Índice

Descripción de utilidad del producto................................................................................................3

Planteamiento del problema............................................................................................................4
Proceso general de producción considerando las etapas desde la materia prima hasta el
tratamiento de desechos..................................................................................................................4
Proceso de producción......................................................................................................................5
Diagrama de procesos simple...........................................................................................................8
Redacción propuesta.........................................................................................................................8
Organismo biológico utilizado en el proyecto de producción de Insulina Recombinante Humana.
...........................................................................................................................................................8
Ruta metabólica................................................................................................................................9
Producción de Insulina....................................................................................................................11
Optimización de la ruta metabólica y sobreflujo metabólico para la producción de proteínas....12
Regulación génica en procariotas...................................................................................................15
Propuesta de mejoramiento genético de la producción del metabolito........................................17
Balance de masa teórico para el crecimiento.................................................................................18
Balance de masa teórico para la producción del metabolito.........................................................19
Explicación de diferencias entre los valores obtenidos y los utilizados para la propuesta de
producción a nivel industrial...........................................................................................................20
Justificación del sistema de cultivo a utilizar considerando el comportamiento metabólico del
sistema biológico, velocidad de crecimiento, velocidad especifica producción del metabolito,
velocidad específica del consumo de sustrato, curva de crecimiento donde se indique
comportamiento de la biomasa, sustrato y producto en función del tiempo...............................21
Bibliografía:.....................................................................................................................................23

2
Descripción de utilidad del producto
La diabetes es una enfermedad que se presenta cuando el nivel de glucosa en la sangre
(también conocido como azúcar en la sangre) es demasiado alto. La insulina es una
hormona peptídica (Olivares & Arellano, 2008) que se libera de las células β en el islote de
Langerhans (también conocido como islote pancrático), esta ayuda a regular el nivel de
glucosa en la sangre, además regula el metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas,
también, promueve la división y crecimiento celular, esto, por medio de su transporte y
almacenamiento en las células, dadas diversas señales por medio del receptor de
membrana celular específico, IR (Olivares & Arellano 2008).

La terapia con insulina inyectada (que antes de la insulina recombinante humana se

utilizaba la de origen porcino), es la una parte primordial del tratamiento de la diabetes,
ya que, dependiendo del nivel de insulina en la sangre, es el tipo de diabetes que los
pacientes desarrollan, entre estas, tipo 1 y 2. En la primera se debe inyectar insulina
porque el cuerpo no produce la hormona, en la segunda se puede controlar por medio de
la dieta y actividad física, cualquiera de las dichas, comúnmente, puede tener su origen
por herencia (genética) esto da origen a alteraciones en las secuencias de aminoácidos de
las células o receptores.

Mundialmente se estima que para el 2030, aproximadamente 500 millones de personas

necesitarán insulina para el tratamiento de diabetes tipo 1 y 2 (WHO, 2022), quiere decir
que la industria biotecnológica necesita producir cantidades enormes de insulina para
satisfacer la demanda del consumidor con este padecimiento (Babu Kaki et al, 2022), sin
embargo más de 60 millones de personas con diabetes tipo 2 no tienen acceso a la
insulina por su precio (WHO, 2022), mayormente en países en vías de desarrollo.

En 2018, el tamaño de mercado mundial de insulina humana era de 21.26 billones de

dólares, y se espera que para 2026 alcance 27.71 billones de dólares (Fortune Bussiness
Insights, 2020). Entre el mercado mundial, Estados Unidos domina aproximadamente el
94% del mercado total de insulina humana de América del norte, debido a la prevalencia
de diabetes del país (Mordor Intelligence, s.f.).

3
Planteamiento del problema
Actualmente la insulina se produce predominantemente en E. coli debido a que su
metabolismo es simple y no tiene requerimientos nutricionales. La producción va dirigida
específicamente a la molécula BL-21 (DE3), por su alta densidad celular y reducción
significativamente de costos de incubación. Actualmente la alta demanda en pacientes
que padecen de diabetes tipo 1 o 2 exige requerimiento de insulina en grandes
cantidades, por lo que se busca obtener una planta con una producción de 80 g/L de
materia prima, (E. coli BL21 (DE3) con una pureza del 98%. La producción requiere de una
alimentación de 20 L de medio de cultivo en una fermentación discontinua (batch),
obteniendo 4 g/L de masa celular seca a partir de una biomasa inicial de 7 g. (Baeshen et
al, 2014).

Los requerimientos de equilibrio de pH son utilizados en casi todas las operaciones

unitarias del proceso (así como los buffers) dado a que se manejan cuerpos de inclusión
(IBs), que, aunque comparado con las expresiones de proteína solubles (es decir, liberan
la proteína al sobrenadante del medio de cultivo) realizadas en microorganismos como S.
cerevisiae y Pichia pastoris, los IBs son resistentes a la degradación y tienen una buena
estabilidad mecánica (Baeshen et al, 2014) estos son liberados de la célula por medio de
homogenización y liberan la proteína que es susceptible a la degradación por enzimas
proteasas, cambios de pH, calor, etc.

Proceso general de producción considerando las etapas desde la materia prima hasta
el tratamiento de desechos.
Materia prima

 Buffer de lavado (20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5) a 100 g/L

 Medio de fermentación que contiene extracto de levadura (5 g/L, proteína de soya
10 g/L, K2HPO4 6 g/L, KH2PO4 3 g/L, NaCl 5 g/L y glucosa 5 g/L).
 Buffer de lisis (20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5).
 TE buffer (1% Triton X-100, 10% alcohol isopropílico).
 Buffer (8 M Urea, 20 mM cisteína HCl, 2 mM EDTA y 20 mM Tris pH 9.5).

4
  Buffer 150 mM sulfato de sodio que contiene 25% acetonitrilo y 20 mM ácido
cítrico a pH 3.5.
 Buffer de elución 100 mM Tris pH 9.5.
 Buffer 200 mM sulfato de sodio, pH 2.3 con combinación de acetonitrilo (buffer A
contiene 10% acetonitrilo y el solvente B contiene 50% acetonitrilo).
 Ácido cítrico.
 Ácido clorhídrico.
 Cloruro de sodio.
 Hidróxido de sodio.
 Ácido citracónico.
 Peróxido de hidrógeno.
 Carboxipeptidasa-B.
 Cloruro de zinc.

Equipos requeridos:

 Tanque agitado de fermentación con aireación.

 Centrifugas con capacidad mayor a 8,000 g.
 Homogeneizador de alta presión.
 Incubadoras con y sin agitación.
 Akta Pilot (GE, Healthcare Biosciences), sistema de cromatografías.
 Akta Purifier (GE, Healthcare Biosciences)
 Columnas pre equilibradas (YMC, Japón).
 RP-HPLC (Agilent, EUA).
 Liofilizador.

Proceso de producción
Para la producción de insulina recombinante posterior a la obtención del vector, se
consideran 8 etapas: fermentación, homogeneización, recuperación, concentración,
purificación, pulido, secado y almacenamiento.

5
Al ser una molécula difícil de conseguir en cantidades abundantes la planta industrial se
acoplaría producciones pequeñas, es decir, no requerirá de instalaciones y equipos
grandes, lo que permitirá reducir costos de operación.

1. Fermentación: inoculación aséptica en un litro de medio de fermentación que

contiene extracto de levadura (5 g/L, proteína de soya 10 g/L, K 2HPO4 6 g/L, KH2PO4
3 g/L, NaCl 5 g/L y glucosa 5 g/L), en un fermentador agitado con circulación de
aire, a un pH de 6.86, oxígeno disuelto: 100-0%, corriente de aire de 0.5 vvm,
oxígeno a alta presión 0.2-03 bar. Durante la fermentación las células son
alimentadas con una elevada concentración de glucosa para mantener dichos
parámetros, a su vez, está conectada con una bomba de ácido, para que cuando el
pH sobrepase el punto fijado, este sea controlado.
2. Centrifugación 1: 10,000 g por 45 minutos.
 Suspensión de pellet en buffer de lavado (20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5)
a 100 g/L
3. Centrifugación 2: 10,000 g a 4°C por 30 minutos.
 Re-suspensión en buffer de lisis (20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5)
4. Homogeneizador de alta presión.
5. Centrifugación 3: lisado centrifugado a 10,000 g a 8°C por 45 minutos para
concentrar los cuerpos de inclusión (IBs).
 Lavado con TE buffer (1% Triton X-100, 10% alcohol isopropílico) liberado a
50 g/L.
6. Centrifugación 4: 10,000 g a 8°C por 45 minutos.
 Solubilización en buffer (8 M Urea, 20 mM cisteína HCl, 2 mM EDTA y 20
mM Tris pH 9.5) por 6 h a temperatura ambiente.
7. Incubación con agitación 1: 2-8°C por 36 horas.
 Ajuste de pH a 3.5 usando 2 M ácido cítrico.
8. Filtrado: poro de 1 µm.
9. Cromatografía de intercambio catiónico 1: columna pre equilibrada.
 Buffer de elución 100 mM Tris pH 9.5.

6
10. Incubación 1: adición de anhídrido citracónico por goteo a la proinsulina replegada
(2 g/g de proteína), y mantenimiento de pH a 8.5 por adición de NaOH 6 M, adición
de peróxido de hidrógeno 10 mM, incubación por 2 h a temperatura ambiente.
11. Incubación con agitación 2: adición carboxipeptidasa-B a concentración 1:2000
(peso/peso), incubación por 6 h a temperatura ambiente.
12. Incubación 2: ajuste de pH a 2 por adición de HCl 0.1 M por 6 h a temperatura
ambiente.
13. Cromatografía de intercambio catiónico 2: solución anterior cargada en resina
empaquetada SP-Sefarosa FF en una columna XK 50 conectada a purificador Akta.
 Elución por 150 mM sulfato de sodio que contiene 25% acetonitrilo y 20
mM ácido cítrico a pH 3.5.
14. RP-HPLC: fracciones cargadas en columna YMC DAC 50 mm (50 x 250 mm)
empacada con resina YMC-Triart C8 (tamaño de partícula 10 µm), la cromatografía
es ejecutada utilizando buffer 200 mM sulfato de sodio, pH 2.3 con combinación
de acetonitrilo. El buffer A contiene 10% acetonitrilo y el solvente B contiene 50%
acetonitrilo a un flujo de 75 cm/h.
 La proteína es eluida aplicando un gradiente linear de 35.0%-38.0% B en 6
volúmenes de columna y monitoreadas a 280 nm.
15. Precipitación: 1.0% cloruro de zinc (peso/peso)
16. Centrifugación 5: 5000 g por 20 minutos.
17. Liofilizado: 20 pascales de vacío por 24 h.
18. Almacenamiento: polvo -30°C.

7
Diagrama de procesos simple

Materia
prima
Aire

Fermentación Recuperación Homogeneización

Inoculo

Pulido Purificación Concentración

Secado Almacenamiento

Redacción propuesta
El proceso propuesto de downstream y purificación del producto se expone en el artículo
“Industrial Scale Production of Recombinant Human Insulin using Escherichia coli BL-2”,
con ligeras adecuaciones para cálculos de las etapas como lo son rendimientos y flujos,
igualmente, los vectores y microorganismos para la transformación de cepas.

Organismo biológico utilizado en el proyecto de producción de Insulina Recombinante

Humana.
El organismo por utilizar es una bacteria, de nombre científico Escherichia coli, el nombre
común: E. coli, del filo proteobacteria, clase γ-proteobacteria, orden Enterobacteriales,
familia Enterobacteriaceae y por último el género, Escherichia.

8
La ruta metabólica que utiliza principalmente E. coli para crecer es glucolisis sin embargo
es importante destacar que es un microorganismo anaerobio facultativo y produce gases
de la fermentación de carbohidratos (Percival & Williams, 2014).

La cepa BL21 es preferida en el ámbito industrial, además de carecer de las proteasas Lon
y Omp-t (lo cual reduce considerablemente la degradación de la proteína dentro de la
bacteria), produce bajas cantidades de acetato, lo cual resulta estratégico (Lara, 2011).

Ruta metabólica

Ilustración 1. Glucolisis (Costas, 2018)

Etapa 1: reacciones preparatorias (incluye desde la glucosa hasta la división entre

Gliceraldehido 3-fosfato y Dihidroxiacetona fosfato)
 La glucosa es fosforilada por el ATP para dar glucosa-6-fosfato, que después se
isomeriza a fructosa-6-fosfato y una segunda fosforilación produce fructosa-1,6-
bifosfato. La aldolasa después escinde la fructosa-1,6-bifosfato en moléculas de 3
carbonos, gliceraldehido-3-fosfato y su isómero, dihidroxiacetona-fosfato, que se
inteconvierte en gliceraldehido-3-fosfato. Hasta este momento, todas las

9
 reacciones incluidas que consumen ATP no han tenido intercambio redox.
(Madigan et al, 2015).
Etapa 2: producción de NADH, ATP y piruvato.
 La primera reacción redox de la glicolisis se produce en la etapa II, durante la
oxidación de gliceraldehido-3-fosfato a ácido 1,3-bifosfoglicérico. En esta reacción
(que se lleva a cabo dos veces, una por cada molécula de gliceraldehido-3-fosfato
producido a partir de glucosa), la enzima de gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa, reduce su coenzima NAD + a NADH. Simultáneamente, cada
molécula de gliceraldehido-3-fosfato es fosforilada por adición de una molécula de
fosfato inorgánico. Esta reacción, en la que el fosfato inorgánico pasa a estar en
forma orgánica, prepara el escenario para conservación de energía. La formación
de ATP es posible porque el ácido 1,3-bifosfoglicérico es un compuesto de alta
energía. Así, se sintetiza ATP cuando cada molécula de ácido 1,3-bifosfoglicérico se
convierte en ácido 3-fosfoglicérico, y cada molécula de fosfoenolpiruvato se
convierte en piruvato. (Madigan et al, 2015).
 Durante la etapa I y II de la glicólisis se consumen dos moléculas de ATP y se
sintetizan cuatro moléculas de ATP. Por tanto, el rendimiento neto de energía de la
glicolisis es de dos moléculas de ATP por molécula de glucosa fermentada.
(Madigan et al, 2015).
En la glucolisis hay dos enzimas clave que regulan la dirección del flujo de carbono:
fosfofructocinasa y fructosa 1,6 bisfosfato fosfatasa. Que catalizan reacciones
fisiológicamente irreversibles.
 Cuando ADP y AMP son altos, los niveles de ATP son bajos.
 AMP inhibe a fructosa 1,6 bisfosfato fosfatasa en su reacción, por eso los niveles
de ATP son bajos, la célula no tiene necesidad de producir energía, por tanto, la
glucolisis es de baja velocidad.
 Se tendrá más G6P si no hay demanda energética. Una vez que baje la
concentración de G6P se dejará de inhibir la reacción.

10
  Se ve inhibida por el citrato y el ATP en exceso, se bloquea y ese exceso se utiliza
para sintetizar otras moléculas.
 El ATP en exceso favorece la formación de ácidos grasos y síntesis de biomasa.
 Mientras se forman otras moléculas y bajan los niveles de intermediarios y ATP, la
glucolisis es lente, cuando los niveles vuelven a la normalidad, entonces la
velocidad de la glucolisis también.
 La G6P va a la vía de las pentosas, para producción de NADP  NADPH para
síntesis de ácidos grasos, ácidos nucleicos, síntesis de pared celular y otros
intermediarios (aminoácidos)  exceso de ATP.

Producción de Insulina
La insulina es un polipéptido con actividad hormonal formado por 51 residuos de
aminoácidos. Su peso molecular es de aproximadamente 5.8 kDa (insulina humana) y está
compuesta por dos cadenas de aminoácidos (A y B) unidas por puentes disulfuro. La
cadena A tiene 21 aminoácidos, y la cadena B 30 (García Reyes, 2018), que se puede
representar en la siguiente figura.

Ilustración 2. Composición de insulina (Armenteros, Buján, García & López, 2019)

La insulina está compuesta por los aminoácidos: glicina (Gly), isoleucina (Ile), valina (Val),
glutamato (Glu), glutamina (Gln), treonina (Thr), cisteína (Cys), serina (Ser), leucina (Leu),
tirosina (Tyr), aspartato (Asn), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), histidina (His), lisina (Lys),
arginina (Arg) y alanina (Ala), que se derivan de intermediarios del metabolismo central
11
del carbono de la bacteria que sería glucolisis, asumiendo que G6P también va a vía de las
pentosas, y esta también sigue su curso por la glucolisis hasta llegar al Ciclo de Krebs por
tanto, se entiende que esta es la ruta que debe seguir en orden para generar insulina en la
maquinaría ribosomal como se ilustra en la siguiente imagen.

Ilustración 3. Metabolismo central del carbono y precursores de moléculas (Noor, Eden, Milo & Alon, 2010).
Ilustración 4. Metabolismo central del carbono y precursores de moléculas (Noor, Eden, Milo & Alon, 2010).

Se asume que gracias a la ruta central (glucolisis) que sigue E. coli como microorganismo
anaerobio facultativo se generan los precursores de aminoácidos necesarios para la

12
síntesis de insulina en cuerpos de inclusión, siguiendo los mismos puntos de control que
una glucolisis en un organismo no recombinante.

Optimización de la ruta metabólica y sobreflujo metabólico para la producción de

proteínas
 Sobrefl ujo metabólico.
La producción de acetato es indeseable ya que representa un desperdicio de carbono,
afecta el pH y el gradiente de protones transmembranal y puede provocar una drástica
disminución en el contenido de plásmido de células de E. coli como resultado de la
acumulación de acetato (Lara, 2011).
La producción de acetato bajo condiciones aerobias se atribuye a un desbalance entre los
flujos de carbono proveniente de la glucosa (la cual es transportada a través del sistema
de fosfotransferasa, PTS) en la glicolisis y el ciclo de los ácidos tricarboxilicos, lo cual
conduce a la acumulación de acetil coenzima A, la cual se transforma en acetato que se
transporta hacia afuera de la célula (De Anda, 2006).
Una manera de evitar el sobreflujo metabólico es restringir la velocidad de consumo de la
glucosa mediante la adición controlada de una solución concentrada al biorreactor. Esto, a
través de esquemas de alimentación constante, alimentación con incremento lineal,
exponencial o en su caso, emplear algoritmos de control más avanzados para controlar el
consumo mediante efectos indirectos del metabolismo, como variación de la tensión del
oxígeno disuelto (TOD) o el pH (Lara, 2011).
Una manera de lograr esto, es utilizar una fase de lote corte, acumulando biomasa a una
velocidad de crecimiento máxima (max). Una vez agotada la fuente de carbono inicial
(generalmente 15 g/L de glucosa), se inicia con la alimentación concentrada del medio
total. El incremento de velocidad de adición de la glucosa se hace exponencialmente para
mantener una velocidad de crecimiento constante. Para evitar el sobreflujo metabólico
debe mantenerse una tasa de consumo de glucosa menor al valor umbral que dispararía el
sobreflujo (Lara, 2011).
Al reducir la tasa de consumo de sustrato, se reduce la demanda de oxígeno para oxidarlo,
permitiendo alcanzar densidades celulares mayores que las de un cultivo por lote, pero sin

13
limitación por oxígeno (Lara, 2011). Por ejemplo, en la cepa E. coli VH32, con sistema de
glucosa modificado, PEP no es consumido durante el transporte de glucosa, por la tanto,
la reducción de PEP intracelular se espera ser menos dependiente de consumo especifico
de glucosa que a su vez provee más PEP disponible para las rutas de biosíntesis como
biomasa y producción de proteínas recombinantes. Por tanto, el lento transporte de VH32
evidenciado por una tasa de consumo de glucosa más bajo, mantiene un metabolismo
más balanceado (Lara et al, 2008).

 Ingeniería metabólica para la producción de proteínas.

Se pueden incluir mejoras genéticas dentro de la cepa bacteriana para mejorar la

producción de la proteína insulina. Por ejemplo, Choi et al (2003) estudiaron el
transcriptoma de cultivos de alta densidad celular de E. coli produciendo proteína,
seleccionaron y co-expresaron dos genes (glpF, que codifica para un transportador de
glicerol y prsA, que codifica para una fosforibosil pirofosfato fosfotransferasa), logrando
aumentar la producción de proteínas a más del doble, esto, utilizando glicerol como
fuente de carbono en lugar de glucosa, además se seleccionó el gen prsA ya que su
producto ribosa-fosfato pirofosfocinasa es una enzima clave para la síntesis de
aminoácidos (como purina, pirimidina, nucleótidos de nicotinamida, histidina y triptófano)
y ácidos nucleicos. Es por esto por lo que se razono, que al elevar PrsA resultaría en un
suministro eficaz de 5-fosforibosil-1-pirofosfato (PRPP) suficiente para la síntesis de
purina, pirimidina y aminoácidos y consecuentemente incrementar la producción de
proteína (IGF-If) durante un cultivo de alta densidad celular (Choi et al, 2003).
Con el objetivo de reducir el sobreflujo metabólico y mejorar el desempeño de cultivos de
alta densidad celular, Lara et al (2008) emplearon una cepa
de E. coli modificada en el sistema de transporte de
glucosa. En esta cepa, el sistema nativo PTS fue bloqueado,
y la glucosa es transportada a través de la permeasa
galactosa, que está sobre expresada a nivel cromosomal en
la cepa modificada, dado a esto, el transporte de la
permeasa de galactosa no depende de PEP como en el PTS.

14

Ilustración . Cepa mutada,

transporte a través de la
 2011)

Esto permite tener más PEP disponible para funciones biosintéticas, también, tiene un
mayor flujo de carbono hacía la vía de las pentosas fosfato, que incrementaría la cantidad
de precursores de ácidos nucleicos para mantener una mayor de plásmido (Lara, 2011).
Para una mayor afinidad de codones de la cepa modificada se deben planear los
constructos en simuladores de genes como AmplifX, para posteriormente pasar a una
optimización de codones adecuada para la cepa bacteriana de acuerdo con la preferencia
por la traducción de estos.

Regulación génica en procariotas

La expresión de los genes procariotas se regula principalmente en la transcripción y se
realiza principalmente mediante la inducción o la represión de los operones, los genes se
organizan en grupos llamados operones, siempre están activados en ausencia de
represores u otros factores catabolitos (Oiseth, Jones & Maza, 2022):
 Operones catabolitos (Oiseth, Jones & Maza, 2022):
Son grupos de genes co-regulados más todos los componentes que se unen para
regular esos genes, tienen 2 regiones primarias de secuencias de ADN.
La región reguladora tiene:
 Promotor: se une al factor sigma y a la ARN polimerasa para iniciar la
transcripción.
 Operador: una secuencia de ADN que puede unirse a un represor.
 Represor: proteínas que impiden que ARN polimerasa se desplace
hacía abajo del gen.
 La transcripción se inhibe cuando los represores se unen a sus
operadores.
 Gen regulador: genes de una proteína activadora o represora.
 Promotor del gen regulador
 Región de codificación catabolitos (Oiseth, Jones & Maza, 2022):
Contiene múltiples genes para varias proteínas diferentes, están o todos activados
o todos desactivados.

15
 Operones inducibles catabolitos (Oiseth, Jones & Maza, 2022):
Los operones que están apagados en el estado “normal” y se encienden bajo
ciertas condiciones. Por ejemplo, el operón lac, cuando la glucosa no está
disponible o hay lactosa presente, la presencia de esta induce al operón lac.
 Región codificante: contiene genes que participan en el metabolismo de la
lactosa.
 La región reguladora codifica para un represor y un activador (proteína
activadora de catabolitos).
 Regulación génica a través del represor lac catabolitos (Oiseth, Jones & Maza,
2022):
 La lactosa impide la unión del represor a la secuencia del operador.
 En presencia de lactosa el represor es incapaz de unirse, por tanto, se
produce la transcripción de los genes.
 Cuando no hay lactosa el represor se une a la secuencia operadora y se
inhibe la transcripción porque se bloquea la ARN polimerasa.
 Regulación de genes a través de la proteína activadora por catabolitos (Oiseth,
Jones & Maza, 2022):
 Cuando la glucosa es baja: se produce la proteína activadora por
catabolitos  se une a la región potenciadora y activa/acelera la
transcripción.
 Cuando la glucosa es abundante: no se produce la proteína activadora por
catabolitos  no se potencia la transcripción.

16
Con esto en mente se tiene claro que en el planteamiento de la mejora genética se deben
tener operones útiles para la inducción y síntesis de insulina. Esto por medio de la
regulación de los genes responsables de síntesis de aminoácidos.
En el caso de regulación de síntesis cinética no aplica, ya que no sé está buscando regular
la velocidad en la que suceden las reacciones, ya que no son catalizadas por enzimas, más
bien son temas que tienen que ver con la regulación genética de la bacteria.

Propuesta de mejoramiento genético de la producción del metabolito

La bacteria BL21, es una cepa popular utilizada en la industria debido a su alta capacidad
de expresar proteínas recombinantes. Por lo tanto, sugerimos un enfoque en el cultivo E.
coli BL21, con el objetivo, de producir una forma recombinante activa de la proteína
insulina con mayores rendimientos, esto debido a que dicha bacteria produce una
cantidad sustancialmente menor de acetato, el cual inhibe el crecimiento y la formación
de proteínas recombinantes, incluso a bajas concentraciones.

Se propone producir intracelularmente en E. coli la proinsulina humana, fusionada con dos

dominio de unión a IgG sintéticos (ZZ), esto derivado de la proteína A estafilocócica, lo
cual permite obtener niveles mejorados de expresión de péptidos, la cola no contiene
residuos de cisteína que puedan causar puentes disulfuro no deseados y permite una alta
resistencia a la proteólisis. La cepa BL21, es una cepa de expresión para genes heterólogos
en vectores del sistema pET que porten el promotor del fago T7, es por ello, que la
construcción del plásmido a partir de la optimización de codones del constructo para la
expresión del huésped E.coli BL21 recomienda la clonación con el plásmido pET28a, que
lleva como promotor T7, elección propuesta debido a un mejor control sobre la expresión
de la proteína de interés, dado que la proteína se induce solamente cuando se añade un
inductor del operón lac, siendo su origen de replicación en Pbr322. Se tiene una secuencia
peptídica corta (GGSGGS) entre el codón ATG de iniciación y el dominio ZZ. La proteína ZZ
recombinante contiene una etiqueta de Hexa histidina en el extremo N-terminal; las
histidinas permitirán la purificación mediante cromatografía de afinidad con un metal

17
 inmovilizado, pues la histidina ayudará a marcar la proteína de fusión de proinsulina, con
el fin de obtener una forma soluble, con un alto grado de pureza y en gran cantidad.

El vector de expresión usado en este trabajo contaría con secuencias de reconocimiento

Ncol y BamHI

Ilustración 6. Plásmido de expresión (Novagen 2022)

Una de las formas en las que se evaluaría si la cepa fue modificada correctamente es por
medio de su gen de resistencia a kanamicina, entonces esta se mostrará en el cultivo.

Balance de masa teórico para el crecimiento

𝟏
𝟎. 𝟗𝟑𝑪𝟔 𝑯𝟏𝟐 𝑶𝟔 + 𝑵𝑯𝟑 + 𝟑. 𝟑𝟖 𝑶𝟐 + 𝟎. 𝟎𝟓 𝑲𝟐 𝑯𝑷𝑶𝟒 → 𝟐𝑪𝑯𝟏.𝟗𝟒 𝑶𝟎.𝟓𝟑 𝑵𝟎.𝟐𝟓 𝑷𝟎.𝟎𝟐𝟓 + 𝟒. 𝟑𝟐𝑯𝟐 𝑶 + 𝟑. 𝟓𝟖𝑪𝑶𝟐 + 𝟎. 𝟏𝑲𝑯𝟐
𝟐

BALANCE ESTEQUIOMETRICO:

5.58-C-5.58

12.7-H-12.8

12.54-O-12.54

0.5-N-0.5
18
 0.1-K-0.1

0.05-P-0.05

Relación sustrato-biomasa: 0.93 glucosa: 2 biomasa

Reactivos:

 Glucosa
180.156 g GLU
( 0.93 moles )=167.54 g GLu
1mol
 Amoniaco
17.031 g NH 3 1
1 mol 2 ( )
moles =8.51 g N H 3

 Oxigeno molecular
32 g O2
( 3.38 moles )=108.16 g O2
1 mol

 Fosfato dipotásico (sal del medio)

174.2 g K 2 HP O4
( 0.05 moles )=8.71 g K 2 HP O4
1 mol

Productos:
 Biomasa
26.32 g Biomasa
( 2 moles )=52.64 g biomasa
1 mol
 Agua
18.015 g H 2 O
( 4.32 moles ) =77.82 g H 2 O
1 mol
 CO2
44.01 g C O 2
(3.58 moles )=157.55 g C O2
1 mol
 KH2
174. g K H 2
( 0.1 moles )=17.42 g K H 2
1 mol

RENDIMIENTO DE BIOMASA

X 52.64 g
Y = =0.314=31.4 %
S 167.54 g

19
 Balance de masa teórico para la producción del metabolito
𝟕𝟗 𝑪𝟔 𝑯𝟏𝟐 𝑶𝟔 + 𝟏𝟓𝑶𝟐 + 𝟏𝟐𝑪𝟓 𝑯𝟏𝟏 𝑵𝑶𝟐 𝑺 + 𝟏𝟏𝟖𝑵𝑯𝟑 → 𝟐𝑪𝟐𝟓𝟕 𝑯𝟑𝟖𝟑 𝑵𝟔𝟓 𝑶𝟕𝟕 𝑺𝟔 + 𝟑𝟑𝟒𝑯𝟐 𝑶 + 𝟐𝟎𝑪𝑶𝟐

BALANCE ESTEQUIMETRICO

534-C-534
1434-H-1434
528-O-528
130-N-130
12-S-12
Relación sustrato-producto: 79 glucosa: 2 producto

Reactivos:
 Glucosa
180.156 g GLU
( 79 moles )=14,232.32 g Glu
1mol
 Metionina (sal del medio)
149.21 g C5 H 11 N O 2 S
( 12mol )=1,790.52 g metionina
1 mol
 Oxígeno molecular
32 g O2
( 15 moles )=480 g O2
1 mol
 Amoniaco
17.031 g N H 3
( 118 moles )=2,009.65 g N H 3
1 mol

Productos:
 Insulina recombinante
5807.62 g insulina
( 2moles )=11,615.24 g insulina
1 mol
 Agua
18.015 g H 2 O
( 334 moles )=6015.01 g H 2 O
1 mol
 CO2
44.01 g C O 2
( 20 moles )=880 g C O2
1 mol
RENDIMIENTO DE PRODUCTO

20
 P 11,615.24 g
Y = =0.816=81.61 %
S 14,232.32 g

Explicación de diferencias entre los valores obtenidos y los utilizados para la

propuesta de producción a nivel industrial
Los valores propuestos a nivel industrial son totalmente diferentes a los obtenidos en el
balance de masa teórico, esto puede deberse a las relaciones estequiométricas que son
una de las herramientas principales para contabilizar los flujos de materia entre un
determinado proceso industrial, como es el caso de la producción de insulina
recombinante.
En la siguiente tabla se hace la comparación de los diferentes valores obtenidos a partir de
los diferentes métodos.
CRECIMIENTO
COMPONENTE DE ENTRADA g/l de medio COMPONENTE DE SALIDA g/L de medio RENDIMIENTO DE BIOMASA
Glucosa 167.54 Biomasa 52.64
TEÓRICO 31.40%
K2HPO4 8.71 g Agua 77.82
LITERARIO O Glucosa 5 biomasa 80
38%
VARIABLE
K2HPO4 6 Agua 862.244

Tabla 1. Comparación de valores obtenidos / utilizados en proceso industrial para el crecimiento

PRODUCCIÓN DEL METABOLITO
RENDIMIENTO DE
COMPONENTE DE ENTRADA g/l de medio COMPONENTE DE SALIDA gramos/batch
PRODUCTO
Insulina recombinante 11,315.24
TEÓRICO Glucosa 14,232.32 81.61%
Agua 6015.01
Insulina recombinante 11
LITERARIO O VARIABLE Glucosa 2.038 52%
Agua 4

Tabla 2. Comparación de valores obtenidos / utilizados en proceso industrial para el metabolismo de insulina recombinante

Como se puede observar los valores obtenidos a partir de balance de masa teórico son
totalmente diferente a los obtenidos en la literatura y simuladores, algunos son mayores y
otros menores, sin embargo, esto se debe a que el balance de masa permite evaluar cada
uno de los compuestos y sus cantidades requeridas de materiales brutos y de productos
obtenidos, además, al ingresar más fuente de carbono nuestra producción será mayor, sin
embargo, el balance de materia no toma en cuenta la cantidad que la cepa Escherichia
Coli BL21 es capaz de ingerir, por lo que tenemos valores mayores en comparación con los
propuestos por la literatura. Es por ello, que podemos decir que los rendimientos de
biomasa son menores en el balance de masa teórico, pues no considera la capacidad de la
bacteria y su productividad al darle grandes cantidades de fuente de carbono (glucosa),
mientras que la literaria se usan gramos que la bacteria podrá tomarlos y usarlos para una
mayor productividad sin que corra riesgos de excretar acetato como un metabolito de
desbordamiento debido a un desequilibrio entre la captación de glucosa y el metabolito
central (Steinsiek, et al,. 2012).

21
Justificación del sistema de cultivo a utilizar considerando el comportamiento
metabólico del sistema biológico, velocidad de crecimiento, velocidad especifica
producción del metabolito, velocidad específica del consumo de sustrato, curva de
crecimiento donde se indique comportamiento de la biomasa, sustrato y producto en
función del tiempo.
 Sistema de cultivo
El medio de cultivo a utilizar es TB modificado junto con kanamicina. Dicho medio está
formado por nutrientes que permitan obtener una adicción controlada de sustrato en
el fermentador, así como un mayor rendimiento y productividad de la bacteria
seleccionada. En la siguiente tabla (3) se menciona cada uno de sus elementos con
cantidades recomendadas (Baeshen, et al., 2014)

Tabla 3. Elementos que forman el medio TB modificado

Durante la fermentación, las células se alimentaron con una concentración elevada de

glucosa como complemento para mantener los parámetros establecidos. La concentración
de glucosa nutritiva y extracto de levadura en los medios de alimentación permite una
cantidad efectiva de molécula inductora IPTG para minimizar la formación de proteína
recombinante especifica. Este tipo de cultivos generalmente se realizan en glucosa, siendo
la fuente de carbono favorita de las diferentes cepas de Escherichia coli, puesto que su
estructura lipídica de la membrana depende de la tasa de captación de glucosa (Shokri, et
al., 2002). Adicionalmente, la glucosa impide el uso de otras fuentes de carbono mediante
la exclusión del inductor y mediante la inhibición de la síntesis de la molécula señalizadora
cAMP, este es un fenómeno denominado represión catabólica del carbono

 Velocidad de crecimiento
La velocidad de crecimiento fue establecida a partir de la recopilación de datos, donde
señalan que la bacteria Escherichia coli es capaz de producir insulina recombinante al
1
citoplasma a partir de una tasa de crecimiento de entre 0.08−0.12 , por lo que se
h
1
seleccionó una de 0.10 , pues a partir del simulador, comprobamos que es benéfico para
h
la producción del metabolito manteniendo un equilibrio de biomasa-producto en corto
tiempo. (Baeshen, et al.2014).

 Curva de crecimiento
22
Los datos propuestos surgen de investigaciones de artículos y revistas científicas. Iniciando
con una concentración de biomasa inicial del cultivo ( x 0) de 7 g y con una μ=0.1h−1
(Baeshen, N. A, et al.2014). Fue establecida la con la siguiente formula en un tiempo
logarítmico de 24 horas.
Dando los siguientes resultados mostrados en la tabla 4-5 y representados en la gráfica de
fase logarítmica (ilustración 8).

Tabla 4. Parámetros de la curva de crecimiento

Ilustración 7. Curva de crecimiento logarítmica

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Tabla 5. Datos de curva de crecimiento

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