UNIVERSIDAD DE CALDAS

FACULTAD DE INGENIERÍA
PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

ACTIVIDAD ACADÉMICA: BIOPROCESOS PARA EL TRATAMIENTO Y

APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES

PRÁCTICA No 1: HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS USANDO UNA

PROTEASA DE ORIGEN BACTERIANO

Hidrólisis enzimática del Plasma Sanguíneo Bovino (Método pH-estato) y

Determinación de nitrógeno asimilable en Plasma Bovino (Método de Sörensen)

OBJETIVOS

 Explorar una alternativa de aprovechamiento de subproductos de la industria pecuaria a

través de la hidrólisis enzimática mediante una proteasa alcalina de origen bacteriano.
 Realizar el proceso tecnológico de hidrólisis enzimática del plasma sanguíneo bovino a
nivel de laboratorio en un reactor batch.
 Realizar seguimiento y control de la reacción hidrolítica a pH alcalino a través del grado
de hidrólisis GH, expresado como la relación entre el número de enlaces peptídicos
cedidos en la hidrólisis (h) y el número de enlaces peptídicos totales en la proteína nativa
por unidad de peso (ht).
 Utilizar el método de valoración del protón o método del pH–estato para la
determinación del grado de hidrólisis.

FUNDAMENTO TEÓRICO

El plasma bovino sanguíneo es una fuente potencial de proteínas de alto valor nutricional,
biológico e industrial, con altas posibilidades de aplicación de sus proteínas en más
sistemas alimentarios, lo cual constituye una tarea relevante para los investigadores de la
industria alimenticia. Su incorporación en alimentos contribuye al mejoramiento de su valor
nutricional de una manera relativamente significativa y económica por la alta
disponibilidad de esta fuente de proteína en el mundo.

Las aplicaciones tecnológicas del plasma sanguíneo bovino en sistemas alimentarios se han
orientado principalmente a su uso como agente emulsionante y estabilizante debido a su
contenido de proteínas como albúminas y globulinas presentes en su estructura molecular.
También el plasma tiene una excelente capacidad de formación de espuma, y se puede
utilizar para sustituir las claras de huevo en la industria de panificación. Igualmente, el

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plasma, por su contenido de 60% de albúminas, es un buen agente gelificante y sus geles
son similares a los de las claras de huevo (Liu, 2002).

Plasma como componente de medios para cultivos sumergidos

El plasma sanguíneo bovino tiene un contenido importante de proteínas (6 a 8%), las cuales
pueden servir como fuente de nitrógeno en medios de cultivo para fermentaciones
sumergidas industriales. De esta manera, el plasma puede aprovecharse en la industria
microbiológica para la obtención tanto de biomasa celular (por ejemplo, en el caso de los
cultivos iniciadores), como para la obtención de diferentes metabolitos.

Tabla 1. Composición de la sangre, plasma líquido y paquete celular bovino (g/100

mL).

Componente Sangre Plasma Paquete celular

(60%) (40%)
Agua 80-85 90-92 70-78
Proteínas 15-18 6-8 25-29
Lípidos 0,15 0,5-1 0,20
Hidratos de carbono 0,10 0,08-0,12 ---
Sales minerales 1,00 0,8-0,90 Trazas
Otras sustancias 0,55 0,20-0,30 ---
Materia seca 15-20 8-10 22-30
Fuente: Linden y Lorient (1996)

Propiedades funcionales de hidrolizados del plasma sanguíneo bovino

Se ha estudiado que los hidrolizados de proteínas potencian diversas características

funcionales, como por ejemplo baja viscosidad, mayor capacidad de agitación, dispersión y
alta solubilidad, las cuales les conceden ventajas para el uso en muchos productos
alimenticios, respecto a las proteínas originales (Kim et al., 2007; Kong et al., 2007;
Lamsal et al., 2007; Paraman et al., 2007; Ruiz-Henestrosa et al., 2007; Wasswa et al.,
2007; Yin et al., 2008). Lo que los hace ser considerados para su utilización en muchos
procesos alimentarios.

Particularmente en estudios de la hidrólisis de proteínas de plasma bovino se ha reportado

la existencia de péptidos con actividad antioxidante, efectos inmunomoduladores,
antitrombóticos y opioides han sido aislados de variadas proteínas nativas (Hartman, R.,
Meisel, H., 2007; Liu, Q. et al., 2009). Así como péptidos con propiedades antimicrobianas
han sido confirmados en hidrolizados de hemoglobina (Daoud, R. et al., 2005; Mak, P. et
al., 2004; Nedjar, N. et al., 2006; Nedjar, N. et al., 2008).

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Hidrólisis enzimática de las proteínas

La hidrólisis enzimática de proteínas es una reacción consistente en la ruptura, catalizada

por las enzimas, de los enlaces peptídicos que estructuran las cadenas proteicas,
consumiéndose una molécula de agua en el ataque nucleofílico por cada enlace roto, lo cual
provoca la liberación de grupos aminos y carboxilos terminales, surgiendo la dependencia
del estado de preconización con el pH (Adler-Nissen, 1986).

Para cuantificar el avance de la reacción, se emplea el criterio del grado de hidrólisis (GH),
el cual es una relación entre el número de enlaces peptídicos liberados y el número de
enlaces presentes en la proteína nativa. El GH puede ser determinado por los siguientes
métodos: 1) estimación del nitrógeno soluble, 2) determinación de los grupos α-amino
liberados, 3) valoración del protón liberado en la hidrólisis y 4) el descenso del punto
crioscópico (Guadix, 2002).

El método de pH-estato

El método de pH estato se fundamenta en mantener constante el pH del medio de reacción

con adición de una solución básica (hidróxido de sodio 0,1 N), pues a medida que la
hidrólisis avanza en medio alcalino, el grupo carboxilo terminal se disocia por completo y
los protones formados se reparten de acuerdo con el equilibrio de protonación de los grupos
α-amino liberados. La base agregada para mantener constante el pH neutraliza únicamente
los protones que son sustituidos por el catión de la base (Guadix, 2002).

Fuentes proteicas

Para la elección de una fuente proteínica adecuada debe tenerse en cuenta el uso o
aplicación del hidrolizado, así como el valor agregado del producto final con respecto al
sustrato inicial (Benítez, 2007). Este material de partida puede ser de origen animal, vegetal
o bacteriano.

Cuando se trata de favorecer propiedades tecnofuncionales, como la capacidad gelificante o

espumante, se emplea colágeno, gelatina, huevos, carnes o vísceras, entre otras; como
fuente de nitrógeno, en alimentación animal se emplean proteínas de pescado y
microbianas, en alimentación humana, principalmente proteínas lácteas y vegetales
(Guadix, 2000).

Estas proteínas son también fuentes de péptidos con actividad biológica y pueden ser
empleados en la formulación de alimentos funcionales. En esto se destacan las proteínas
lácteas, de vísceras de peces, huesos de cerdo, vegetales, hemoglobina y plasma de bovino,

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entre las que se ha encontrado actividad antioxidante, capacidad inhibidora de la ACE,
opioide, antitrombótica y antimicrobianas (Korhonen y Pihlanto, 2003; Ferreira et al.,
2007; Xinyan et al., 2010; Jae-Young et al., 2009; Qian Liu et al., 2010; Benítez, 2007;
Reddy, K. V. R, et al., 2004).

Proteasas comerciales

Las enzimas proteolíticas o proteasas comerciales hidrolizan los enlaces peptídicos con
diferentes grados de intensidad y de selectividad. De esta manera, se usará la enzima más
adecuada de acuerdo con la necesidad de la transformación requerida (Badui, 2006).

En el mercado se encuentran disponibles actualmente diferentes proteasas grado alimenticio

(Tabla 2). Estas proteasas pueden ser clasificadas por su origen (animal, vegetal, bacteriano
o fúngico), por su modo de acción catalítica (endo- o exo- actividad) o con base en su sitio
catalítico (serinproteasas, cisteinproteasas, aspartato proteasas, metaloproteasas,
interviniendo los aminoácidos serina, cisteína, ácido aspártico o un catión metálico).

Las enzimas tienen una conformación tridimensional especifica que cambia en la catálisis
generando tensión en la molécula y volviéndola susceptible a reacción, acelerando las
velocidades de reacción en el orden de 102-1011 (Wiley y Sons, 1986).

Tabla 2 Características de algunas proteasas comerciales y su clasificación

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Hidrólisis enzimática del plasma sanguíneo bovino

Materiales:

 Plasma sanguíneo bovino deshidratado.

 Agua destilada.
 Biker de 1000 mL
 NaOH 1,5 N
 NaOH 0.1 N
 Alcalase 2.4 L FG (Novozymes, Dinamarca) grado alimenticio.
 Soporte universal
 Pipeteador (1 und.)
 Termómetro de mercurio
 Jabón alcalino 20 mL
 Paños secantes 5 und.

Equipos

 Bioreactor de 2 L
 Baño termostatado.
 Titulador automático
 Agitador magnético
 Electrodo combinado (pH- Temperatura)

Procedimiento

 Montaje Figura 1
 Preparar 700 mL de una solución de plasma reconstituido con agua destilada con un
contenido inicial de 70 g/L de proteína (tiempo de homogenización 30 minutos en
agitación).
 Introducir la solución al biorreactor.
 Poner a punto el titulador automático acoplado al baño termostatado:
o Encender el titulador automático e iniciar agitación de la solución.
o Presione Mode para seleccionar el método.
o Editar el método para verificar la rutina de la hidrólisis.
 Ajustar pH de la solución de plasma hasta pH 8,5 o óptimo de actuación de la enzima
hallado o reportado en literatura con NaOH, minutos antes de alcanzar la temperatura
de trabajo (61°C).
 Encender el baño termostatado y fijar la temperatura de trabajo (61°C o óptima de
actuación de la enzima).
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 Introducir la sonda de temperatura del baño termostatado en el biorreactor para su
registro y control de la misma.
 Introducir el electrodo combinado del titulador automático para el registro de pH y
temperatura del medio o sustrato a hidrolizar.
 Introducir la sonda de la solución titulante (NaOH 1,5 N) del equipo.
 Verificar el registro de temperatura de la solución de plasma sanguíneo bovino en el
display del termostato y titulador.
 Alcanzada la temperatura y ajustado el pH, dosifique 0,10 g alcalasa / g proteína con el
pipeteador.
 Verifique que la sonda de titulación envía solución al reactor.
 Tiempo estimado de reacción hidrolítica 60 minutos.
 Con la opción Mode del teclado del titulador verifique el tiempo trascurrido de la
hidrólisis (min.) e igualmente el consumo de titulante en mL.
 El equipo parará la hidrólisis al alcanzar el tiempo programado y emitirá un sonido. Su
display registrará la cantidad de titulante consumido, anote este valor.
 Con el consumo de titulante, calcule el grado de hidrólisis GH según ecuación de %
GH.
 Inactive la enzima a 90°C trasladando el hidrolizado a un recipiente para su
calentamiento. Tome la temperatura con un termómetro de mercurio.
 Guarde una muestra 100 mL de hidrolizado para la determinación del nitrógeno
asimilable.
 Para el cálculo del GH se debe relacionar este consumo de base con el GH según la
siguiente ecuación:

(Vásquez y Velázquez, 1999)

Donde : B = volumen NaOH (L); NB = normalidad (eqv /L);Mp= proteína (kg), ht = N°

total - enlaces peptídicos ( ht = 8,3 meqv /kg) ; α = grado de disociación α- NH2.

𝛼
+

𝑝𝑘 7,8 + 24 (Steinhardt y Beychok, 1964)

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En la siguiente tabla se muestran los valores del grado de disociación de proteínas (α) en
función del pH y la temperatura de la reacción hidrolítica (Adler-Nissen, 1986), que
pueden ser usados para cálculo del grado de hidrólisis GH.

Tabla 3. Valores de α para distintas temperaturas y pH (Adler-Nissen, 1986)

T ( °C) pH α
50 7,5 0,71
50 8,0 0,89
60 7,5 0,80
60 8,0 0,93

Figura 1. Montaje para hidrólisis enzimática de las proteínas del plasma sanguíneo
bovino.

Determinación de nitrógeno asimilable en Plasma Bovino. Método de Sörensen

En el plasma sanguíneo bovino el nitrógeno puede encontrarse en forma mineral bajo forma
de catión amonio (NH4+), o en forma de nitrógeno orgánico como aminoácidos libres,
polipéptidos o proteínas.

Desde el punto de vista técnico es importante la determinación en el plasma las formas

nitrogenadas que son fácilmente asimilables por las levaduras y lactobacilos las cuales son
el catión amonio y los aminoácidos libres.

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Uno de los métodos para la determinación de nitrógeno asimilable es el de Sörensen o
titulación con metanal. Este método consiste en bloquear la función amina por adición de
un exceso de metanal según la siguiente reacción.

El derivado metilénico formado contiene el carboxilo de los aminoácidos, pero no posee

más al grupo básico (-NH2), por lo tanto se produce un descenso en el pH el cual se puede
titular con hidróxido de sodio.

Además el metanal bloquea al NH4+, dejando las sales de amonio titular su ácido y por lo
tanto la medida obtenida será la suma de nitrógeno aminado y amoniacal.

Materiales y equipo:

 NaOH 1 N
 NaOH 0.1 N
 Ácido cítrico
 Solución de metanal al 40% (formol), d =1.09g/L, corregida a pH 8 con NaOH 0.1N.
 Bureta de titulación
 pH –chimetro (1 und.)
 Soporte universal (1 und.)
 Biker de 50 mL (2 und.)

Procedimiento

 Colocar 25 mL de muestra a analizar en un biker de 100mL y ajustar a pH 8 con NaOH

1N y finalmente 0.1N
 Agregar 6.5mL de la solución de metanal a pH 8, agitar bien y esperar unos 10 minutos.
 Titular con solución de NaOH 0.1N hasta pH 8. Anotar el gasto (G).

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Cálculo

Sea G el gasto en mL de NaOH 0,1N obtenido en la valoración:

MAN = 14g/mol 1000 mL NaOH 0,1N 4g NaOH 1.4g N

MMNaOH = 40 g/mol G (mL NaOH 0,1N) xgN

,4

,
25 mL muestra

x g de N 1000 mL muestra

,4
2

( )