1.

JUSTIFICACIÓN
La insulina es una hormona producida naturalmente por el páncreas.
Relacionada con la diabetes, una enfermedad que afecta a un amplio porcentaje
de la población.
La estructura y composición de la insulina fue estudiada durante años, siendo la
primer proteína sintetizada in vitro, sin embargo, su rendimiento fue bastante
pobre, y se estimó que para el año 2000 se requerirían entre 81 y 100 kg de la
hormona (Beatriz Flores, 2019). Por lo que llegamos a la insulina recombinante,
síntesis que se lleva a cabo a partir de la ingeniería genética.
Mundialmente se estima que para el 2030, aproximadamente 500 millones de
personas necesitarán insulina para el tratamiento de diabetes tipo 1 y 2 (WHO,
2021), quiere decir que la industria biotecnológica necesita producir cantidades
enormes de insulina para satisfacer la demanda del consumidor con este
padecimiento (Kaki, et al. 2022).
Actualmente la insulina se produce predominantemente en E. coli debido a que su
metabolismo es simple y no tiene requerimientos nutricionales. La producción va
dirigida específicamente a la molécula BL-21 (DE3), por su alta densidad celular y
reducción significativamente de costos de incubación. Actualmente la alta
demanda en pacientes que padecen de diabetes tipo 1 o 2 exige requerimiento de
insulina en grandes cantidades, por lo que se busca obtener una planta con una
producción de 80 g/L de materia prima, (E. coli BL21 (DE3) con una pureza del
98%. La producción requiere de una alimentación de 20 L de medio de cultivo en
una fermentación discontinua (batch), obteniendo 4 g/L de masa celular seca a
partir de una biomasa inicial de 7 g. (Baeshen et al, 2014).
El microorganismo E. coli cepa BL 21 (DE3) fue anticipadamente transformada por
metodologías de ADN recombinante (ingeniería genética). Esto por medio de la
región codificante del péptido precursor de la insulina (UnitProtKB-p01308), que
fue amplificado con oligonucleótidos que contenían secuencias de reconocimiento
de NdeI y BamHI y posteriormente estas secuencias ya amplificadas fueron
ligadas con el vector de expresión pET-9a (que contiene una región de resistencia
a kanamicina como marcador), que anteriormente fue digerido con dichas enzimas
de restricción, seguido de esto el plásmido se cultiva con la cepa mencionada para
la obtención de las transformantes.
La producción de esta proteína puede ser considera baja a comparación de
producciones de otras proteínas recombinantes, sin embargo, el mercado mundial
de insulina recombinante humana fue valorado en 40,400 millones de USD en
2021, y se espera que el mercado alcance los 63.500 millones de USD para el año
2027, pues el precio por vial de insulina (un vial son 500 unidades de insulina
equivalentes a 17.5 mg de insulina) varía entre 78 y 133 USD, un vial Con una
CAGR del 7.83% durante 2021-2027 (Globe Newsire 2022).
 2. PRODUCCIÓN DE INSULINA RECOMBINANTE
La producción del péptido insulina es a partir de la cepa Escherichia coli BL-21
como materia prima, generando una producción 80 g/L*batch, que corresponde
g g
a una producción de 7300 lo que lleva a 11 de insulina
l∗año l∗batch
recombinante con una pureza del 98%. Las células recombinantes de E. coli se
cultivaron mediante un proceso de fermentación discontinua (batch) alimentada
en 20 L de medio de cultivo, obteniendo 4 g/l de masa celular seca a partir de
una biomasa inicial de 7 g y una final de 80 g.
3. COMPOSICIÓN DE LA MATERIA PRIMA
Se considero 20 L de medio de fermentación, del cual entra 1L de medio de
cultivo para el crecimiento de la bacteria.
Componentes del medio nutritivo g/L
Extracto de levadura 5
Proteína de soya 10
K2HPO4 6
KH2PO4 3
NaCl 5
Glucosa 5
Buffers
 Lavado y lisis
Componentes mM
TRIS 20
EDTA 1
 TE
componentes %
Triton X-100 1
Alcohol isopropílico 10
 Solubilizar
Componentes mM
Urea 8M
Cisteina HCL 20
EDTA 2
Tris 20
 Purificación
Componentes mM
Sulfato de sodio con 25% 150
acetonitrilo
Ácido cítrico 20
 Elución
Componentes mM
Tris 100

4. DIAGRAMA PRELIMINAR DEL BIORPOCESO

UN
Materia
prima
Aire

Fermentación Recuperación Homogeneización

Inoculo

Pulido Purificación Concentración

Secado Almacenamiento

4.1 DIAGRAMA DEL BIOPROCESO (ISO 10628:1977)

 5. REACCIONES DE FERMENTACIÓN Y TRANSFORMACIÓN
 Transformación bacteriana
70 μg g
Kanamicina( )+medio de cultivo(1 L)→ E . coli BL−21( 4.34 )
ml l
 Fermentación
Glucosa ( 4210 g ) +medio de cultivo ( 20 L ) +agua ( 10,200 g ) →biomasa ( 7.5 g ) + glucosa ( 842 g ) + H 2 O( 499

6. DESCRIPCIÓN DEL PROCESO Y CONDICIONES DE OPERACIÓN

DE LOS PRINCIPALES EQUIPOS
Para la producción de insulina recombinante posterior a la obtención del vector, se
consideran 7 etapas: fermentación, cosecha, concentración, purificación, pulido,
liofilización y almacenamiento. La fermentación considera el tratamiento del
inoculo en condiciones asépticas en un reactor discontinuo (batch) con capacidad
de 20L, obteniendo 4 g/l de masa celular seca a partir de una biomasa inicial de
7.5 g y una final de 80 g. Se adiciona un 1 L de medio de fermentación (5 g/L de
extracto de levadura, 10 g/L de proteína de soya, 6 g/L de K2HPO4, 3 g/L de
KH2PO4, 5 g/L de NaCl y 5 g/L de glucosa). Se considera una agitación de 20-24
horas, con un pH de 6.86, una corriente de viento de 0.5 vvm y una disolución de
oxígeno de 100-0%, manteniendo una presión de 0.2-0.3 bar. las células son
alimentadas con una elevada concentración de glucosa (99% rendimiento) para
mantener dichos parámetros, a su vez, está conectada con una bomba de ácido,
para que cuando el pH sobrepase el punto fijado, este sea controlado. Las
condiciones del downstream: La cosecha se lleva a cabo con varias
centrifugaciones, donde se remueven las células y otros sólidos. Dichas
condiciones son: • Centrifugación (1): 10,000 g por 45 minutos. Suspensión de
pellet en buffer de lavado (20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5) a 100 g/L. •
Centrifugación (2): 10,000 g a 4°C por 30 minutos. Re-suspensión en buffer de
lisis (20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5). Pasa a ser lisado en un homogeneizador
de alta presión. • Centrifugación (3): lisado centrifugado a 10,000 g a 8°C por 45
minutos para concentrar los cuerpos de inclusión (IBs). Lavado con TE buffer (1%
Triton X-100, 10% alcohol isopropílico) liberado a 50 g/L. • Centrifugación (4):
10,000 g a 8°C por 45 minutos.Solubilización en buffer (8 M Urea, 20 mM cisteína
HCl, 2 mM EDTA y 20 mM Tris pH 9.5) por 6 h a temperatura ambiente. La
concentración hace referencia a la incubación del LB pellet, manteniendo una
agitación a una temperatura de 2-8ºC durante 36 horas y un pH de 3.5 usando 2M
de ácido cítrico. Posteriormente pasa a una etapa de purificación donde se realiza
una filtración con poro de 1 µm. Seguido pasa a una cromatografía de intercambio
catiónico, con una columna pre equilibrada y un buffer de elución 100 mM Tris con
un pH de 9.5. El analito pasa a incubarse por 2 horas a temperatura ambiente con
una adición de anhídrido citracónico por goteo a la proinsulina replegada (2 g/g de
proteína). Se mantiene un pH de 8.5 por adición de NaOH 6 M y se añade
peróxido de hidrógeno 10 mM. Mas adelante se realiza una 2 incubación con
 agitación, a la cual se le adiciona carboxipeptidasa-B a concentración 1:2000
(peso/peso) y se deja la incubación por 6 h a temperatura ambiente. Finalmente
hay una tercera incubación donde el pH es ajustado a 2 por adición de HCl 0.1 M
por 6 horas a temperatura ambiente. Se realiza una segunda cromatografía de
intercambio catiónico, donde la solución es cargada en resina empaquetada SP-
sefarosa FF en una columna XK 50 concectada a purificador Akta. Se añade
elución por 150 mM sulfato de sodio que contiene 25% acetonitrilo y 20 mM ácido
cítrico a pH 3.5. Finalmente pasa a una cromatografía RP-HPLC donde las
fracciones son cargadas en columnas YMC DAC 50 mm (50 x 250 mm) empacada
con resina YMC-Triart C8 (tamaño de partícula 10 µm), la cromatografía es
ejecutada utilizando buffer 200 mM sulfato de sodio, pH 2.3 con combinación de
acetonitrilo. El buffer A contiene 10% acetonitrilo y el solvente B contiene 50%
acetonitrilo a un flujo de 75 cm/h. La proteína será eluida aplicando un gradiente
linear de 35.0%-38.0% B en 6 volúmenes de columna y monitoreadas a 280 nm.
La penúltima etapa es donde la muestra es pulida a partir de una precipitación con
1% de cloruro de zinc, y se realiza una centrifugación a 5000 g por 20 minutos. Se
realiza la liofilización a una presión de 20 pascales de vacío por 24 horas.
finalmente el almacenamiento se da en polvo a -30ºC .
7. BALANCES DE MASA PRELIMINARES
Conv Ferm 98% Biomasa final 80 g/L Rendimiento en fermentación 0.38 (g biomasa/g glucosa)
Volumen de
Batch 20 L En 20 L 1600 g Suponiendo que el 50% de la bacteria es proteina 50% % masa seca
Velocidad de LOS PORCENTAJES DE RENDIMIENTO ESTAN DEFINIDOS EN LA LITERATURA
Tiempo de batch 24 h crecimiento (miu) 0.1 h-1 RECOPILADA
Flujo 60 70 80 90 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113
g/L
Glucosa 210 4.2 4.2 4.2 4.2
Sales
(cofactores
enzimaticos) 280 276.4964101 276.49641 276.49641 276.49641
Agua 510 10.2 10.2 10.2 10.2
Biomasa 7.25 79.91802876 79.9180288 79.9180288 39.9590144
Insulina 39.9590144 39.160 38.38 30.70 27.63 19.34 8.70 8.53 6.82 6.48 5.19 5.08 4.32

Balance de masa teórico para el crecimiento

𝟏
𝟎. 𝟗𝟑𝑪𝟔 𝑯𝟏𝟐 𝑶𝟔 + 𝑵𝑯𝟑 + 𝟑. 𝟑𝟖 𝑶𝟐 + 𝟎. 𝟎𝟓 𝑲𝟐 𝑯𝑷𝑶𝟒 → 𝟐𝑪𝑯𝟏.𝟗𝟒 𝑶𝟎.𝟓𝟑 𝑵𝟎.𝟐𝟓 𝑷𝟎.𝟎𝟐𝟓 + 𝟒. 𝟑𝟐𝑯𝟐 𝑶 + 𝟑. 𝟓𝟖𝑪𝑶𝟐 + 𝟎. 𝟏𝑲𝑯𝟐
𝟐
BALANCE ESTEQUIOMETRICO:
5.58-C-5.58
12.7-H-12.8
12.54-O-12.54
 0.5-N-0.5
0.1-K-0.1
0.05-P-0.05
Relación sustrato-biomasa: 0.93 glucosa: 2 biomasa
Reactivos:

 Glucosa
180.156 g GLU
( 0.93 moles )=167.54 g GLu
1mol
 Amoniaco
17.031 g NH 3 1
1 mol 2( )
moles =8.51 g N H 3

 Oxigeno molecular
32 g O2
( 3.38 moles )=108.16 g O2
1 mol

 Fosfato dipotásico (sal del medio)

174.2 g K 2 HP O4
( 0.05 moles )=8.71 g K 2 HP O4
1 mol

Productos:
 Biomasa
26.32 g Biomasa
( 2 moles )=52.64 g biomasa
1 mol
 Agua
18.015 g H 2 O
( 4.32 moles ) =77.82 g H 2 O
1 mol
 CO2
44.01 g C O 2
(3.58 moles )=157.55 g C O2
1 mol
 KH2
174. g K H 2
( 0.1 moles )=17.42 g K H 2
1 mol

RENDIMIENTO DE BIOMASA

X 52.64 g
Y = =0.314=31.4 %
S 167.54 g
 Balance de masa teórico para la producción del metabolito
𝟕𝟗 𝑪𝟔 𝑯𝟏𝟐 𝑶𝟔 + 𝟏𝟓𝑶𝟐 + 𝟏𝟐𝑪𝟓 𝑯𝟏𝟏 𝑵𝑶𝟐 𝑺 + 𝟏𝟏𝟖𝑵𝑯𝟑 → 𝟐𝑪𝟐𝟓𝟕 𝑯𝟑𝟖𝟑 𝑵𝟔𝟓 𝑶𝟕𝟕 𝑺𝟔 + 𝟑𝟑𝟒𝑯𝟐 𝑶 + 𝟐𝟎𝑪𝑶𝟐

BALANCE ESTEQUIMETRICO

534-C-534
1434-H-1434
528-O-528
130-N-130
12-S-12
Relación sustrato-producto: 79 glucosa: 2 producto

Reactivos:
 Glucosa
180.156 g GLU
( 79 moles )=14,232.32 g Glu
1mol
 Metionina (sal del medio)
149.21 g C5 H 11 N O 2 S
( 12mol )=1,790.52 g metionina
1 mol
 Oxígeno molecular
32 g O2
( 15 moles )=480 g O2
1 mol
 Amoniaco
17.031 g N H 3
( 118 moles )=2,009.65 g N H 3
1 mol

Productos:
 Insulina recombinante
5807.62 g insulina
( 2moles )=11,615.24 g insulina
1 mol
 Agua
18.015 g H 2 O
( 334 moles )=6015.01 g H 2 O
1 mol
 CO2
44.01 g C O 2
( 20 moles )=880 g C O2
1 mol
RENDIMIENTO DE PRODUCTO
P 11,615.24 g
Y = =0.816=81.61 %
S 14,232.32 g
 8. ANÁLISIS ECONÓMICO
De acuerdo con el tamaño de planta en base a la producción de 80g/l.batch de
usd
biomasa (E. coli BL-21) que se compra a un precio de 14 (Sigma Aldrich,
ml
g
2022) y una producción de 11 de insulina recombinante con un precio de
l∗batch
USD
7.6 (Judith A. Johnson. 2018), el margen bruto es de 121,200 millones USD,
mg
por lo tanto, se puede considerar un proceso rentable, sin embargo, calculando el
costo de la planta y total de producción para evaluar la viabilidad económica.
ingresos=¿

( )( )( )( )
8 8
usd 1000 ml 1L 2.31 x 10 usd kg 2.73 x 10 Kg
costo materia prima=14 7.3 =
ml l 6.060∗10
−5
Kg año año

9. SIMULADOR SUPERPRO

10. UBICACIÓN Y RIESGOS DE LA PLANTA

1. Aplicación de los conceptos ubicación y riesgo de planta
1.1) Ubicación
la localización de planta es un factor que condiciona el resultado de la
implantación de un sistema productivo, ya que a partir de él se evaluaran
los costos de operación y de inversión, la facilidad de recibir materias
primas y los productos terminados, los costos de mantenimiento, mano de
obra, impuestos, terrenos, construcción y combustible. Para ello se toman
en cuenta los siguientes criterios:
  Medios y costos de transporte: el peso de materia prima para su
transporte no es alto, debido a que son líneas celulares donde su
peso es de aproximadamente 1 x 1013 bacterias viables/mL, mientras
que el cultivo en liquido tiene un límite de densidad teórica de 200 g
de peso de células secas (Rosano, G. L., & Ceccarelli, E. A. 2014)
 Disponibilidad y costo de mano de obra: el salario industrial
farmacéutico promedio en México es de $132,000 al año o 67.69
pesos la hora (Talent.2022), nuestra empresa busca trabajar un total
de 24 horas, 3 turnos de 8 horas, con aproximadamente 8
trabajadores en total.
 Localización y disponibilidad de las fuentes de abastecimientos de la
materia prima: nuestra materia prima (E. coli BL21), vectores y
plásmidos serán obtenidos de los laboratorios Thermofisher por
distribución a domicilio, dicha empresa cuenta con opción de sobre
pedido y con una amplia variedad de cepas a un precio razonable.
Es por ello, que buscamos instalarnos en Colón Industrial, 44930
Guadalajara, Jal. Esta ubicación nos permitirá estar cerca de la
empresa de obtención de materia prima y de empresas
farmacéuticas con productos totalmente diferentes como lo es Pisa,
teniendo la opción de crear convenios.
 Cercanía del mercado: el sector de mercado es para personas con
problemas de diabetes tipo 1 y 2, sin embargo, no se vendería sin
receta, por lo que buscamos farmacias con posibilidad de servicio a
domicilio y veta en local, así como servicios médicos con posibilidad
de venta de medicamentos controlados.
1.2) Riesgos de planta:
Se manejan diferentes tipos de riesgo dentro de la empresa:
 Riesgos de materiales peligrosos
Dentro de la producción se utilizan sustancias corrosivas, algunas toxicas a
grandes concentraciones, así como manejo de residuos biológicos (E. coli
BL21) clasificada como riesgo biológico 2, es decir, la cepa puede causar
enfermedades en los trabajadores y construir un peligro para ellos al tener
un manejo erróneo.
 Riesgos en proceso:
presiones y temperaturas altas por falta de válvulas o monitoreo, fuego y
explosiones, contaminaciones en producto, en cultivo, formulación de
inoculo y errores de medición de fluidos. Peligros que pueden llevarse a
cabo por falta de reglamentos, falta de supervisión o errores en sistemas.

2. Aplicación de los conceptos diseño de cuartos limpios

2.1) Tipo de cuarto limpio
El tipo de modelo de cuarto limpio a utilizar es una combinación entre un panel
rígido, instalado in situ donde se realizarán los cultivos de E. coli BL21 con su
correspondiente vector de expresión y revisión de resultados, en esta área con
flujo de aire limpio y presión, además de contar dentro de la misma con campanas
de flujo laminar con luz UV para el cultivo, construcción y transformación de las
cepas bacterianas, además de contar con mecheros para asegurar un ambiente
aséptico, también se realizará limpieza con alcohol etílico de 90%, esto
únicamente para el cuarto de cultivo, ya que se necesita un control extremo de las
cepas, no necesariamente porque sean patógenas para el ser humano (sin
embargo esta cepa no cuenta con genes dañinos), si no, porque puede ser
contaminado por alguna espora o bacteria oportunista. Para el cuarto de
fermentación se utilizarán paneles flexibles, ya que el tamaño de planta para la
producción de insulina no es grande, tiene un tamaño moderado y sin maquinaria
voluminosa, ya que en estos procesos no se genera mucho producto dado a la
naturaleza de su proceso, sin embargo, las dosis son costosas, por tanto,
representa una opción viable para planta biotecnológica. Igualmente, los
empleados deberán ingresas con sus respectivos uniformes para estas áreas y
para el ingreso a estas, tendrán su respectivo cuarto para cambio de uniformes
respecto a las zonas de ingreso.
2.2) Modelo de diseño de planta
El modelo de diseño de planta utilizado en este proceso es tren lineal, ya que el
proceso comienza con el cultivo de las células bacterianas, y progresa hasta su
downstream, secado y empaquetado, se considera este mismo también, ya que la
planta planeada solo maneja un producto, y es la misma línea de procesos y tiene
un tamaño reducido por los equipos empleados.
3. Reflexión
En las plantas biotecnológicas debemos ser conscientes de los ya seamos jefes,
empleados (ya sea de operación o intendentes). Porque se manejan
principalmente diversos tipos de microorganismos, químicos, vectores y
tecnologías de ADN recombinante que de no ser utilizadas de forma correcta
podrían afectar al ser humano y crear problemas biológicos mayores dentro y
fuera de la planta. Siempre debemos tener presente que las reglas deben seguirse
al pie de la letra, es por esto por lo que existen, aunque, claro que la tecnología va
avanzando y con ellas se actualizan las normas e ISO necesarias para las
operaciones. En México, lamentablemente, la biotecnología es desconocida y
poco sabe la sociedad de que hemos salvado a miles de personas gracias a esto,
a través incluso del ganado. Como egresados debemos tener en mente que el
avance no está peleado con la tecnología ni con la naturaleza, debemos hallar un
equilibrio en el que podamos caminar juntos hacía un mejor futuro, donde la
biotecnología y la medicina personalizada sean de las cúspides más importantes
de la salud.
1. REFERENCIAS
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