CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO Y

OBTENCIÓN DE PROTEASAS

El crecimiento microbiano corresponde al aumento

poblacional de un M.O en un medio de cultivo con
todas las necesidades requeridas. (nutrientes,
temperatura, humedad, PH).
 BACILUS SUBTILIS
• Bacteria Gram positiva,
aerobio.
• Crecen entre los 10 - 48º,
la temperatura óptima es
entre 28 - 35º.
• No es considerado patógeno
humano; puede contaminar
los alimentos.
• Utilizado en la manipulación
genética, organismo modelo
para estudios de laboratorio.
 CASEINA
La caseína representa el 80% de las proteínas
presentes en la leche y el 2,7% en
composición de la leche líquida, son
moléculas de gran tamaño que contienen un
gran número de aminoácidos, entre los
cuales los más importantes son los ácidos
glutámico, leucina y prolina.

 los cuatro tipos de caseínas: (αs1, αs2 , β

y κ).

 En presencia de calcio en cada grupo

fosfato, La unión de las distintas
submicelas por fosfato cálcico da lugar a
una micela propiamente dicha.

 Micela: partículas formadas por moléculas

de caseína fosfato cálcico en forma
coloidal.
• Las proteínas alfa y beta
precipitan en presencia de
iones calcio.

• Para ello se acidifica la leche a

pH 4.6 (punto isoeléctrico).

• Si se añade ácido a la leche, la

carga negativa de la superficie
de la micela se neutraliza, los
grupos fosfato se protonan y la
proteína se precipita
Las proteínas que
aparecerán en el
sobrenadante cuando
precipitemos la caseína
en medio son proteínas
globulares, fácilmente
solubles en agua.

Las principales son ß –

lacto globulina,
alphalactalbumina e
inmunoglobulinas (Ig)
 HIDROLISIS
Se produce cuando la bacteria
contiene la enzima proteolítica
caseasa.
La hidrolisis de la caseína por la
actividad enzimática produce
una conversión final del
precipitado en un líquido claro.
La curva de crecimiento microbiano
constan de 4 etapas:
 LATENCIA (LAG)
El numero de M.O no varia.
Representa un periodo de
transición (Inoculación de
bacteria en medio), y
adaptación para los M.O.
Síntesis de ARN, enzimas y
otras moléculas necesarias para
que la bacteria crezca en el
nuevo medio.
En esta fase no hay incremento
de células, pero hay aumento
en su tamaño individual.
 EXPONENCIAL (LOGARITMICA)
 El M.O crece exponencialmente, se
duplica en cada período de tiempo,
la velocidad de crecimiento es
máxima.
 El número de nuevas bacterias que
aparecen por unidad de tiempo es
proporcional a la población.
 Las condiciones ambientales afectan
la velocidad de crecimiento
exponencial.
 El crecimiento exponencial no puede
continuar indefinidamente, porque
el medio llega pronto al agotamiento
de nutrientes.
 ESTACIONARIA
Se limita el crecimiento, ya
sea por agotamiento de
algún nutriente esencial,
por acumulación de
productos tóxicos o al
alcanzar un número
elevado de células en el
medio.
 MUERTE
 Las bacterias se quedan
sin nutrientes y mueren.
Comienza una disminución
progresiva en el número
de células viables.
Acumulación de residuos
tóxicos.
La tasa de muerte es
exponencial.
 OBJETIVOS
• Establecer una curva de
crecimiento a partir de un
cultivo controlado de
Bacillus subtilis.
• Establecer la relación entre
la producción metabólica
secundaria y las fases de
una curva de crecimiento
microbiano.
 REACTIVOS Y EQUIPOS
• M.O Bacillus subtilis
• Caldo nutritivo
• Sln de ácido tricloroacético
(C2HCL3O2)  precipita proteínas
• Caseína (proteína de la leche)
• Espectrofotómetro
• Agitador orbital
• Centrífuga
• Erlenmeyer 250 ml
• Tubos de ensayo
• Pipetas estériles de 1-5 ml.
 PROCEDIMIENTO
Preparar 130 ml de un medio de
cultivo nutritivo según indicaciones
y distribuir de la siguiente manera:

 1 tubo de ensayo con 5 ml

1 Erlenmeyer con 100 ml

25 ml repartidos en frascos

pequeños a razón
aproximadamente de 3 ml.
Luego con ayuda de una asa
tomar una muestra del M.O
(Bacillus subtilis), transferir al
tubo de ensayo dispuesto con los
cinco mililitros del medio de
cultivo.

Una vez alcanzada la fase

exponencial (fisión binaria), este
se utiliza como inóculo del
erlenmeyer y se incuba a 28o C
con una agitación orbital
permanente de aproximadamente
100 r.p.m.
Cada dia se toman 2
ml de medio de cultivo
y medimos la
absorbancia por medio
del espectrofotómetro
(550 - 600 nm).
utilizamos como
blanco el medio de
cultivo estéril
almacenado en los
frascos pequeños.
Para determinar la producción
del metabolito deseado
(proteasas) durante el tiempo
del cultivo, se toman muestras
con la periodicidad descrita por
el profesor.

Se someten a fuerza centrífuga

(4.000 rpm, 10 minutos), y se
almacena el sobrenadante para
realizar la siguiente prueba:
Se llenan 3 tubos de ensayo con 1 ml de
solución de caseína o leche muy diluida y
se agregan :

 Tubo 1: 1 ml de agua (blanco)

 Tubo 2: 1ml de medio de cultivo

microbiano libre de células

 Tubo 3: 1 ml de medio de cultivo

microbiano libre de células,
previamente sometido durante 2
minutos a 100°C.

Se llevan los tres tubos en baño Maria

(30°C) durante 30 minutos luego
adicionamos 1 ml de ácido
tricloroacético.
 CONCLUSIONES
El método para
determinar el
crecimiento microbiano
es la absorbancia

La curva de crecimiento

se elabora por los datos
obtenidos a partir de la
acción del sobrenadante.
 USOS
Farmacéutica: Elaboración
antibióticos, cosméticos.
Alimenticia: coagulante de
la leche.
Agrícola: Fungicida natural
(agente de control
biológico.
Industrial: Aditivo en
detergentes