INSTITUTO TECNOLOGICO DE BOCA

DEL RÍO

INGENIERIA EN INDUSTRIAS
ALIMENTARIAS

SEMESTRE 6

BIOTECNOLOGÍA

PAULA ZUÑIGA RUIZ

BIOSEPARACIONES

GARRIDO VALERA NAYELI

1)  Principios y procesos de separaciones biológicas

Las operaciones que comprenden los bioprocesos reactivos a escala comercial

(Fig. 1.1), se han dividido tradicionalmente en operaciones previas (procesos
“upstream”) y operaciones posteriores o bioseparaciones (procesos
“downstream” )

Figura 1.1: Operaciones de un bioproceso. a) Operaciones previas y b)

Operaciones posteriores o bioseparaciones. Adaptada de: Bujurstrom, 1985.
Reproducida con el permiso de McGruw-Hill. Copyright © 1985.
Todos los derechos reservados. Las operaciones previas comprenden la
preparación del medio, la esterilización y el funcionamiento del biorreactor
(Cooncy, 1990). Los procesos de bioseparación involucran la recuperación,
concentración, purificación y acabado de los productos provenientes del
biorreactor. Comprenden todos los tratamientos que requiere el caldo de cultivo
para la obtención del producto tracelular es necesario romper las células y separar
los restos celulares. En el caso de que el producto sea extracelular (o cuando las
células son el producto), se requiere separar las células del caldo. Una vez
obtenido el caldo de interés éste se somete a las operaciones de recuperación,
concentración, purificación y acabado necesarias para obtener el producto en las
condiciones necesarias.
Las bioseparaciones también son muy empleadas en los bioprocesos extractivos,
donde el producto de interés se obtiene directamente de sus fuentes naturales
como la obtención de proteínas del plasma sanguíneo, enzimas de tejidos
animales y tejidos de plantas.
Otro campo de aplicación de las bioseparaciones es en los bioprocesos
enzimáticos para el procesamiento de los productos obtenidos, como en la
obtención de jarabes fmetosados. La aplicación de las bioseparaciones es muy
amplia, pero los principios en que están basadas son utilizados de manera similar
en los diferentes bioprocesos.en las condiciones de pureza, y actividad deseadas.
Tipos de Bioprocesos y Bioproductos
Actualmente se pueden distinguir de manera general tres generaciones de
bioprocesos, en relación al tipo de bioseparaciones que éstos involucran (Tabla
1.1).
La primera generación comprende el conjunto de bioprocesos desarrollados
mediante cultivos de organismos no recombinantes, cuyos productos se obtienen
en forma activa tanto si son intracelulares o si son secretados al medio de cultivo.
En esta generación se encuentran los bioprocesos de la biotecnología tradicional
como los de la producción de etanol, enzimas, ácido cítrico y antibióticos.
Los productos de estos bioprocesos se presentan en concentraciones altas al
inicio de la etapa de separación y no requieren de una extremada pureza para su
venta. los descubrimientos asociados con la biología molecular y la ingeniería
genética logrados en las últimas décadas, han ampliado las capacidades
biotecnológicas del hombre. En esta etapa podemos situar una segunda
generación de productos de la biotecnología como la insulina humana, la hormona
de crecimiento y el alfa interferón, entre otros.
Estos son producidos intracelularinente utilizando células recombinantes de
Escherichia coli Se caracterizan por encontrarse en bajas concentraciones dentro
de la célula, son de elevado peso molecular, tienen propiedades similares a los
contaminantes y requieren un alto grado de pureza. Además, generalmente al
producirse en la célula no poseen actividad biológica por tratarse de cadenas
peptídicas sin la conformación o estructura apropiada; lo que se traduce en la
necesidad de aplicarles tratamientos fisicoquímicos adicionales para lograr
obtener el producto en su estado activo.
Los desarrollos recientes en investigaciones terapéuticas tales como el uso de
DNA plasmídico (p I)N A ) en terapia génica y vacunas han fomentado el
desarrollo de bioprocesos novedosos para la producción de pDNA a gran escala
utilizando también E. coli como célula hospedera
(Tejada y Montesinos, 2008).
La tercera generación de la biotecnología, la podemos caracterizar por
bioprocesos mediante los cuales se obtienen productos extracelulares en células
recombinantes, la mayoría de las cuales son eucarióticas. En estos sistemas se ha
observado la capacidad no sólo de producir exógenamente el producto

deseado, sino que éste se obtiene en forma activa. El factor V III de la sangre, la
eritropoyetina (EPO ) estimuladora de la formación de eritrocitos, el agente
trombolítico activador del plasminógeno tisular (t-PA), los anticuerpos
monoclonales (mAb) para el tratamiento del cáncer y las citoquinas como los
interferones a y 0 con actividad antiviral, son productos característicos de esta
generación.
Debido a su empleo con fines terapéuticos, estos productos deben ser obtenidos
con un alto grado de pureza (Datar et ai, 1993). Actualmente, de 151 productos
recombinantes aprobados por la PDA y la EMEA, 59 (39%) son obtenidos en
células de mamífero, 45 (29.8%) en E. coli, 28 (18.5%) en 5. ccreirisiae, 17
(11.2%) en células de hibridomas, 1 (0.67%) en leche de cabra y 1 (0.67%) en
células de insecto (Ferrer-Miralles et al., 2009).
Varios bioprocesos tanto de la segunda como de la tercera generación pueden
considerarse bien establecidos y muy eficientes. Otros se encuentran en una
etapa de desarrollo que requiere ampliar el conocimiento de los aspectos
fundamentales del comportamiento de las operaciones principales, para contribuir
a su optimización y facilitar su validación (Asenjo y Andrews, 2008)
Operaciones de Bioseparación
Las operaciones de bioseparación se basan en las diferencias que existen entre
las propiedades fisicoquímicas de los componentes presentes en el caldo de
cultivo. El objetivo del diseño de un proceso de bioseparación es explotar esta
diferencia en las propiedades en la forma más económica. Generalmente existe
una propiedad específica que es la base primaria para la separación. Los métodos
de bioseparación usados con más frecuencia, así como la propiedad en la que se
basan, se muestran en la Tabla 1.2. 1.3.1.
Esquema RIPP
Las bioseparaciones generalmente comprenden varias operaciones que se
agrupan de acuerdo con un esquema típico en operaciones de: recuperación
(remoción de sólidos y ruptura celular), concentración, purificación y acabado (R
IPP de sus siglas en inglés). Esta estrategia involucra el uso de operaciones de
baja resolución en la recuperación y concentración ( e.g. filtración, extracción) y
operaciones de alta resolución para la purificación y el acabado (e.g.
cromatografía, cristalización, electroforesis).
Bioproceso
Típico Los bioprocesos para la producción de insulina humana están bien
documentados en la literatura y permiten presentar la gran diversidad de
operaciones unitarias que deben ser consideradas en las bioseparaciones (Ladish
y Kolmann, 1992). La insulina es una hormona pancreática que ha sido utilizada
en el tratamiento de la diabetes tipo I desde principios del siglo pasado.
insulina está formada por las cadena pepítidicas A y B unidas por puentes
disulfuro. La cadena A consta de 21 residuos de aminoácidos y la cadena B de 30.
La demanda mundial de iasulina en el 2006 osciló entre 7,000 y 10,000 kg/año y
se proyecta que alcanzará entre 15,000 y 20,000 kg/año para el año 2012. El
mercado mundial de la insulina se estima en $4,000 millones de dólares y las
principales compañías productoras son Novo Nordisk, Eli Lilly y Sanofi Aventis.
(Ainsworth, 2005). Al menos tres tecnologías han sido desarrolladas para producir
insulina basadas en bioprocesos con células recombinantes. El Método de las dos
cadenas fue desarrollado por la compañía Genetech y escalado por Eli Lilly.
En este método las cadenas A y B de la insulina se producen en E. coli por
separado y posteriormente se fusionan para formar la insulina recombinante. El
Método de la proinsulina intracelular ha sido comercializado por Eli Lilly y se basa
en la producción en E. coli de las cadenas A y B fusionadas formando un complejo
llamado proinsulina que una vez procesado da lugar a la insulina rocombinante.
El Método de la proinsulina extracelular fue desarrollado por Novo Nordisk y se
basa en la producción en S. cerevisiae de las cadenas A y B fusionadas formando
un precursor que es excretado por la célula y posteriormente procesado para
obtener insulina recombinante.
Método de la proinsulina intracelular
En la Figura 1.2 se presentan los principales pasos para la producción de insulina
por el Método de la proinsulina intracelular. Las células de E. coli sobreproducen
cuerpos de inclusión (C I) formados por el complejo Trp-LE’-Metproinsulina
(preproinsulina). Trp-LE’-Met es una señal peptídica de 121 residuos de
aminoácidos unida a la proinsulina de 82 residuos. La proinsulina se obtiene
mediante la recuperación de los CI, la solubilización de éstos y la ruptura del
enlace de la señal peptídica utilizando bromuro de cianógeno (CNBr) que corta por
el lado carboxilo el residuo de inetionina. Dado que las cadenas peptídicas A, B y
C no contienen residuos de metionina o triptófano, estas permanecen intactas.
La molécula de proinsulina obtenida, se somete a rcplcgamiento para permitir que
se formen los enlaces disulfuro entre las cadenas. La proinsulina es luego
sometida a sulfitolisis oxidativa para su plegamicnto apropiado. Finalmente, se
elimina la cadena peptídica C que une las cadenas A y B para obtener la insuluna
sintética (Datar y Rosén, 1990).

Figura 1.2: Los principales pasos para la producción de insulina por el "Método de
la proinsulina intracclular"sc basan en la obtención de: 1) E. coli por cosecha, 2) CI
por rompimiento celular, 3) preproinsulina por solubilización de los CI, 4)
proinsulina por rompimiento con CNBr, 5) proinsulina-SSO3 por sulfitolisis
oxidativa y 6) insulina por acción enzimática
Operaciones previas: Sección de fermentación
Las operaciones previas del bioproceso son la preparación y esterilización del
medio, la compresión y esterilización del aire, así como la fermentación (Fig. 1.3).
El medio de cultivo se prepara en el tanque V-101 y se esteriliza continuamente en
el equipo ST-101. El aire es provisto por el compresor G-101 y se mezcla con
amoníaco, para posteriormente esterilizarse por filtración en el equipo
AF101.Tanto el medio como la mezcla aire amoníaco se alimentan al fermentador
V-102. Este fermentador es inoculado mediante un tren de preparación de inóculo
de dos pasos (no se muestra). Al final de la fermentación se obtiene en el
biorreactor un caldo celular de E. coli conteniendo los CI formados por TrpLE’-Mct-
proinsulina, que es bombeado a un tanque de almacenamiento donde se mezcla
con una solución del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Bioseparac iones
Las bioscparaciones para la producción de insulina por el método de la proinsulina
intracelular. constan de las etapas de recuperación, concentración, purificación y
acabado.
Recuperación
Cosecha celular
El primer paso de la ruta de bioseparación consiste en la recuperación de las
células por centrifugación. El caldo concentrado se envía a un tanque de
almacenamiento V-106 que es la interfase entre las operaciones previas y las
bioscparaciones. Este paso se realiza por medio de 3 centrífugas de disco
operando en paralelo DS-101 (sólo se muestra una en el diagrama), bajo el
procedimiento 9 (P-9). El lodo recuperado se diluye con una solución de EDTA en
buffer TRIS en el tanque de mezclado V-109 para facilitar la separación de los CI
de los restos celulares.
Rompimiento celular y recuperación de C I
En este caso, el producto es intracelular y se requiere el rompimiento de las
células por medio de homogeneizadores de alta presión IIG-101 para liberar los
CI. El homogeneizado obtenido es centrifugado para recuperar los CI, utilizando
las mismas centrífugas DS-101 bajo el procedimiento 13 (P-13). Los CI se
recuperan en la fase pesada y la mayoría de los restos celulares quedan en la
fase ligera, debido a la mayor densidad y tamaño de los CI. La fase pesada es
mezclada con una solución del detergente Triton-XlOO y recentrifugada en las
centrífugas DS-101. Este lavado facilita la separación de los CI de proteínas
solubles y restos celulares.
Solubilización de C I
La suspensión que contiene los CI se transfiere a un reactor recubierto de vidrio V-
103, donde se hace reaccionar con urea y 2-mercaptoetanol. La urea es un agente
caotrópico que disuelve las proteínas desnaturalizadas de los CI y el 2-
mcrcaptoctanol es un agente que reduce los enlaces disulfuro. Al final de la
reacción de solubilización, se reemplaza la urea y el 2-mercaptoetanol por agua
para inyección (A P I) y se concentra la solución en la unidad de diafiltración DF-
101.
Las partículas finas remanentes se eliminan en el filtro DE-101 para evitar
problemas en los equipos de cromatografía.

Separación por creación de una

fase: inmiscible con la
fase de alimentación, por
transferencia de energía o
reducción de presión, ejemplo
destilación, condensación-
vaporización parcial, destilación
instantánea (Flash),
extracción con fluido supercrítico.
• Separación por adición de fase:
las cuales pueden
absorber, extraer o despojar
selectivamente ciertas
especies de la alimentación.
Ejemplo: absorción gaseosa,
extracción líquido líquido,
destilación extractiva, secado
Separación por creación de una fase: inmiscible con la fase de
alimentación, por transferencia de energía o reducción de presión, ejemplo
destilación, condensación-vaporización parcial, destilación instantánea (Flash),
extracción con fluido supercrítico.
• Separación por adición de fase: las cuales pueden absorber, extraer o
despojar selectivamente ciertas especies de la alimentación. Ejemplo:
absorción gaseosa, extracción líquido, destilación extractiva, secado
Separación por Barrera.

Para estos procesos de separación se emplean membranas. Los procesos de

separación se rigen por procesos difusionales.
Estos procesos incluyen el uso de membranas microporosas así como barreras
semoipermeables. Las membranas se fabrican de polímeros, fibras naturales
cerámico, metales, etc. La Figura No. 9 muestra un esquema de estos procesos.

La Tabla No. 3 muestra diversos Procesos de separación basados en Barreras.

                                        
                            
Tabla No.3.- Procesos de Separación por Barreras
Osmosis Inversa.- El proceso de ósmosis es un proceso natural mediante el cual
moléculas de agua fluyen a través de una membrana semipermeable,  desde una
solución de baja concentración a otra de mayor concentración.   Es una búsqueda
natural de equilibrio de concentraciones y ocurre a igual presión en ambos lados.

En el proceso de ósmosis inversa  se revierte el flujo de moléculas de agua a

través de la membrana semipermeable, como resultado de aplicar presión a la
solución de mayor concentración. Es posible entonces obtener agua pura a partir
de una solución de alta concentración a través de un método mecánico. La Figura
No.11 muestra un esquema de funcionamiento y un esquema de proceso de la
ósmosis inversa.
Operaciones de separación con una barrera semipermeable
La separación con membranas se usa cada vez más debido a que las membranas
que se pueden fabricar hoy en día son más selectivas, duraderas y baratas.
En este tipo de operaciones la separación se produce debido a que la velocidad
de paso a través de la membrana de los distintos componentes de la alimentación
es diferente. La membrana separa la fase alimentación en dos fases producto,
llamadas rechazo o retenido y permeado, que son completamente miscibles entre
sí. En las membranas densas (no porosas) la velocidad de paso de cada
componente depende de la permeabilidad de la membrana a ese componente y la
permeabilidad depende a su vez de la solubilidad en la membrana y de la
difusividad a través de la misma.
Las membranas densas se usan en permeación de gases (separar mezclas
gaseosas), en perevaporación (separación de mezclas líquidas) y en osmosis
inversa (separación de un disolvente, generalmente agua, de sales disueltas). En
las membranas microporosas es el tamaño diferente de los componentes a
separar quien determina que la velocidad de paso sea diferente y se consiga la
separación. La diálisis, la ultrafiltración y la microfiltración de soluciones para
separar moléculas más o menos grandes de un líquido son ejemplos de
operaciones de separación con membranas que usan membranas microporosas.
Separación por Agente Sólido
Estos procesos emplean agentes de separación de masa que son sólidos. Los
sólidos normalmente granulares actuan como soportes inertes para una capa
delgada que actua como adsorbente.
El agente de separación suele saturarse con el elemento que adsorbe y se
regenera o reemplaza periodicamente. La Figura No.12 muestra un esquema de
este tipo de proceso de separación y la Tabla No. 12 muestra diversos procesos
de este tipo.
Adsorción.- La Adsorción es el proceso para retirar impurezas de una corriente
gaseosa por medio de un material sólido adsorbente que tiene especial atracción
por las impurezas.

Adsorción carbón activado.- En este tipo de adsorción las moléculas orgánicas

se unen  a los poros internos del carbón activado. Los Adsorbados se mantienen
en la pared de los poros del carbón activado  por fuerrzas electrostáticas débiles
(Fuerzas de van der Waal’s) tal como se muestra en la Figura No. 13.
La Figura No. 14 muestra la Unidad de Separación por Adsorción: Retiro total del
agua del gas natural de la Planta de Malvinas mediante el empleo de Tamices
Moleculares donde se elimina agua hasta un nivel  menor de 0,1 ppm. Dos de los
tres tamices moleculares estarán en modo de adsorción y uno en modo de
regeneración.

Los tamices moleculares en modo adsorción absorben el agua  en el gas después

de pasar  por un filtro de entrada. Este gas deshidratado se envía a la turbo
expansión después de pasar por filtros de polvo. Los tamices moleculares están
calibrados para un tiempo de adsorción de entre 12 y 18horas. Después de
transcurrido este período, el recipiente pasará al modo de regeneración para
eliminar toda el agua contenida en los lechos de la criba.

Para la regeneración de los tamices moleculares, se emplea gas residual que se

calienta a 260ºC y entra al tamiz en el modo de regeneración. Al pasar a través del
tamiz molecular en el modo regeneración, el gas absorbe el agua que fue
previamente absorbida en el tamiz molecular en modo adsorción. 
Operaciones de separación basadas en un gradiente externo
Este tipo de operaciones suelen tener unos objetivos muy específicos y no se
emplean con tanta profusión en la industria química por lo que tampoco se tratan
en este texto. En la ultracentrifugación se genera un campo de fuerzas centrífugas
capaz de separar los componentes debido a su diferente masa. En la separación
de los isótopos U-235 y U-238 del uranio, la alimentación es en fase vapor
(hexafloruro de uranio) y el componente más pesado que contiene el isótopo U-
238 se concentra en la zona más externa de la centrífuga por donde sale
separado de la alimentación enriquecida en U-235 que sale por la parte central de
la centrífuga. La difusión térmica permite separar isótopos de una fase líquida o
gas creando un gradiente térmico que hace que los componentes se difundan a
diferente velocidad. La electroforesis se basa en la aplicación de campo de
fuerzas eléctricas y se emplea para separar coloides cargados eléctricamente. La
electrodiálisis combina membranas cargadas eléctricamente con la aplicación de
un campo eléctrico para eliminar sales de una solución (desalinizar salmueras)
Separación por campo de fuerza o gradiente.
     Se emplean campos de fuerza externos. Se aprovecha de las diferentes
respuestas de iones y moléculas a las fuerzas y a los gradiente. Se tiene:
centrifugación, la difusión térmica, la electrólisis, electrodialisis y la electrofóresis
Tejeda, A., & Montesinos, R. (n.d.).
http://www.untumbes.edu.pe/vcs/biblioteca/document/varioslibros/
1086.%20Bioseparaciones.pdf