Cultivo por Lote alimentado de Saccharomyces cerevisiae en Tanque Agitado

Cristina Aguayo, Eduardo Feijoo, Macarena Unda1. Laboratorio de Ingeniera de Fermentaciones, Universidad San Sebastin, General Cruz 1577 Concepcin, Chile. 1e-mail: mundav@ussmail.cl
RESUMEN Se realiz un cultivo por lote alimentado de levadura Saccharomyces cerevisiae. Para ello se utiliz un medio de cultivo definido, utilizando como sustrato limitante glucosa con una concentracin inicial de 6 g/L, y la alimentacin se realiz a velocidad constante (3,3 mL/min). El volumen inicial fue de 2,5 L aprox. y termin con un volumen de 3,1 L aprox; se comenz la alimentacin con una biomasa de 0,91 g/L y se termin con 0,83 g/L. Los resultados obtenidos se alejaron a los esperados, es por esto que el bajo crecimiento celular y efectos inhibitorios ocasionaran una dilucin del cultivo. Palabras clave: Saccharomyces cerevisiae, Cultivo por Lote Alimentado (CLA), alimentacin constante, INTRODUCCIN Una forma de operar un biorreactor es empleando la tcnica de lote alimentado (LA) o fedbatch. Esta tcnica se define como un cultivo en batch donde se alimenta continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus componentes. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento, esta tcnica permite controlar la velocidad de crecimiento () del microorganismo. El lote alimentado es particularmente til en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formacin de producto son sensibles a la concentracin del sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la productividad de la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. As, este mtodo se emplea cuando se quieren evitar fenmenos de inhibicin por sustrato y se requiere alcanzar una alta concentracin de biomasa. (1) El lote alimentado es la tcnica predominante para la produccin industrial de la levadura. La formacin aerbica del etanol reduce el rendimiento de la biomasa. Procesos de alta concentracin celular de la levadura se encuentran actualmente en estudio con el objeto de mejorar la economa del proceso. La aplicacin de las estrategias desarrolladas en la actualidad presenta varios inconvenientes para una aplicacin industrial simple, comenzando por establecer una alimentacin adecuada bajo la consideracin de un volumen variable. (2) Para iniciar un lote alimentado se inicia la alimentacin del cultivo cuando el sustrato limitante se ha agotado. Si bien ste no es un requisito indispensable, permite simplificar el tratamiento matemtico y adems es un buen punto de partida con respecto al objetivo del lote alimentado, es decir: controlar la velocidad de crecimiento mediante la velocidad de alimentacin, con medio de cultivo fresco. (3) OBJETIVO. Desarrollar de una estrategia simple de alimentacin del cultivo por lotes alimentado para controlar y maximizar el rendimiento del sustrato en biomasa. MATERIALES Y MTODOS Preparacin del inoculo. Se utiliz S. cerevisiae en presentacin de levadura comercial (Collico), se disolvi en un

volumen de 300 mL de medio de cultivo, previamente esterilizado. La preparacin del inoculo se realiz en medio estril bajo mechero; posteriormente el matraz se llevo al shaker con agitacin constante (100 RPM), a 30C durante 24 horas. Preparacin de Medio de Cultivo. El medio se realiz para 5 g/L de levadura a un volumen final de 2,5 L. El volumen de medio preparado para el reactor fue de 2 L. En la tabla N 1 se resumen la cantidad de gramos para pesar, para cada compuesto del medio de cultivo en base a un volumen de 2,5 L, sin embargo, el reactor solo se lleno hasta los 2 L. Como sustrato limitante se utilizo glucosa y se considero un exceso del 50% de los sustratos no limitantes Tabla N 1: Formulacin de medio de cultivo para operacin por lotes
Fuente C6H12O 6 (NH4)2SO 4 KH2PO 4 PA 12 14 30,1 PM 180 132 136 %NUT 40 21,21 28,74 %CEL 47 9,05 2,32 Yx/s 0,17 2,34 12,39 So* (g/L) 6 3,2 0,61 2 para 2,5 L 15 8 1,51 5

Instalacin del equipo. El fermentador utilizado (Biotron, Liflus GS) de una capacidad de 5L. El control de pH estuvo a cargo de un electrodo sensible a la acidez y/o basicidad del medio (electrodo de pH), conectado al control automtico del reactor, el cual dosifica soluciones de HCl (1N) y NaOH (1N) para ajustarlo en un pH de 4,5. Las condiciones de agitacin fueron de 400 rpm de manera constante, conectado al control automtico Biotron. Se utilizaron para la agitacin un rotor rushton a 5 cm del fondo del bioreactor. Adems de forma de evitar la espuma, se dispuso de un antiespumante de silicona (Winkler, AN-0378). La temperatura de monitorio mediante una termocupla (Digi Sence, mod. A 12990628) dentro del biorreactor y el control se realizo mediante un bao termostatizado (JULABO, F12-ED) a 30C. Posterior al armado del equipo se procedi a autoclavarlo con las mangueras de 14 mm de silicona. La autoclave utilizada (Quimis, mod Q290-25) se llevo a 121C por 15 min. Y posterior al proceso de esterilizacin se sello el biorreactor. Una vez autoclavado se conecto la aireacin con un filtro de algodn hidrfobo a un compresor conectado al rotmetro incorporado en el sistema Biotron con un flujo de 5 L/min. Para la alimentacin de fuente de carbono se utilizo una bomba peristltica (Master Flex, HV-77911-20) para un flujo de 3,3 mL/min. Cultivo por lote. En la etapa de crecimiento por lote se llev el inculo previamente preparado al bioreactor a un volumen de 2,5 L. Se tomaron muestras cada 30 min. incluyendo tiempo cero. La muestra se obtuvo desde una zona de muestreo definida constituida por una manguera conectada a la zona media del biorreactor y una jeringa para extraer la muestra, determinando as las mismas

Extracto de levadura

La concentracin de glucosa para la alimentacin del cultivo por lotes alimentados se calculo mediante la ecuacin 1, la cual rige para el sistema con velocidad de alimentacin constante.

Ec. 1 Donde: Vo = volumen inicial = 2,5 L V = volumen final = 3,1 L F = flujo de alimentacin = 3,3 mL/min Xo = biomasa inicial = 1 g/L = rendimiento = 0,17 g celula /g glucosa t = tiempo de alimentacin = 180 min Con esta consideracin de parmetros se obtuvo una concentracin de glucosa para la alimentacin de 127,57 g/L. Las soluciones ya preparadas fueron esterilizadas mediante la autoclave (Quimis, mod. Q290-25) a 120C por 15 min.

condiciones de muestreo para toda la experiencia; el volumen extrado para cada toma de muestra fue de 5 mL aprox. Se midi absorbancia para cada muestra, determinando su biomasa; el resto de las muestras fueron refrigeradas para una posterior medicin de sustrato mediante el mtodo de DNS. Estos procedimientos se detallan ms adelante. Cultivo por lote alimentado. El cultivo por lote alimentado comenz inmediatamente posterior al cultivo por lotes, siendo este con un flujo constante de 3,3 mL/min y con un volumen inicial de 2,5 L y un volumen final de 3,1 L. las condiciones de operacin son las mencionadas anteriormente para ambos cultivos. Las tomas de muestras fueron de la misma forma que en el cultivo por lote y cada 30 min. Medicin de Biomasa y Sustrato. Para medir biomasa se midi la absorbancia a 650 nm de cada muestra y, utilizando la curva de calibrado desarrollada por Osorio et al(4), con un rango de 0,054 a 0,338 g/L. Para la medicin de Sustrato se utilizo una curva de calibrado realizado por Osorio et al, con un rango de 0,2 g/L a 2 g/L de glucosa. Para preparar el reactivo DNS se disolvi 16 g de NaOH en 200 mL de agua destilada. Se disolvi 1 g de cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS, C7H4N2O7) y 300 g de tartrato de sodio y potasio (NaK(COO)2(CHOH)2 x 4 H2O) en dicha solucin, aforandola hasta 1 L con agua destilada. Se tom 1 mL de muestra y se agreg 1 mL de reactivo DNS a cada una. Se realizo el blanco de la misma forma reemplazando la muestra por agua destilada. Los tubos fueron tapados y llevados a bao Mara por 15 min., luego se enfriaron en un bao de hielo por 3 min., con el fin de detener la reaccin. Se agregaron 10 mL de agua destilada, se agit y se dej reposar durante 10 min. a temperatura ambiente; luego se midi la absorbancia a 540 nm UV-visible.

RESULTADOS Tabla N 2: Datos crecimiento biomasa y consumo de sustrato de CLA, a 30 C y pH 4,5.

Tiempo (h) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 6,8 7,3 7,8 X 0,50725038 0,57077752 0,62049441 0,67297335 0,71716614 0,74202458 0,74202458 0,78897942 0,9160337 1,09556691 1,01546748 1,03756387 1,03756387 0,97679878 0,93536804 0,83041016 0,83869631 S -0,11711146 -0,13281005 -0,13594976 -0,10141287 -0,12967033 -0,11711146 -0,12025118 -0,10455259 -0,00094192 0,81538462 1,11051805 1,20470958 1,20470958 1,29262166 1,30518053 1,36797488 1,51240188 S (corregido) 0,018838305 0,003139717 0 0,034536892 0,006279435 0,018838305 0,015698587 0,031397174 0,135007849 0,815384615 1,110518053 1,204709576 1,204709576 1,292621664 1,305180534 1,367974882 1,512401884

Biomasa vs tiempo
1,2 1,1 1 0,9
0,8

comienza la alimentacin

X (g/L)

0,7
0,6

0,5 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 Tiempo (h) 5,0 6,0 7,0 8,0

Figura N 1: Curva de crecimiento en CLA de S. cerevisiae.

1,6 1,4

Sustrato corregido versus tiempo

Tabla N 4: Oferta y Demanda de S. cerevisiae en CLA.

Oferta Demanda 8,8427 g glucosa/h 1,9009 g glucosa/h

1,2 1
S (g/L)

0,8 0,6
0,4 0,2 0 0,0 2,0 4,0 Tiempo (h) 6,0 8,0

Adems, se observa en la Figura N 2, una acumulacin de sustrato en el cultivo, lo que confirmara que la oferta es mucho mayor que la demanda. Para los clculos de concentracin de fuente de carbono mediante la utilizacin de glucosa (C6H12O6), se utilizo un de 0,17 g clula/g glucosa. El valor que debera haberse utilizado es de 0,49. Debido a la siguiente expresin:

Figura N 2: Curva de consumo de sustrato corregido en CLA de S. cerevisiae. Tabla N 3: Datos utilizados para clculo de velocidad mxima de crecimiento.

Tiempo Ln X 3,5 -0,23701504 4 -0,08770213 4,5 0,09127196

Donde:
Clculo velocidad mxima de crecimiento
0,1 0,05 0 -0,05

Ec. 2

Elemento

PM
[g/gmol]

Fuente C6H12O6

PM
[g/gmol]

%Ei %Ec 40 49

Yx/s

Xfinal
[g/L]

S
[g/L]

y = 0,328x - 1,391 R = 0,997

12

180

0,6 0,49

17

86,77

-0,1 -0,15

-0,2
-0,25 -0,3 3 3,5 4 Tiempo (h) 4,5 5

Este rendimiento terico re-calculado en comparacin con el utilizado presenta gran diferencia en las concentraciones de la alimentacin y la de medio para el cultivo por lotes como se resume en la tabla N 4. Tabla N 4. Comparacin rendimiento recalculado y empleado.
empleado Yx/s cultivo por lote cultivo por lote alimentado S0 (g/L) SF (g/L) 0,17 6 127,57 recalculado 0,49 2,55 44,66

Figura N 3: Clculo velocidad mxima de crecimiento, en cultivo batch para, S. cerevisiae. DISCUSIN En relacin a la demanda y oferta, se calcularon estos utilizando el rendimiento terico Yx/s = 0,49 gcl/gglucosa (Tabla N 4), obtenindose as una mayor oferta que demanda, es por esto se descarta la falta de suministro de fuente de carbono como causa de la disminucin del crecimiento luego de la alimentacin.

Ln X

Como puede observarse en la tabla N 4 los valores utilizados en la experiencia son mucho mayores que los con el rendimiento recalculado, por lo que la fuente de carbono en ningn momento actu como sustrato limitante para ninguno de las experiencias. Este parmetro puede resultar responsable de no obtener una curva clsica de biomasa para un cultivo por lote alimentado.

En relacin a una inhibicin por sustrato presente en el medio, luego de comenzar la alimentacin, se observa (Figura N 1) una disminucin de la concentracin celular. Ya que en este tipo de fermentacin, no hay salida en el sistema hay un aumento constante del volumen, y al haber una inhibicin del cultivo (no hay generacin de biomasa), el medio se diluyen dando como resultado en las mediciones de biomasa una disminucin de esta. (5) CONCLUSIONES No se logr alcanzar el crecimiento celular deseado, ya que se observ inhibicin del crecimiento por sustrato. El sistema de cultivo por lote alimentado, fue correctamente implementado y operado, controlando distintos parmetros como: flujo de alimentacin, aireacin, pH, agitacin, entre otros. Eliminando as problemas de control en el resultado del cultivo. NOMENCLATURA

(2) Melchy O., Ortega C., Martinez A. (2001) Cultivo por lote alimentado de S. cerevisiae a alta concentracin celular. IPN Sn pedro Zacatenco. Mexico. (3) J.E. Bailey and D.F. Ollis.Mc. (1986) Biochemical Engineering Fundamentals. Graw-Hill Book Company. (4) Osorio,C. Barrientos, C. Diaz, I. Salazar, J. Saludes, M. 2010 Medicin y calibracin de variables y equipos. Preparacin, esterilizacin e inoculacin en medio lquido definido. (5) Acevedo, F. Gentina, J. Illanes A. (2008). Fundamentos de Ingeniera Bioqumica. 2 edicin. Universitarias de Valparaso.

PA: PM:

Peso atmico (u) Peso molecular (g/mol)

%NUT: Porcentaje de nutrientes en la composicin del medio %CEL: Porcentaje contenido en la clula para la composicin del medio. Yx/s: sustrato So: Rendimiento de biomasa sobre

Sustrato inicial (g/L)

DNS: cido 3,5 dinitrosaliclico

REFERENCIAS (1) Madigan M., Martinko J., Parker J. (2003). Biologa de los Microorganismos. 10 Ed. Southern Illinois University Carbondale.