibles.
 algunas infecciones se caracterizan por la existencia
de relativamente pocos gérmenes.
 se debe controlar con cuidado la calidad de los
medios de cultivo para garantizar que su
rendimiento se corresponde con el exigido
 Se comercializan fórmulas deshidratadas de la
mayor parte de estos medios de cultivo, lo que
permite esta fabricación con mínimas diferencias
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
se pueden clasificar en cuatro grupos generales:
MEDIOS DE CULTIVO NO SELECTIVOS
ENRIQUECIDOS
diseñados para permitir el crecimiento de la mayor
parte de los gérmenes que no necesitan unas
condiciones exigentes.
Agar sangre. contienen dos componentes
fundamentales: un medio basal (p. ej., soja tripticasa,
infusión de cerebro-corazón, base de Brucellc) y sangre
(de oveja, caballo, conejo).
Agar chocolate. añade sangre o hemoglobina al medio
de base calentado, se vuelve marrón (de ahí su
nombre). permite el crecimiento de la mayor parte de
las bacterias, incluidas algunas que no crecen en el agar
sangre
Agar Mueller-Hinton. medio recomendado para
estudios convencionales de sensibilidad bacteriana.
Incluye extractos de ternera y caseína, sales, cationes
divalentes y almidón soluble necesario para que los
resultados sean reproducibles.
Caldo tioglicolato. medios de cultivo de
enriquecimiento empleados para recuperar cantidades
pequeñas de bacterias aerobias y anaerobias. Mayor
parte incluyen caseína, glucosa, extracto de levadura,
cisteína y tioglicolato sódico. El suplemento de hemina y
vitamina K mejora la recuperación de las bacterias
anaerobias.
Agar dextrosa de Sabouraud. medio de cultivo
enriquecido que contiene caseína y tejido animal
digeridos suplementados con glucosa para aislar
hongos. Mayor parte de los micólogos utilizan la que
tiene baja concentración de glucosa y un pH neutro. Al
reducir el pH y añadir antibióticos para inhibir las
bacterias, este medio de cultivo puede ser selectivo de
hongos.
 MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS Y
DIFERENCIALES
 recuperar gérmenes específicos que pueden estar
presentes en una mezcla de otros gérmenes (p. ej.,
un patógeno entérico en las heces).
 Los medios se enriquecen con inhibidores que
suprimen el crecimiento de los gérmenes no
deseados.
 se hacen diferenciales añadiendo ingredientes
específicos que permiten la identificación del
germen en una mezcla
Agar MacConkey. agar selectivo para las bacterias
gramnegativas y diferencial para distinguir las bacterias
que fermentan la lactosa y las que no. Incluye peptonas
digeridas, sales biliares, lactosa, rojo neutro y cristal
violeta.
Agar sal manitol. medio de cultivo selectivo empleado
para el aislamiento de estafilococos. Incluye extractos
de caseína y tejidos animales digeridos, extracto de
ternera, manitol, sales y rojo fenol. Pueden crecer en
presencia de una elevada concentración de sal y S.
cureus puede fermentar el manitol, lo que produce
colonias de color amarillo en este agar.
Agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD). agar selectivo
utilirado en la detección de Sclmonellc y Shigellc en
cultivos entéricos. para la detección de bacterias
importantes en una mercla compleja de bacterias
insignificantes, levaduras con xilosa, lisina, lactosa,
sacarosa, desoxicolato sódico, tiosulfato sódico, citrato
amónico férrico y rojo fenol. Este medio, utilizado para
aislar micobacterias, contiene glicerol, harina de patata,
sales y huevos coagulados (para solidifcar el medio). Se
añade verde malaquita para inhibir las bacterias
grampositivas.
Agar con inhibidor de hongos flamentosos. compuesto
selectivo enriquecido que se emplea para el aislamiento
de hongos patógenos distintos de los dermatofsuprimir
el crecimiento de las bacterias contaminantes.
MEDIOS ESPECIALIZADOS
para detectar gérmenes específicos exigentes o que se
presentan mezclados con muchos otros.
CULTIVO CELULAR
 Algunas bacterias y todos los virus son gérmenes
intracelulares estrictos, de forma que sólo se
pueden cultivar en células vivas.
 En 1949 John Franklin Enders describió una técnica
para cultivar células de mamífero y aislar el virus de
la poliomielitis.
 pueden ser células que crecen y se dividen sobre
una monocapa de células o células suspendidas en
un medio de cultivo.
 Otros cultivos celulares se deben preparar
inmediatamente antes de infectarlos con bacterias
o virus y no se pueden mantener en el laboratorio
más de unos pocos ciclos de división (cultivos
celulares primarios).
 La entrada a las células se suele regular por la
existencia de receptores específicos a la capacidad
diferencial de infectar líneas celulares para predecir
la identidad de una bacteria o virus.

Agar Middlebrook. para aislar micobacterias. Contiene

nutrientes necesarios para el crecimiento de las
micobacterias (es decir, sales, vitaminas, ácido oleico,
albúmina, catalasa, glicerol, glucosa) y verde malaquita
para inhibir las bacterias grampositivas.

CHROMagar. agar selectivo diferencial utilizado para

aislar e identificar - tintas de la levadura Ccndidc.
Contiene cloranfenicol para inhibir las bacterias y una
mezcla de sustratos cromogénicos especiales. Ccndidc
clbiccns genera colonias verdes, Ccndidc tropicclis
genera colonias moradas y Ccndidc krusei las genera
rosadas.