Tratamiento

 de  sueros  lácteos  mediante    

un  biorreactor  con  β-­‐galactosidasa    
inmovilizada.  

María García Atencia.

Asignatura: Ingeniería Bioquímica.
Facultad de Ciencias, UMA.
Índice

Resumen ……………………………………………………………........3

Objetivo…………………………………………………………………..4

Antecedentes ……………………………………………………………4-5

Materiales y métodos …………………………………………………...5-7

Resultados y discusiones ……………………………………………….8-32

Conclusión………………………………………………………………33

Referencias …………………………………………………………….36

Ingeniería  Bioquímica   Página  2  

 
Resumen

En este guión se han llevado a cabo una serie de experimentos en torno a la enzima β-
galactosidasa que nos han permitido conocer los mejores parámetros de operación en la
hidrólisis de lactosa de esta enzima.

Primero estudiamos cómo le afecta el pH y la temperatura, encontrándose que el pH

óptimo posee un valor de 4, aunque se puede decir que trabaja bien en un rango de 3 a 6
pH. Respecto a la temperatura podemos decir que la más adecuada es 40ºC, ya que
posee la mayor vida media de los tres experimentos llevados a cabo, siendo de 277
minutos.

Luego determinamos las constantes cinéticas de nuestra enzima usando como sustrato
dos componentes, ONPG y lactosa. Se midieron valores de Vm, Km, Ki, Kcat y
especificidad (Kcat/Km), resultando que la lactosa era el sustrato que mejores
conversiones proporcionaba, siendo mayor su especificidad. Los resultados de las
constantes fueron:

• ONPG sin inhibidor

Vm= 8,41 U/mg Km= 2,3 mM

Kcat = 22,08 𝑚𝑖𝑛!! Kcat/Km= 9,596 𝑚𝑖𝑛!! 𝑚𝑀!!

• ONPG con inhibidor Vm = 8,9 Km = 12,8 Ki = 6,6

Vm= 8,91 U/mg Km= 12,81 mM Ki= 6,57 mM

Kcat = 23,39 𝑚𝑖𝑛!! Kcat/Km= 1,83 𝑚𝑖𝑛!! 𝑚𝑀!!

• Lactosa Vm = 1,12 Km = 2,89 Ki = 3,6

Vm= 0,374 U/mg Km= 2,89 mM Ki= 3,59 mM

Kcat = 39,23 𝑚𝑖𝑛!! Kcat/Km= 13,57 𝑚𝑖𝑛!! 𝑚𝑀!!

A continuación, gracias a la ayuda de amberlita inmovilizamos la enzima β-

galactosidasa obteniéndose un alto porcentaje de enzima inmovilizada, concretamente
de un 84,42%. Una vez inmovilizada la enzima llevaríamos a cabo la reacción de
hidrólisis de lactosa en una columna, haciendo pasar distintos caudales de suero
lactosado a distintas concentraciones iniciales de lactosa. Así es como creamos un
biorreactor a escala laboratorio, en el que los resultados obtenidos de conversión a
glucosa fueron de un 99% para el procedimiento experimental y de un 84% para la
simulación de un biorreactor con el software Berkeley-Madonna, con caudal de 2,96
mL/min y concentración inicial de lactosa de 5mM.

Ingeniería  Bioquímica   Página  3  

 
Objetivo
Proporcionar las condiciones óptimas de trabajo de la enzima β-galactosidasa,
proveniente del hongo Aspergillus Oryzae, para la hidrólisis de lactosa en un
biorreactor, inmovilizando previamente la enzima en Amberlita IRC-50.

Antecedentes
La lactosa es el disacárido cuyo metabolismo ha sido más extensamente estudiado en
bacterias lácticas, debido a la gran importancia económica de las fermentaciones lácteas
que hacen posible la producción de quesos y yogures.

La lactosa está formada por la unión, mediante un enlace O-glucosídico, de glucosa y

galactosa. Estos monosacáridos son fácilmente absorbidos en el intestino, mientras que
la molécula de lactosa no. Gran parte de la población tiene problemas para hidrolizar
esta molécula, debido a la insuficiencia de la enzima que produce esta hidrólisis, a la
que llamamos β-galactosidasa, o comúnmente conocida como lactasa. Esto es lo que se
conoce como intolerancia a la lactosa. [1]

Fig.1 Hidrólisis de lactosa (izquierda) en sus dos

componentes, galactosa (1) y glucosa (2). Reacción catalizada por la enzima lactasa.

Otra apreciación de la lactosa es que no es muy buen edulcorante. Sin embargo si se

hidroliza se consigue un poder edulcorante combinado de aproximadamente un 80% del
que posee la sacarosa (edulcorante nutritivo más representativo). [2]

Adentrándonos en problemas de contaminación nos encontramos con que en la

producción de quesos, caseínas, caseinatos y mantequilla se obtiene entre un 80% y
90% de subproducto, en este caso, es lactosuero. Se suele optar por desecharlo como
efluente a ríos y lagos, produciendo graves consecuencias en el medio ambiente debido
a la gran demanda bioquímica de oxígeno de este suero. Esto se traduce en que los
microorganismos que degradan el suero consumen ingentes cantidades de oxígeno,
haciendo que la fauna de los ríos y lagos muera y se produzcan malos olores y

Ingeniería  Bioquímica   Página  4  

 
putrefacciones. Si el suero es vertido al suelo, puede llegar a acuíferos a través de
filtraciones, implicando la salud de animales y humanos. [3]

En el año 2012 en España se produjeron 173.000 toneladas entre mantequillas y quesos.

Esto supone una enorme cantidad de suero como subproducto que se debería
aprovechar, aunque la mayor parte se desecha.[4] Este lactosuero contiene
aproximadamente el 50% de los nutrientes de la leche original: proteínas, lactosa,
vitaminas y sales minerales. Por lo que se investiga posibles aplicaciones de este
subproducto en la misma industria alimenticia, como en la elaboración de productos
cárnicos (carnes procesadas, embutidos), panificados, y bebidas para deportistas entre
otros productos.[5] Esta última opción ha sido investigada por una universidad de
colombia, en cuya investigación aprovechan la glucosa de la lactosa del suero como
edulcorante para la bebida isotónica, glucosa que hidrolizan con lactasa.[6]

Profundizando en lo que se refiere a la lactasa, podemos decir que puede obtenerse de

diferentes fuentes, pero que su producción a nivel industrial para procesos alimenticios,
debe realizarse a través de cultivos de microorganismos considerados seguros
internacionalmente. Estos microorganismos pueden ser las levaduras Kluyveromyces
fragilis y lactis o los hongos Aspergillus niger y oryzae. [7]

Hablando de procesos industriales, lo que prioriza en ellos es “el hacer bien con el
menor coste posible’’, de ahí que se hayan estudiado técnicas de reutilización de
biocatalizadores y de utilización continua de ellos. Una de estas técnicas que todavía se
estudia para conseguirlo es la inmovilización de la enzima catalizadora. Estas técnicas
siguen luchando contra la reducción de actividad, así como limitación difusional que
puede proporcionar los soportes sobre los que se inmoviliza la enzima. Estos soportes
pueden ser orgánicos o inorgánicos. [8]

Recopilando un poco tenemos que tanto la intolerancia a la lactosa, la reutilización

como edulcorante y la elaboración de quesos y productos lácteos, como el
aprovechamiento del subproducto que deja dicha elaboración, hace que sea muy
importante el estudio de la hidrólisis de la lactosa. En este manuscrito nos centraremos
en que esta hidrólisis sea llevada a cabo en un biorreactor por la enzima β-galactosidasa
proveniente del hongo Aspergillus Oryzae y veremos qué condiciones (pH, temperatura,
influencia de distintos sustratos) son las idóneas para la descomposición en glucosa y
galactosa. Además inmovilizaremos la enzima en una resina orgánica de intercambio
iónico, Amberlita IRC-50.

Ingeniería  Bioquímica   Página  5  

 
Materiales y métodos.
Materiales

Empleamos β-galactosidasa 100 μg/mL, junto con o-nitrofenil β-D-Galactopiranósido

4mM, también llamado ONPG y ONP 2mM. También trabajamos con tampón fosfato-
citrato 40mM, pH 4.5, tampón borato 200mM, pH 9.8, amberlita IRC-50, glucosa
0,2mM, además de agua destilada. Nos ayudamos de una mezcla enzimática que
contiene un exceso de las enzimas glucosa oxidasa y peroxidasa junto con el sustrato de
la peroxidasa, en tampón fosfato-tris pH 7.3.

Para la utilización de todos estos componentes nos servimos de un amplio material de

laboratorio como pipetas, tubos eppendorf, tubos de ensayo, cronómetros, etc.

Métodos

Ensayo estándar de actividad β-galactosidasa.

Se realizó una medida de la actividad de esta enzima para lo que se llevó a cabo el
siguiente procedimiento:

Se realizó una mezcla de cuatro componentes: 200μL de tampón fosfato-citrato 40mM

con un pH de 4.5, 500  μL de ONPG 4mM, 100  μL de β-galactosidasa 100  μg/mL y
hasta que se consigan 1000  μL se rellena con agua destilada.

Se utilizaron 10 tubos de ensayo de 10 mL. Es importante añadir la enzima cuando

hayamos añadido los demás componentes, ya que la enzima es la que da comienzo a la
reacción. Se agitó por inversión y se puso el cronómetro dejando incubar 10 min. Para
parar la reacción se echó 3mL de tampón borato 200mM, pH 9.8.

Tras esto me midió la absorbancia a 410nm frente al blanco.

Protocolo de medida de glucosa mediante el método de glucosa oxidasa-peroxidasa.

Es un método basado en la oxidación de la glucosa mediante dos simples reacciones:

Glucosa + 𝑂! Ácido glucónico + 𝐻! 𝑂! Por glucosa oxidasa

ABTSred + 𝐻! 𝑂! ABTSoxid + 2𝐻! 𝑂! Por peroxidasa

Este peróxido de hidrógeno junto con el sustrato de la peroxidasa, y la enzima

peroxidasa, produce un compuesto coloreado por la oxidación de la glucosa.
Preparamos una recta patrón para la que tomamos 0.4 mL de muestra y les añadimos
1mL de mezcla enzimática, que contienen un exceso de enzimas glucosas oxidasa y
peroxidasa junto con el sustrato de la peroxidasa (ABTS), en tampón fosfato, pH 4.
Dejamos incubar 30 minutos a temperatura ambiente y medimos su absorbancia a
740nm.

Ingeniería  Bioquímica   Página  6  

 
Protocolo de preactivación de la Amberlita.

Lo llevó a cabo nuestro técnico de laboratorio pero explicaremos cómo se lleva a cabo:

Pesamos 12 gramos de Amberlita en un tubo de ensayo de rosca, lavamos dos veces con
agua destilada, añadimos 20 mL de polietilamina 100mg/mL y dejamos en agitación
durante dos horas. Luego lavamos de nuevo con agua y añadimos otros 30 mL pero esta
vez de glutaraldehido al 2.5% y dejamos 30 min agitándose . Por último lavamos con
tampón fosfato 50mM, pH 7.

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Resultados y discusiones.
Práctica 1. Efecto del pH y la temperatura.

1.1 Efecto del pH sobre la actividad β-galactosidasa de Aspergillus oryzae.

Para determinar la actividad de la enzima a diferentes pH se siguió el ensayo estándar

de actividad de β-galactosidasa, mencionado en el apartado Métodos.

Se utilizaron tampones fosfato-citrato a diferentes pH, concretamente fueron pH 3, 4 ,5,

6, 7, 8, 9 y 10, utilizando un blanco común a pH 7.

Ayudándonos de la ley de Lambert-Beer, que es una ecuación empírica que relaciona

linealmente la absorción de la luz de una sustancia con la concentración de la misma,
podemos calcular la concentración, en este caso, de ONP. La ley dice que:

𝐴=є∙𝑑∙𝐶

Donde C es concentración de ONP, A es absorbancia, є es el coeficiente de extinción

molar del ONP, que a 410nm posee un valor de 4600 𝑀!! 𝑐𝑚!! . Por último d es la
longitud que atraviesa la luz, que en la mayoría de los casos suele estar normalizada a
1cm.

Para pasar de concentraciones a actividades, basta con multiplicar las concentraciones

por el volumen que corresponde a la medida de absorbancia y dividir entre el tiempo de
reacción y la masa de la enzima. De esta manera se obtienen las unidades propias de la
actividad enzimática, U/mg. Donde U = μmol / min.

La masa de la enzima sería 0,01 mg

El volumen sería 4 mL y el tiempo de reacción 10 min.

Ingeniería  Bioquímica   Página  8  

 
Enfrentando la actividad de β-galactosidasa frente a pH obtenemos un gráfico donde
podemos analizar qué pH es más adecuado para trabajar con nuestra enzima.

Efecto  pH  
5  

4  
ac#vidad  (U/mg)  

3  

2  

1  

0  
0   2   4   6   8   10   12  
pH  

Fig.1 Efecto de pH sobre la enzima β-galactosidasa.

Como podemos ver, el pH más o menos adecuado para trabajar con la enzima en
cuestión se encuentra en el rango de 3 a 6 de pH, siendo 4 el valor de pH óptimo.
Mientras más aumentamos la basicidad a partir de pH 6 la enzima cada vez tiene menor
actividad, es decir, se va desnaturalizando y haciéndose inservible, por lo que
descartamos estos pH como pH de trabajo para hidrolizar la lactosa.

1.2 Medida de la estabilidad térmica de la enzima.

Para analizar cómo le afecta la temperatura a nuestra enzima, preparamos 4 tubos

eppendorf, tres de los cuales se repartieron en baños a distintas temperaturas, de 40, 60
y 70º, cada uno con 1 mL de una disolución de β-galactosidasa a 100μg/mL. Estas
muestras fueron incubadas 5, 10, 20, 40 y 60 min, extrayéndose 120μL en cada tiempo.
El último eppendorf se reservó para tomar una medida de la enzima sin preincubar.

Para medir la actividad enzimática se ha seguido el mismo procedimiento que para el

efecto del pH, siendo los datos de masa, volumen y tiempo iguales también y
obteniéndose la siguiente gráfica.

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Representamos actividad de β-galactosidasa frente al tiempo de incubación a las
distintas temperaturas a las que hemos realizado el experimento:

Efecto  de  la  temperatura  

4  
3,5  
ac#vidad  (U/mg)  

3  
2,5  
2   40ºC  
1,5   60ºC  
1  
70ºC  
0,5  
0  
0   10   20   30   40   50   60   70  
Tiempo  (min)  

Fig.2 Efecto de la temperatura con el tiempo de incubación, sobre la enzima β-

galactosidasa, a temperatura de 40, 60 y 70º..

Podemos observar que a 70ºC la enzima se desnaturaliza rápidamente, mientras que

60ºC la actividad se mantiene en un valor más alto conforme pasa el tiempo. De las tres
temperaturas a las que sometimos la enzima vemos que la más óptima es 40ºC ya que
posee una actividad bastante alta respecto de sus compañeras.

Para confirmar nuestro análisis del gráfico es mejor proporcionar el tiempo de vida
media de la enzima a cada temperatura. Para ello nos valemos de la ecuación de cinética
de desactivación de primer orden:

𝑣 = 𝑣𝑜 ∙ 𝑒 !!! ∙!

Linealizamos,

𝐿𝑛 𝑣 = 𝐿𝑛 𝑣𝑜 − 𝑘! ∙ 𝑡

Donde si representamos Ln(v), o lo que es lo mismo Ln(actividad enzimática), frente a

tiempo, queda que 𝐾!   es igual a menos la pendiente de la recta.

Ingeniería  Bioquímica   Página  10  

 
Una vez calculado el valor de Kd, gracias a la siguiente ecuación averiguamos el tiempo
de vida media de la enzima según la temperatura:

ln  (2)
𝑡!/! =
𝐾!

Kd (𝒎𝒊𝒏!𝟏 ) 𝒕𝟏/𝟐 (min)

40ºC 0,0025   277,258872  
60ºC 0,0199   34,8315166  
70ºC 0,0792   8,75185834  
Tabla 1. Tiempo de vida media de la enzima β-galactosidasa a diferentes temperaturas,
junto con el dato de la constante Kd.

Se corrobora pues que 40º es la temperatura óptima de trabajo de esta enzima, ya que el
tiempo que transcurre hasta que empieza a desnaturalizarse, 277 min, es muy alto en
comparación con las otras temperaturas.

Ingeniería  Bioquímica   Página  11  

 
Práctica 2. Determinación de las constantes cinéticas con ONPG como sustrato.

Para determinar las constantes cinéticas teniendo ONPG como sustrato medimos la
actividad de nuestra enzima a diferentes concentraciones finales de ONPG. Las
concentraciones que usamos fueron 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 1, 5, 10 y 20 mM. Este
experimento fue repetido dos veces, una en presencia de inhibidor y otra en ausencia de
este. Como inhibidor se usó galactosa 30 mM.

Para la medida de la actividad enzimática se utilizó el mismo procedimiento que para el

efecto del pH, es decir, se hizo uso del ensayo estándar β-galactosidasa (dicho ensayo se
detalla en el apartado Métodos), la ley de Lambert-Beer para calcular la concentración
de ONP y la conversión de unidades de μmol/mL a U/mg. Los datos de masa, volumen
y tiempo de reacción siguen siendo los mismos que antes para este experimento.

Una vez hecho todo lo anterior representamos actividad de la enzima frente a la

concentración de ONPG y obtenemos el siguiente gráfico:

8  
7  
6  
ac#vidad  (U/mg)  

5  
4  
Con  inhibidor  
3  
Sin  inhibidor  
2  
1  
0  
0   5   10   15   20   25  
[ONPG]  (mM)  

Fig.3 Variación de la actividad enzimática con la concentración de ONPG, tanto en

presencia de inhibidor, como sin ella.

Se puede observar que la actividad es considerablemente mayor sin presencia de

inhibidor que con este. Y que a medida que elevamos la cantidad de ONPG,
aumentamos la actividad enzimática, lo cual siempre es favorable.

Pasamos a calcular las constantes cinéticas utilizando una regresión no lineal.

Ajustaremos la nube de puntos a la ecuación cinética de Michaelis-Menten, gracias al
programa Mystat. Esta ecuación cinética es la siguiente:

𝑉!"# ∙ [𝑆]
𝑉=
𝐾! ∙ [𝑆]

Ingeniería  Bioquímica   Página  12  

 
Siendo V la actividad enzimática y [S] la concentración de ONPG.

Se obtuvieron los siguientes resultados:

Sin inhibidor:

Parameter
Estimates
Parameter Estimate

Vm (U/mg) 8,412
Km (mM) 2,301

Fig. 4 Variación de la actividad enzimática frente a la concentración de ONPG, sin

presencia de inhibidor.

Con inhibidor:

Parameter
Estimates
Parameter Estimate

Vm (U/mg) 8,910
Km (mM) 12,806

Fig. 5 Variación de la actividad enzimática respecto de la concentración de ONPG, en

presencia de inhibidor.

Ingeniería  Bioquímica   Página  13  

 
Como Vm sin inhibidor y Vm con inhibidor tiene un valor relativamente parecido y en
cambio, Km varía considerablemente, podemos suponer que se trata de un cinética de
inhibición competitiva. A partir de ahora utilizaremos ecuaciones apropiadas a esta
cinética.

Al tener un inhibidor, debemos calcular la constante de inhibición, para calcularla nos

ayudamos despejando de la siguiente expresión:

[𝐼]
𝛼 =1+
𝐾!

Donde [I] es la concentración de inhibidor (galactosa), [I]=30mM.

La constante 𝛼 se calcula despejando de:

𝐾!(!"!#$%&$) = 𝛼 ∙ 𝐾!

Donde 𝐾!(!"!#$%&$) se corresponde con el valor de la constante 𝐾! con inhibición y 𝐾!

al valor de la constante sin inhibición. De esta manera se obtiene que Ki = 6,57mM.

Puede ser de interés obtener el valor de la constante Kcat, ya que el cociente de esta y
Km nos da el valor de la constante de especificidad. Esta constante nos indica la
eficiencia de nuestra enzima. A mayor valor de Kcat/Km, mayor será la eficiencia de la
enzima, lo cual es conveniente conocer.

El valor de Kcat viene determinado por la siguiente ecuación.

𝑉!"#
𝐾!"# =
[𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎]

Sabiendo que el peso molecular de la enzima es de 105.000 μg/mol y que se encontraba

con una concentración de 100 μg/ml, podemos conocer la concentración de enzima en
μmol/mL.

[enzima ]= 100/105.000 = 9,53∙ 10!!  μmol/mL

Como tenemos dos valores de Vmax, uno para la inhibición y otro para la ausencia de
esta, tendremos dos valores de Kcat.

Con presencia de inhibidor,

Como tenemos [enzima] en μmol/mL, Vmax debemos tenerlo en μmol/mL·min. Nos

valemos de los datos de masa de enzima y volumen para la conversión.

Vmax = (8,91 · 0,01)/ 4 = 0,0223 μmol/mL·min

Teniendo Vmax en las unidades adecuadas, Kcat sería:

Kcat = 0,0223 / 9,53∙ 10!! = 23,39 𝑚𝑖𝑛!!

Ingeniería  Bioquímica   Página  14  

 
Kcat / Km = 23,39 / 12,81 = 1,83 𝑚𝑖𝑛!! ∙ 𝑚𝑀!!

En ausencia de inhibidor,

Vmax = (8,412 · 0,01)/ 4 = 0,021 μmol/mL·min

Kcat = 0,021 / 9,53∙ 10!! = 22,08 𝑚𝑖𝑛!!

Kcat / Km = 22,08 / 2,301 = 9,596 𝑚𝑖𝑛!! ∙ 𝑚𝑀!!

Recogiendo resultados en un tabla quedaría:

Vmax Km Ki Kcat Kcat/Km

(U/mg) (mM) (mM) (𝒎𝒊𝒏 ) (𝒎𝒊𝒏!𝟏 ∙ 𝒎𝑴!𝟏 )
!𝟏

Sin inhibidor 8,412 2,301 22,08 9,596

Con inhibidor 8,91 12,806 6,57 23,39 1,83
Tabla 2. Constantes cinéticas en presencia y en ausencia de inhibidor (galactosa).

El valor de especificidad nos confirma lo ya visto en el gráfico anteriormente. Al ser

mayor la constante de especificidad en el caso sin inhibición podemos concluir que la
enzima es más eficiente en ausencia de inhibidor.

Ingeniería  Bioquímica   Página  15  

 
Práctica 3. Determinación de las constantes cinéticas con lactosa como sustrato.

El objetivo de este experimento es, al igual que en el experimento anterior, determinar

las constantes cinéticas de la enzima β-galactosidasa, aunque en este caso empleando
lactosa como sustrato. Para ello se dispuso de 4 tubos de ensayo, en los que hubo 2,8
mL de disolución de lactosa a distintas concentraciones (concretamente 100, 70, 40 y 20
mM).

La reacción se activó al añadir la enzima, tras lo cual se tomaron muestras de 200 μL a

los 5, 10, 20, 40 y 60 min. Estas muestras fueron sumergidas en un baño a 70ºC para
parar la reacción y poder medir la conversión de glucosa. Para medir la conversión
alcanzada se siguieron los pasos especificados en el protocolo de medida de glucosa
mediante el método de glucosa oxidasa-peroxidasa, el cual se recoge en el apartado
Métodos.

Una vez seguidos los pasos de este protocolo pasamos a representar la absorbancia de la
muestra frente a concentración de glucosa, obteniendo así nuestra recta patrón:

Recta  patrón  
2  
1,8   abs  =  8,7688*C  +  0,0402  
1,6   R²  =  0,9996  
1,4  
absorbancia  

1,2  
1  
0,8  
0,6  
0,4  
0,2  
0  
0   0,05   0,1   0,15   0,2   0,25  
Concentración  final  de  glucosa  (mM)  

Fig.6 Recta patrón.

De la ecuación de esta recta podemos calcular el valor de concentración a distintas

absorbancias. Esta concentración se encuentra diluida, por lo que se multiplica por su
dilución. De esta manera se puede hallar la conversión de glucosa alcanzada.

Ingeniería  Bioquímica   Página  16  

 
Todo ello para las cuatro concentraciones distintas de lactosa, 100, 70, 40, 20. Nos
queda la siguiente tabla de conversiones (siendo X la conversión):

100mM 70mM 40mM 20mM

Tiempo X X X X
(min)
5 0,05119367   0,07497708   0,12648386   0,23296333  
10 0,10407895   0,14498341   0,23849263   0,41537176  
20 0,19779947   0,2701108   0,42283299   0,66362612  
40 0,359291   0,47140654   0,6740284   0,89475754  
60 0,49063208   0,62074256   0,82034125   0,97433659  
Tabla 3. Conversiones respecto al tiempo a diferentes concentraciones de lactosa.

De la tabla ya podemos observar que conforme la concentración de lactosa es menor,

mayor rendimiento se produce, llegándose a alcanzar hasta un 97% de conversión a
20mM de concentración a los 60 min. Para visualizarlo mejor representamos la
conversión frente al tiempo en la siguiente gráfica:

1,2  

1  

0,8  
Conversión    

100mM  
0,6  
70mM  
0,4   40mM  

0,2   20mM  

0  
0   10   20   30   40   50   60   70  
Tiempo  (min)  

Una vez obtenidas las conversiones realizamos una regresión no lineal, con el fin de
obtener los parámetros A y B, que ahora definiremos.

La ecuación cinética que emplearemos estará basada en la cinética de Michaelis-

Menten, (modelo de inhibición competitiva):

𝐴 ∙ 𝑋 − 𝐵 ∙ 𝐿𝑁 1 − 𝑋 = 𝑡

Donde,

𝐾! 𝑆!
𝐴 = (1 − )∙
𝐾! 𝑉!

𝑆! 𝐾!
𝐵 = (1 − )∙
𝐾! 𝑉!

Ingeniería  Bioquímica   Página  17  

 
Introducimos la ecuación basada en la cinética de Michaelis-Menten en el programa
Mystat, realizando una regresión no lineal y representamos tiempo frente a la
conversión, obteniéndose los siguientes resultados:

Para 100mM

Parameter
Estimates
Parameter Estimate

A (min) 11,421
B (min) 80,632

Fig. 7 Variación de la conversión respecto al tiempo transcurrido, a 100mM.

Ingeniería  Bioquímica   Página  18  

 
Para 70mM

Parameter
Estimates
Parameter Estimate

A (min) 7,637
B (min) 57,016

Fig. 8 Variación de la conversión respecto al tiempo transcurrido, a 70mM.

Para 40mM

Parameter
Estimates
Parameter Estimate

A (min) 4,999
B (min) 32,588

Fig. 9 Variación de la conversión respecto al tiempo transcurrido, a 40mM.

Ingeniería  Bioquímica   Página  19  

 
Para 20mM

Parameter
Estimates
Parameter Estimate

A (min) 6,121
B (min) 14,876

Fig. 10 Variación de la conversión respecto al tiempo transcurrido, a 20mM.

Una vez calculados los valores A y B, se representa A+B frente a concentración inicial
de lactosa. La ecuación que rige la linealización de estos puntos nos ayudará a calcular
las constantes cinéticas.

(A+B)  frente  a  So  

100  
y  =  0,8912x  +  2,577  
80   R²  =  0,99966  
A+B  (min)  

60  

40  

20  

0  
0   20   40   60   80   100   120  
So  (mM)  

Fig. 11 A+B frente a concentración inicial de lactosa.

! !! !
Tenemos que 𝐴 + 𝐵 = 𝑆! ∙ +   ! por lo que !   es la pendiente de la recta y
!! ! !
!!
es la ordenada en el origen.
!!

Ingeniería  Bioquímica   Página  20  

 
Según la ecuación usada Vmax tiene las unidades de mM/min, que habrá que pasar a
U/mg con el fin de poder comparar todos los resultados en la conclusión final. Así que
nos ayudamos del valor de concentración de β-galactosidasa, que es de 3000 mg/L, para
la conversión.

Vmax = 1 / 0,8912 = 1,1221 mM/min. = 1122,1 μmol / (L·min)

Vmax = 1122,1 / 3000 = 0,374 U/mg

Km = 2,577 · 1,1221 = 2,891 mM.

Calculamos Kcat de la misma manera que cuando teníamos ONPG como sustrato, con
la salvedad de que en este caso tenemos una concentración de enzima de 3mg/mL. Con
el peso molecular de la enzima obtenemos las unidades deseadas para poder calcular
Kcat.

[enzima] = 3 mg/mL / 105.000 mg/mmol = 0,0000286 mmol/mL = 0,0286 mmol / L

Teniendo [enzima] y Vmax,

Kcat = 1,1221 mmol /(L·min) / 0,0286 mmol / L = 39,23 𝑚𝑖𝑛!!

!! !!
También sabemos que 𝐴 = (1 − )∙ de donde podemos despejar Ki, de esta
!! !!
manera obtenemos las constantes cinéticas, que recogemos en la siguiente tabla:

100mM 70mM 40mM 20mM

Vm (U/mg) 0,374  
Km (mM) 2,891  
Ki (mM) 3,294   3,316   3,363   4,404  
Ki media (mM) 3,595  
Kcat (𝒎𝒊𝒏!𝟏 ) 39,23  
Kcat / Km (𝒎𝒊𝒏!𝟏 𝒎𝑴!𝟏 ) 13,57  
Tabla 4. Constantes cinéticas para distintas concentraciones iniciales de lactosa.

Ingeniería  Bioquímica   Página  21  

 
Práctica 4. Inmovilización de la enzima en Amberlita IRC-50.

En la siguiente práctica veremos qué porcentaje de enzima es capaz de inmovilizar un

lecho de amberlita. Para ello se tiene un tubo de 50 mL donde se encuentra la resina,
previamente preactivada por el técnico de laboratorio, al que se añaden 30 mL de una
solución de β-galactosidasa (3mg/mL en tampón fosfato 50mM, pH 7). Para una mejor
inmovilización este tubo se tiene en continua agitación durante 80 min.

Se van recogiendo muestras de 100 μL a los 5, 10, 20, 40, 60 y 80 minutos. A cada
muestra se le realizó el ensayo estándar de actividad β-galactosidasa, recogido en el
apartado Métodos. Esto se hizo con el fin de conocer la absorbancia, con la que, a partir
de la ley de Lambert-Beer, podemos conocer datos de concentración y con ello datos de
actividad.

Se sigue, por tanto, el mismo procedimiento que para la práctica 1 y 2, con los mismos
datos para la conversión en U/mg, con la salvedad de que la masa de la enzima a tiempo
cero, en este caso, es de 0,04 mg. Este dato se conoce sabiendo la concentración inicial
de la enzima (3mg/mL) y su dilución (1/7,5).

La tabla de datos y resultados sería:

Absorbancia C  (µM)   U(µmol/min)   Act  (U/mg)  

1,509   328,043478   0,13121739   3,28043478  
0,676   146,956522   0,05878261   1,46956522  
0,268   58,2608696   0,02330435   0,5826087  
0,180   39,1304348   0,01565217   0,39130435  
0,206   44,7826087   0,01791304   0,44782609  
0,199   43,2608696   0,01730435   0,4326087  
0,235   51,0869565   0,02043478   0,51086957  
Tabla 5. Datos de absorbancia, concentraciones y actividades.

Ingeniería  Bioquímica   Página  22  

 
Representamos la actividad frente al tiempo para una mejor visualización de los datos
de la tabla:

3,5  

3  

2,5  
ac#vidad  (U/mg)  

2  

1,5  

1  

0,5  

0  
0   10   20   30   40   50   60   70   80   90  
#empo  (min)  

Fig.10 Variación de la actividad enzimática con el paso del tiempo.

Vemos cómo el paso del tiempo hace que disminuya considerablemente la actividad, lo
que nos dice que la enzima está cada vez más inmovilizada en el lecho de amberlita.

El porcentaje de enzima inmovilizada lo obtenemos de la siguiente ecuación:

𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑!"!#!$% − 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑!"#$%
%!"#$%&  !"#$%!&!'()( = ∙ 100
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑!"!#!$%

Nos queda una tabla con todas las conversiones respecto al tiempo que transcurre:

Tiempo (min) % enzima inmovilizada

0 0
5 55,2021206
10 82,239894
20 88,0715706
40 86,3485752
60 86,8124586
80 84,4267727
Tabla 6. Porcentaje de enzima inmovilizada.

Vemos cómo el transcurso del tiempo ha ido incrementando el porcentaje de enzima

inmovilizada, llegando a un porcentaje de enzima inmovilizada final de 84,42 %.

Ingeniería  Bioquímica   Página  23  

 
Para ver los gramos totales de enzima inmovilizada, le aplicamos el porcentaje final a
los gramos totales que había de enzima en un principio:
𝑚𝑔
𝑚𝑎𝑠𝑎!"#$%&  !"!#$ = 3 ∙ 30𝑚𝑙 = 90𝑚𝑔
𝑚𝑙
𝑚𝑎𝑠𝑎!"#$%&  !"#$%!&!'()( = 90𝑚𝑔   ∙ 0,84 = 75,89𝑚𝑔  

𝑚𝑎𝑠𝑎!"#$%&  !"#$%!&!'()( 1 𝑚𝑔!"#$%&

= 75,89𝑚𝑔 ∙ = 3,79
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛!"#$%&'(! 20𝑚𝐿 𝑚𝐿!"#$%&'(!

Determinación de la porosidad de la amberlita.

Sabiendo que,

Absorbancia inicial * V inicial = Absorbancia final * Vfinal

Obtenemos,

Vfinal = (0,422*2)/ 0,288 = 2,93 mL

Como la porosidad es igual a (Vfinal – Vinicial)/ Vinicial = (2,93 – 2)/ 2

𝑃𝑜𝑟𝑜𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑  𝑎𝑚𝑏𝑒𝑟𝑙𝑖𝑡𝑎 = 0,46

Ingeniería  Bioquímica   Página  24  

 
Práctica 5. Hidrólisis de lactosa en el biorreactor.

El objetivo de la siguiente práctica es llevar a cabo la hidrólisis de lactosa, con β-

galactosidasa inmovilizada sobre un lecho de amberlita y conocer la conversión de
glucosa alcanzada. Para ello se virtió el gel, formado por la enzima inmovilizada en la
resina que preparamos en la práctica 4, en una columna de 20mL y 1,3cm de diámetro.
A esta columna se le fue añadiendo tampón fosfato pH 4,5 para que no se secara el gel.

La columna, que hará de biorreactor, operará a caudales de 2, 4, 8 y 12 mL/min

utilizando un suero lactosado de concentraciones 50, 20, 10 y 5 mM. Se recogieron
muestras a la salida de la columna las cuales se diluyeron y posteriormente analizaron
mediante el método de glucosa oxidasa-peroxidasa, recogido en el apartado Métodos,
para conocer la glucosa obtenida.

Una vez seguidos los pasos del método oxidasa-peroxidasa se obtienen una serie de
absorbancias que representamos frente a concentración de glucosa y obtenemos nuestra
recta patrón:

Recta  patrón  
2,000  

1,500  
absorbancia  

1,000  

abs  =  8,6134*[G]  +  0,0393  

0,500   R²  =  0,9987  

0,000  
0   0,05   0,1   0,15   0,2   0,25  
[Glucosa]  (mM)  

Fig.11 Recta patrón.

Al igual que en la práctica 3, de la ecuación de esta recta podemos calcular el valor de

concentración de glucosa para distintas absorbancias; concentración que se encuentra
diluída, por lo que se multiplica por su dilución. De esta manera se puede hallar la
conversión de glucosa alcanzada.

Ingeniería  Bioquímica   Página  25  

 
Todo ello para las cuatro concentraciones distintas de lactosa, 50, 20, 10, 5. Nos queda
la siguiente tabla de conversiones (siendo X la conversión):

50mM 20mM 10mM 5mM

Caudal X X X X
(ml/min)
13,3 0,32501509        
9,1 0,43902039        
4,5 0,69303218        
2,3 0,90104184        
12,9   0,51502392      
9,4   0,6310293      
4,3   0,89304147      
3,7   0,92504296      
14,7     0,57802684    
8     0,79803706    
4,1     0,95704444    
3     0,98604579    
13       0,69503228  
7,7       0,86604022  
4,9       0,95804449  
2,9       0,99504621  
Tabla 7 Conversiones respecto al tiempo a diferentes concentraciones de lactosa.

De la tabla ya podemos observar que conforme la concentración de lactosa es menor,

mayor rendimiento se produce, llegándose a alcanzar un valor máximo de 99% de
conversión a 5mM de concentración.

Ahora procedemos a realizar una simulación del biorreactor mediante el software

Berkeley-Madonna.

Para utilizar dicho programa necesitamos conocer los valores de las constantes
cinéticas. Los calculamos igual que en la práctica 3, averiguando valores de A y B de la
ecuación cinética de Michaelis-Menten (mediante regresión no lineal, ayudándonos del
software Mystat) y luego representando A+B frente a la concentración de lactosa.

Para utilizar Mystat necesitamos la variable tiempo, en este caso sería tiempo de
residencia calculado como,

𝑉!"#$%&'ó!
𝑡=
𝑄

Donde Q es el caudal y Vexclusión es el volumen de exclusión de la columna, cuya

fórmula se define como,

𝑉!"#$%&'ó! = 𝑝𝑜𝑟𝑜𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑   ∙   𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛!"!#$

𝑉!"#$%&'ó! = 9,3𝑚𝐿

Ingeniería  Bioquímica   Página  26  

 
Nos queda la siguiente tabla de resultados:

50mM 20mM
Caudal (mL/min) Tiempo (min) Caudal (mL/min) Tiempo (min)
13,3 0,7015507 12,9 0,71997961
9,1 1,0265667 9,4 0,98778501
4,5 2,07014512 4,3 2,1866288
2,3 3,99344014 3,7 2,52844222

10mM 5mM
Caudal (mL/min) Tiempo (min) Caudal (mL/min) Tiempo (min)
14,7 0,63469869 13 0,71958475
8 1,16942025 7,7 1,21387245
4,1 2,28422115 4,9 1,90912585
3 3,09053039 2,9 3,18275632
Tabla 8 Tiempos de residencia para distintos caudales y concentraciones de lactosa.

Con todo esto y la misma ecuación que para la práctica 3, Mystat nos proporciona lo
siguiente:

Para 50mM

Parameter
Estimates
Parameter Estimate

A (min) 0,134
B (min) 1,674

Fig. 11 Variación de la conversión respecto al tiempo transcurrido, a 50mM.

Ingeniería  Bioquímica   Página  27  

 
Para 20 mM

Parameter
Estimates
Parameter Estimate

A (min) 0,054
B (min) 0,957

Fig. 12 Variación de la conversión respecto al tiempo transcurrido, a 20mM.

Para 10mM

Parameter
Estimates
Parameter Estimate

A (min) 0,028
B (min) 0,717

Fig. 13 Variación de la conversión respecto al tiempo transcurrido, a 10mM.

Ingeniería  Bioquímica   Página  28  

 
Para 5 mM:

Parameter
Estimates
Parameter Estimate

A (min) 0,017
B (min) 0,597

Fig. 14 Variación de la conversión respecto al tiempo transcurrido, a 5mM.

Representamos la suma de los valores de A y B obtenidos, frente a la concentración de

lactosa:

A+B  frente  a  So  

2  

1,5  
A+B  (min)  

1  
y  =  0,0265x  +  0,4803  
R²  =  1  
0,5  

0  
0   10   20   30   40   50   60  
So  (mM)  

Fig. 15 Representación de A+B frente a la concentración de lactosa, 50, 20, 10 y 5.

Ingeniería  Bioquímica   Página  29  

 
Tras repetir el mismo proceso que en la práctica 3 nos queda la siguiente tabla:

100mM 70mM 40mM 20mM

Vm (mM/min) 37,7358491  
Vm (U/mg) 4,62436342  
Km (mM) 18,1245283  
Ki (mM) 20,16372796   20,1806723   20,2658228   20,7922078  
Ki media (mM) 20,3506077  
Tabla 9 Constantes cinéticas Vm, Km y Ki para distintas concentraciones iniciales de
lactosa.

Ahora estamos en disposición de utilizar la herramienta informática Berkeley-Madonna,

la cual simula el comportamiento del reactor y nos proporciona directamente los valores
de concentración de glucosa tras la hidrólisis. A modo de ejemplo expondremos 2
gráficas de este programa a concentración inicial de lactosa de 50mM y a distintos
caudales de ml/min. Decir que se ha realizado una media de los caudales por
simplicidad de cálculos, viendo que el error cometido es bastante pequeño ya que los
caudales varían su valor en poca medida, haciendo que la media de todos ellos sea un
valor bastante acertado.

Para caudal de 13,48 ml/min:

Fig.16 Caudal de 13,48 ml/min y concentración inicial de lactosa 50mM. La línea de

color rojo representa la concentración de lactosa y la de color negro la concentración
de glucosa. Siendo P la concentración de glucosa y S la de lactosa, TIME es el tiempo
de reacción.

Nosotros únicamente nos hemos fijado en la concentración de glucosa, es decir, en la

línea negra.

Ingeniería  Bioquímica   Página  30  

 
Para caudal de 8,54 ml/min:

Fig.17 Caudal de 8,54 ml/min y concentración inicial de lactosa 50mM. La línea de

color rojo representa la concentración de lactosa y la de color negro la concentración
de glucosa. Siendo P la concentración de glucosa y S la de lactosa, TIME es el tiempo
de reacción.

Los parámetros que se han utilizado para el programa Berkeley-Madonna son los
siguientes:

METHOD RK4

STARTTIME = 0
STOPTIME=50
DT =0.1
init P = 0
init S =10
Vm =38.61
Km =18.79
Ki = 20.49
S0=10
F=13.47
V=9.3
P'=-(F/V)*(S0-S)+((Vm*S)/(Km+S+Km*P/Ki))
S' = -P'

Siendo init S y S0 la concentración inicial de lactosa e init P la concentración inicial de

glucosa, que es en todo momento cero. Vm, Km, Ki son las constantes cinéticas
calculadas anteriormente, F es el caudal y V es el volumen de exclusión.

Ingeniería  Bioquímica   Página  31  

 
Obtenemos la siguiente tabla:

Caudal(ml/min) 50mM 20mM 10mM 5mM

2,96 32,26 15,32 8,12 4,19
4,5 27,36 13,59 7,37 3,87
8,54 19,22 10,48 6 3,23
13,48 13,97 8,21 4,85 2,68
Tabla 10 Concentración de glucosa a distintas concentraciones iniciales de lactosa y
para distintos caudales.

Ahora bien, para obtener la conversión de glucosa realizamos una simple división entre
la concentración de glucosa obtenida y la concentración inicial de lactosa y nos queda:

Caudal(ml/min) 50mM 20mM 10mM 5mM

2,96 0,6452 0,766 0,812 0,838
4,5 0,5472 0,6795 0,737 0,774
8,54 0,3844 0,524 0,6 0,646
13,48 0,2794 0,4105 0,485 0,536
Tabla 11 Porcentaje convertido en glucosa.

Ingeniería  Bioquímica   Página  32  

 
Conclusión
Tras este exhaustivo estudio sobre la enzima β-galactosidasa para la hidrólisis de
lactosa, podemos mostrar cuales son los parámetros más adecuados para trabajar con
ella. Pasando por influencia de pH, temperatura, variación de sustrato e inmovilización
de la enzima.

Hemos podido ver cómo en nuestro experimento el rango adecuado de trabajo para la
enzima se encuentra entre 3-6, siendo 4 el pH óptimo. Al aumentar la basicidad por
encima de 6, la enzima se va desnaturalizando cada vez más y haciéndose inservible
como catalizador.

Así mismo hemos visto que la enzima se desnaturaliza muy rápido a temperaturas
elevadas, como los 70ºC. Si bajamos 10ºC, la actividad enzimática se mantiene en
valores altos durante cierto periodo corto de tiempo, y se desnaturaliza en periodos
largos. Si volvemos a bajar 20ºC, estando en 40ºC, comprobamos que la actividad se
mantiene en valores muy aceptables durante más tiempo que para las otras dos
temperaturas, teniendo un tiempo de vida medio 8 veces superior al tiempo de vida
medio de 60ºC. Esto nos dice que la temperatura más adecuada de trabajo de la enzima
es de 40ºC.

Investigando en bibliografías hemos encontrado resultados de pH y temperatura

adecuados para nuestro mismo experimento, encontrándose que nuestros resultados son
satisfactorios, ya que nos dice que el pH que se debe utilizar está entre 3,5 y 8, siendo el
óptimo pH 5. En cuanto a temperatura, 55ºC es la temperatura adecuada. Decir que los
resultados varían un poco, lo que es lógico ya que varían los métodos utilizados,
laboratorio, instrumental y seguramente ciertos parámetros que nosotros hemos tenido
en cuenta y los demás no y viceversa. Pero dentro de la lógica los resultados concuerdan
[9].

Respecto a la variación de sustrato, decir que se realizaron dos experimentos para

calcular las constantes cinéticas de la lactasa. El primero fue con ONPG como sustrato,
y el segundo con lactosa.

Analizando primero los resultados con ONPG, vemos que son coherentes, ya que la
actividad de la enzima es mayor sin presencia de inhibidor que con este. Esto lo
corroboramos con los datos de eficiencia (Kcat/Km), que en el caso de inhibición es de
1,83 y en el caso con inhibición es 9,596. Esto nos dice que la eficiencia catalítica de
nuestra enzima es mucho mayor cuando no hay inhibidor.

Otro conclusión que se puede tener observando los resultado es que el valor de Vmax a
penas varía con o sin inhibidor, sin embargo, el valor de de Km sí que varía
considerablemente. Esto nos dice que la inhibición que se está dando es competitiva.

En segundo lugar analizando el resultado con lactosa como sustrato, se aprecia que se
alcanza un mayor rendimiento a bajas concentraciones de lactosa, obteniéndose hasta un

Ingeniería  Bioquímica   Página  33  

 
97% de conversión con 20 mM y un 0,49% con 50 mM en el mismo tiempo de
reacción, una hora.

Realizando una comparativa de ONPG y lactosa como sustrato, quedaría la siguiente

tabla:

Sustrato Vmax Km Ki Kcat (𝒎𝒊𝒏!𝟏 ) Kcat/Km

(U/mg) (mM) (mM) (𝒎𝒊𝒏!𝟏 ∙ 𝒎𝑴!𝟏 )
Sin inhibidor 8,412 2,301 22,08 9,596
ONPG Con inhibidor 8,91 12,806 6,57 23,39 1,83

Lactosa 0,374 2,891 3,595 39,23 13,57

Tabla 12. Constantes cinéticas de la enzima β-galactosidasa con diferentes sustratos,
lactosa y ONPG.

Como vemos en la tabla, la especificidad es más alta cuando tenemos lactosa como
sustrato, que ONPG sin inhibidor. Por lo que si queremos una eficiencia catalítica lo
más alta posible y tenemos ONPG y lactosa, la elección debe ser lactosa, ya que
conseguiremos mejores resultados. También se observa que la constante de inhibición
es más alta para ONPG, hecho que se puede explicar sabiendo que añadimos inhibidor a
una concentración de 30mM para la reacción con ONPG, mientras que para la lactosa,
el inhibidor que hay es el que se va creando conforme la reacción tiene lugar.

Seguidamente analizamos las características de la enzima cuando se encuentra

inmovilizada sobre un lecho de amberlita y observamos cómo la enzima pierde un poco
de actividad enzimática. Por otra parte, como cabe esperar, el porcentaje de enzima
inmovilizada cada vez es mayor al aumentar el tiempo de inmovilización, llegando a ser
de un 86,8% pasada una hora. La masa de enzima inmovilizada fue de 75,89 gramos
respecto a un total de 90 gramos de enzima.

Por último se realizó la hidrólisis de lactosa en un biorreactor a escala de laboratorio y

se determinaron las conversiones de glucosa. Estas se determinaron experimentalmente
y a través de un software que simula el comportamiento de un reactor. Tanto de una
manera como de la otra se observa la misma tendencia, la de aumentar la conversión a
glucosa conforme el caudal es menor. Esto es algo muy coherente ya que al disminuir el
caudal aumenta el tiempo de residencia y por tanto, la lactosa permanece más tiempo en
el reactor y puede reaccionar más. También se observa que favorece la disminución de
concentración inicial de lactosa.

Los resultado obtenidos del software Berkeley-Madonna difieren de los obtenidos

experimentalmente, siendo la mayor conversión de aproximadamente un 84% con un
caudal de 2,96 mL/min, mientras que para el procedimiento experimental ha sido de un
99% para un caudal de 2,9 mL/min. Esta diferencia puede deberse a errores
experimentales en laboratorio junto con la inexactitud con que se miran las conversiones
en el software, sumado a haber realizado una media de los caudales para introducirlo en
el Berkeley-Madonna.

Ingeniería  Bioquímica   Página  34  

 
Habiendo llegado finalmente a todas estas conclusiones, realizando consultas
bibliográficas y analizando los resultados podemos concluir que la enzima β-
galactosidasa es un buen catalizador para la reacción de hidrólisis de la lactosa, si se
utiliza adecuadamente, a un pH que ronde el valor de 4, una temperatura no muy alta,
cerca de los 40ºC. Preferiblemente con lactosa como sustrato, con la enzima
inmovilizada y llevándose a cabo la reacción a caudales de lactosa bajos y
concentraciones iniciales de lactosa bajas.

Esto sería las condiciones más adecuadas para la hidrólisis de lactosa a escala
laboratorio, para emplearlo a escala industrial se tendrían que cambiar los caudales y
concentraciones iniciales de lactosa por valores mayores, por lo que la conversión a
glucosa bajará respecto a la nuestra. Se deberían hacer nuevos ajustes, cálculos y
experimentos para ver qué parámetros se ajustan mejor para un volumen mayor de suero
lactosado.

Ingeniería  Bioquímica   Página  35  

 
Bibliografía

[1] M. de, A. Stegelmann, B. Richter, S. Fenselau, C. Laue & J. Schrezenmeir. 2001.

Probiotics—compensation for lactase insufficiency. Am J Clin Nutr 73:421S-9S.
[2] Diabetes y uso de edulcorantes. Sociedad mexicana de nutrición y endocrinología.
[3] José Luis Carrillo Aguado. Tratamiento y reutilización del suero de leche.
[4] Mercasa ediciones. Leche y productos lácteos. Año 2012.
[5] Téc. Magali Parzanese. Tecnologias para la industria alimentaria. Procesamiento de
lactosuero.
[6] Isabel Castro, Zulma Liliana Daza. Profesor Jorge Castañeda. Utilización de suero
lácteo (subproducto de la industria láctea), en la elaboración de una bebida isotónica.
Universidad incca de Colombia, proyecto de investigación. Bogotá 2011. Martha
[7] Silvina Andrea Regenhardt. Estudio de la inmovilización de la β-galactosidasa para
la reutilización de la lactosa del suero de quesería. Año 2010. Universidad nacional del
litoral, facultad de ingeniería química. Apartado 1.8. Enzimas para la hidrólisis de la
lactosa.
[8] Silvina Andrea Regenhardt. Estudio de la inmovilización de la β-galactosidasa para
la reutilización de la lactosa del suero de quesería. Año 2010. Universidad nacional del
litoral, facultad de ingeniería química. Apartado 1.4. Inmovilización de las enzimas.
[9]  Park YK, De Santi MSS, Pastore M.(2006). Producion and characterization of β-
galactosidase from Aspergillus Oryzae.

Ingeniería  Bioquímica   Página  36