INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

CURSO PRÁCTICO DE
INGENIERÍA DE
FERMENTACIONES

ACADEMIA DE FERMENTACIONES

Cd. de México 2020

 CURSO PRÁCTICO DE INGENIERÍA DE FERMENTACIONES

CONTENIDO
Título de la práctica Pág.

Reducción del contenido de ácidos nucleicos en proteína unicelular 1

Extracción y purificación de enzimas de hongos 7

Bioproceso para la producción de etanol 14

Esterilización de medios de cultivo 20

Tratamiento de aguas residuales industriales 30

PROFESORES PARTICIPANTES

Dra. Cleotilde Juárez Ramírez

Dra. Nora Ruiz Ordaz
Dra. Angélica Salmerón Alcocer
Dra. Deifilia Ahuatzi Chacón
M. C. María Elena Mondragón Parada
I.B.Q. Raúl Chávez Alvircio
Dr. Juvencio Galíndez Mayer
Dr. Oswaldo Arturo Ramos Monroy
M. C. Alejandro Hernández Estévez
Dr. Hugo Velasco Bedrán
M. C. Carlos Alberto Sandoval Carrasco
REDUCCIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
EN PROTEÍNA UNICELULAR

Introducción

La producción de alimentos a nivel mundial depende casi enteramente de la

agricultura, presentando escasez en el rubro de las proteínas. El uso de la
proteína unicelular (PUC) para consumo humano como fuente de proteína se
optimiza, ya que si se destinara al consumo animal para la subsiguiente pro-
ducción de proteína, éste sería un proceso lento y caro.

El uso de la PUC para consumo humano presenta varias limitaciones como

son: baja digestibilidad y un contenido alto de ácidos nucleicos. El problema
que se presenta al consumir la proteína unicelular con alto contenido de áci-
dos nucleicos, es que, durante el metabolismo de éstos, las bases púricas son
degradadas hasta ácido úrico.

El hombre y otros animales superiores carecen de la enzima uricasa, la cual

oxida el ácido úrico a otro producto más soluble y excretable: la alantoína, lo
que provoca una acumulación de ácido úrico, el cual puede precipitarse en
las articulaciones ocasionando el padecimiento conocido como “gota” en te-
jido blando, ó cálculos en el tracto urinario.

De los resultados obtenidos por Edozien y col.(1970), al suministrar en la

dieta de hombres jóvenes distintas cantidades de proteína unicelular con
posterior determinación de la concentración de ácido úrico en suero y sangre
se concluyó que, para que éste permanezca dentro de los niveles normales,
deben consumirse como máximo 2 g/día de ácidos nucleicos, que equivalen
aproximadamente a 20-30 g de levadura/día.

Esta limitación restringe el consumo de proteína unicelular, que contiene en-

tre un 8 y 19 % de ácidos nucleicos, por lo cual se hace necesario dar un tra-

1
tamiento a la biomasa para reducir el contenido de ácidos nucleicos en pro-
teína unicelular. Se han propuesto diversos métodos para la reducción del
contenido de ácidos nucleicos entre los cuales se encuentran:

I.- Manipulación de la fisiología del microorganismo:

Durante la propagación del microorganismo se pueden propiciar las condi-

ciones para que éstos tengan un menor contenido de ácidos nucleicos. Por
ejemplo, es conveniente que al final de un proceso fermentativo se mantenga
al microorganismo creciendo a una baja velocidad ya que existe una relación
directa entre ésta y el contenido de ácidos nucleicos en la célula.

Si se selecciona el nutriente limitante del crecimiento, por ejemplo: cuando

se limita el crecimiento de Aerobacter aerogenes por amonio, la relación pro-
teína/RNA es de 5. Si el cultivo está limitado por fósforo, la relación es de 7.2.

II.- Hidrólisis alcalina:

El tratamiento consiste en someter a la biomasa a la acción de un álcali, a

tiempos y temperaturas controlados. En el tratamiento con álcalis diluidos,
el DNA no se hidroliza, mientras que el RNA sí, debido a su grupo 2’hidroxilo.
Los primeros productos de la acción del álcali sobre el RNA son los 2’3’mo-
nofosfatos cíclicos, que son intermediarios obligatorios, éstos son hidroliza-
dos posteriormente por el álcali, que ataca a uno o a los dos enlaces P-O-C,
para dar como resultado una mezcla de 2’ y 3’ monofosfatos de nucleósidos.
Lo anterior explica porqué el DNA no se hidroliza, el DNA no posee grupos
hidroxilo 2’ y por lo mismo no puede formar los 2’3’ monofosfatos cíclicos
intermediarios.

III.- Tratamientos enzimáticos:

En estos tratamientos pueden emplearse ribonucleasas endógenas o exóge-

nas.
a) Tratamiento con ribonucleasas endógenas

2
Este método consiste en someter a las células a un choque térmico para que
se activen las ribonucleasas e hidrolicen su propio RNA. El método consta de
dos etapas, que son: activación de la enzima mediante un choque térmico (3
segundos a 68°C), seguido de una incubación a 55°C durante dos horas,
tiempo en el cual actúa la enzima sobre el RNA, secretándose los productos
de hidrólisis de la célula.
Este tratamiento se ha aplicado en levaduras como Candida utilis, Sacha-
romyces cerevisiae, y en bacterias como Brevibacterium JM98A y Alcalige-
nes eutrophus H16.

b) Tratamiento con ribonucleasas exógenas

Castro y colaboradores establecieron que la ribonucleasa de páncreas de bo-

vino puede utilizarse para reducir el contenido de ácidos nucleicos en leva-
duras. El tratamiento consiste en incubar las células con la enzima a un pH
entre 6.8 y 8.0 y una temperatura de 55°C a 65°C; sin embargo, para facilitar
la penetración de la ribonucleasa a la célula, se recomienda un pretrata-
miento térmico a 80°C durante 30 segundos.

Objetivo

Aplicar el tratamiento de hidrólisis alcalina para reducir el contenido de los

ácidos nucleicos en una cepa de levadura.

Desarrollo experimental

1.- Tratamiento con hidróxido de sodio al 2, 4 y 6 % en base seca de leva-

dura.
Preparar 5 tubos de polipropileno de 50 mL (con tapa), cada uno con 20 mL
de una suspensión celular a una concentración de 70 g/L. A tres de los cinco
tubos adicionarles respectivamente 140, 280 y 420 µL de hidróxido de sodio
al 20 %, los dos tubos restantes serán testigos que no llevan hidróxido de so-
dio. Se incuban los tubos que contienen hidróxido de sodio y uno de los tubos

3
testigo a 60°C durante 5 minutos. Transcurrido ese tiempo se colocan cada
uno de los tubos (sin tapa) en camisas de centrífuga previamente identifica-
das y se centrifugan a 3500 rpm durante 5 minutos. Se decantan y se desecha
el sobrenadante. El paquete celular se lleva a un volumen de 20 mL con agua
destilada utilizando la marca del tubo. A la suspensión celular se le determina
proteína por el método de Biuret y RNA por el método del orcinol.

Se trabaja al mismo tiempo con el 5° tubo, que corresponde a un testigo I, el

cual no sufre ningún tratamiento, la suspensión del tubo 4 es el testigo II,
aquél que se incuba en las mismas condiciones pero no se le adiciona el álcali.

2.- Extracción de los ácidos nucleicos

Reactivo: Ácido tricloroacético al 5 %

Procedimiento: Se toma 1 mL de la suspensión celular, de cada una de las
muestras (2%, 4%, 6%, TI y TII), y se colocan en tubos de ensayo con tapón
de rosca, se le adicionan 2 mL de ácido tricloroacético al 5 %. Se colocan los
tubos en baño María a ebullición durante 30 minutos (cuidar que no se agote
el agua del baño, adicionando agua poco a poco para que no deje de ebullir).
Después de este tiempo se centrifugan los tubos a 3000 rpm durante 15 mi-
nutos, se recuperan los sobrenadantes y en cada uno de ellos se determina la
concentración de RNA.

3.- Determinación de RNA

Método del orcinol

Reactivo: Disolver 0.5 g de orcinol y 0.25 g de cloruro férrico en 50 mL de
ácido clorhídrico concentrado (este reactivo se debe preparar en el momento
que se va a utilizar).

Procedimiento: Colocar en tubos de ensaye con tapón de rosca 0.2 mL del

sobrenadante, adicionar 1.5 mL del reactivo de orcinol recién preparado y 1.3
mL de agua destilada. Tapar los tubos y colocarlos en baño María a ebullición
durante 20 minutos. Enfriar y leer a 600 nm.

4
Preparar un estándar de RNA que contenga 400 μg/mL.

4.- Determinación de proteína

Método de Biuret
Reactivos: NaOH al 20 % y CuSO4 .5H2O al 25 %.

Procedimiento: Colocar en tubos de ens

aye con tapón de rosca, previamente identificados, 0.5 mL de la suspensión

celular tratada, adicionar 7.5 mL de agua y 1.5 mL de NaOH al 20 %. Tapar
los tubos y colocarlos en baño María a ebullición durante 5 minutos. Dejar
enfriar a temperatura ambiente y adicionar 0.25 mL de solución de sulfato
de cobre, romper inmediatamente el precipitado con una varilla de vidrio.
Centrifugar a 2000 rpm durante 10 minutos, decantar y leer el color desarro-
llado a 530 nm.
Preparar un estándar que contenga 10 mg/mL de caseína.

5.- Concentración celular

Hacer una dilución 1:100 de la suspensión celular y leer absorbencia a 595

nm, interpolar en la gráfica tipo.

Informe
 Introducción
 Tabular los resultados de concentración de proteína y RNA en las células
antes y después del tratamiento térmico y alcalino, así como la concen-
tración celular con la que se trabajó.
 Calcular el porcentaje de reducción de ácidos nucleicos y proteína des-
pués del tratamiento.

5
  Elaborar la gráfica de reducción porcentual en función de la concentra-
ción de NaOH.
 Discusión y conclusiones.

Bibliografía
1. Abu-Ruwaida, A.S., R.M. Lafferty, & H.G. Schiegel. 1976. Removal of RNA by heat
treatment. European J. Appl. Microbiol. 2:73-79.

2. Campa, A., M. Pleber, C. Romero, & H. Toba. 1972. A method for large reduction of
the nucleic acid content of yeast. Biotechnol. Bioeng. 15:173-177.

3. Castro A.C., J. Sinskey, & S. R. Tannebaum.1971. Reduction of Nucleic Acid Con-

tent in Candida Yeast Cells by Bovine Pancreatic Ribonuclease A Treatment. Appl.
Microbiol.22:422-427

4. Edozien, J.C., U.U. Udo, V.R. Young & N.S. Scrimshaw. 1970. Effects of high levels
of yeast feeding on uric acid metabolism of young men. Nature. 228:180-191.

5. Lehninger, A. 1981. Bioquímica. 4a. Edición. Omega, Barcelona.

6. Hei, H.Y., D.W. Thayer, y S.P. Yang. 1979. Reduction of endogenous nucleic acid in
a single cell protein. Appl. Environ. Microbiol. 38:143-147.

7. Montiel, S.F. 1980. Variación de la composición macromolecular de Candida utilis

al crecer en cultivo continuo y modificar algunos factores que afectan el creci-
miento. Tesis profesional. ENCB.

8. Ohta, A., S. Mauls, A. Sinskey, & S.R. Tannenbaum. 1971. Characterization of a heat
shock process for reduction of the acid content of Candida utilis. Appl.Microbiol.
22:415-422.

9. Otero, A.M. & A. Cacello. 1980. Single cell protein low in nucleic acids by alkaline
treatment. Biotechnol. Letters. 2:379-389.

10. Pérez, M. & P. Dionisio. 1971. Recent advances in microbiology. 4th. International
Congress for Microobiology. Tokio. 441-449.

11. Vilkare, L., & M. Link. 1976. A process for reduction of the nucleic acid content of
SCP. 5th International Fermentation Symposium, Berlín.

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS DE

HONGOS

6
Introducción

Los caldos de fermentación son mezclas complejas, compuestas de células,

productos solubles extracelulares, productos intracelulares y medios de cul-
tivo sin convertir. Particularmente un bioproceso incluye los procesos de pre-
paración y esterilización del medio de cultivo, preparación del inóculo (ups-
tream), la producción de un metabolito específico y su posterior extracción
y purificación (downstream).

La selección del proceso de recuperación del producto se basa en los siguien-

tes criterios:

 La localización del producto (fuera o dentro de la célula)

 La concentración del producto en el caldo de fermentación
 Las propiedades físicas y químicas del producto (tamaño, carga, solu-
bilidad, etc.)
 El uso tentativo del producto
 Las impurezas del caldo de fermentación
 El precio del producto en el mercado

Las secuencias de operaciones a través de las cuales se somete el caldo de

fermentación para obtener el producto deseado con una alta pureza son ge-
neralmente las siguientes:

Remoción de partículas insolubles. Las operaciones más comúnmente usa-

das en esta etapa son filtración, centrifugación, sedimentación y decantación.

Aislamiento primario. La extracción con disolventes, la adsorción, precipita-

ción y ultrafiltración son las operaciones más usadas. Durante este aisla-
miento primario, la concentración del producto deseado aumenta considera-
blemente.

7
Purificación. Con esta operación se remueven las impurezas del producto
concentrado, se utilizan entre otras operaciones la precipitación fraccionada,
extracción líquido-líquido y diferentes tipos de cromatografía como tamices
moleculares, intercambio iónico, adsorción, etc.

Obtención del producto. En esta última etapa se obtiene el producto con el

nivel de pureza requerido. Los procesos que se incluyen aquí son un secado
al vacío, cristalización y ultrafiltración.

Todas estas operaciones se utilizan para obtener una gran variedad de pro-
ductos como ácidos orgánicos, antibióticos, aminoácidos, etanol, vitaminas,
hormonas, proteínas terapéuticas, enzimas, etc.

La enzima invertasa, en especial la de levaduras ha tenido un papel primor-

dial en el desarrollo de la enzimología. Gran parte de los conocimientos en
cinética enzimática se deben a esta enzima. La invertasa es una enzima con
especificidad de fructofuranosidasa que participa en la reacción de hidrólisis
de los oligosacáridos con enlaces del tipo -2,1 fructofuranosos. A pesar que
la invertasa es una enzima extracelular, la mayor parte de ésta se queda rete-
nida en la pared celular, por lo que es necesario romper o desorganizar su
estructura para su liberación.

Se ha informado que compuestos con grupos sulfhidrilo son capaces de indu-

cir la liberación de enzimas que se encuentran de alguna forma unidas a la
pared celular de levadura. La adición de cisteína a altas densidades celulares
de la levadura reduce el tiempo de liberación de la enzima.

Una vez que se obtiene el extracto enzimático, se seleccionan las técnicas para
la purificación de la invertasa. En este caso el mejor método fue la precipita-
ción con etanol, estableciendo las condiciones para precipitar selectivamente
a la invertasa, dejando en solución algunas proteínas contaminantes. El eta-
nol ha sido empleado por varias décadas como agente precipitante de proteí-
nas. La obtención de proteínas puras de una mezcla compleja se facilita por

8
la influencia de factores como el pH, la fuerza iónica, la temperatura y la con-
centración de proteínas sobre la acción precipitante del etanol. Además de
interaccionar con otras variables, este disolvente por sí mismo causa precipi-
tación de proteínas ya que disminuye significativamente la constante dieléc-
trica de las soluciones acuosas.

El precipitado se recupera por centrifugación, se disuelve con un regulador

específico, para cuantificar la actividad volumétrica y concentración de pro-
teína.

Objetivo

Realizar la extracción y purificación parcial de la invertasa de Saccharomyces

cerevisae.

Desarrollo experimental

A) Extracción de la enzima con cisteína

Preparar 200 mL de una suspensión de la levadura de panificación de apro-

ximadamente 200 g/L (considerar que la levadura tienen un 70% de hume-
dad) utilizando como disolvente una solución reguladora de fosfatos de 0.1M
pH 7.2, adicionar la cisteína a una concentración de 0.25% (p/v) disolverla
en la suspensión de la levadura e incubarla a temperatura ambiente por 24
hora. Trabajar un control sin la adición de cisteína.

Transcurrido el tiempo hacer una dilución 1:100 de la suspensión de la leva-

dura tratada y sin tratar con cisteína. Centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos
20 mL de la dilución. Recuperar el sobrenadante y el paquete celular llevarlo
a 20 mL con agua destilada. Medir la actividad de la invertasa en los sobre-
nadantes y en los paquetes celulares.

B) Purificación parcial de la enzima

9
Recuperar por centrifugación (3500 rpm por 10 minutos) 20 mL del sobre-
nadante de la suspensión que fue tratada con cisteína. A este sobrenadante
se le llamará extracto crudo y se le determinará actividad de la invertasa por
el método de la glucosa-oxidasa y concentración de proteína por el método
de Lowry.

Se colocan 10 mL de extracto crudo en un baño de hielo y se le adicionan 4

volúmenes de etanol muy lentamente y con agitación continua. La precipita-
ción ocurre inmediatamente. El precipitado se recupera por centrifugación a
3500 rpm por 5 minutos. Este precipitado se disuelve en un volumen exacto
de regulador Tris-HCl 50 mM pH 7.2. Al sobrenadante y al precipitado ya
disuelto medirle la actividad de invertasa y la concentración de proteína.

Métodos analíticos

Determinación de la actividad de invertasa por el método de la glucosa-oxi-

dasa.

Reactivos:

a) Solución enzimática: a un litro de regulador de fosfatos 0.1 M pH 7.2 se

le adicionan 5 mg de peroxidasa (Sigma) y 1 mL de la enzima glucosa-
oxidasa (Sigma).
b) Solución de o-dianisidina: 300 mg de o-dianisidina se disuelven en 50
mL de agua destilada.
c) Mezcla enzimática: 20 mL de reactivo “a” más 1 mL del reactivo “b”
(prepararla al momento de usarla).
d) Solución de sacarosa 0.5 M
e) Solución de HCl 6 N
f) Regulador de acetatos 0.1 M pH 4.5

Procedimiento:

10
Para la extracción medir 50 μL de los paquetes celulares y 100 μL de los so-
brenadantes, adicionar 100 μL del reactivo “f” y a tiempos adicionar 50 μL de
reactivo “d”, incubar a temperatura ambiente por 10 minutos, después adi-
cionar a los mismos intervalos de tiempo 2 mL del reactivo “c” y se deja a
temperatura ambiente por 10 minutos, transcurrido este tiempo la reacción
se detiene adicionando a tiempos 2 mL del reactivo “e”. El color desarrollado
se lee en un espectrofotómetro a 540 nm.

Para ajustar el aparato se usa un blanco de reactivos siguiendo el mismo pro-

cedimiento empleando agua destilada en lugar de muestra. También se desa-
rrolla la reacción a un control de glucosa 2 mM. Una unidad de invertasa se
define como un micromol de glucosa liberado por minuto en las condiciones
de ensayo.

Para la purificación se sigue el mismo procedimiento, pero el extracto crudo

y el precipitado ya disuelto con el regulador Tris se diluyen 1:100 y en el so-
brenadante se determina la actividad sin diluirlo. Se emplean 100 μL de las
muestras para medir la actividad.

Determinación de proteína por el método de Lowry

Reactivos
A: solución de carbonato de sodio al 2% en hidróxido de sodio 0.1 N
B: solución de tartrato de sodio y potasio al 1% en sulfato cúprico al 0.5%
C: se mezclan 50 mL de A con 1 mL de B (prepararlo al momento de usarse)
D: reactivo de Folín-Cicoalteu diluido 1:2 con agua destilada.

Procedimiento:

Diluir el extracto crudo 1:20 y el sobrenadante y la invertasa 1:10. Tomar 500

μL de las muestras diluidas adicionarles 5 mL del reactivo C, se incuban a
temperatura ambiente por 10 minutos, pasado este tiempo se adicionan 0.5
mL del reactivo D, la mezcla se agita y se esperan 30 minutos para leer el
color desarrollado en un espectrofotómetro a 500 nm. De la misma manera

11
se prepara un blanco de reactivos, sustituyendo la muestra por agua destilada
y un control utilizando una solución de albúmina de bovino de 0.5 mg/mL
tratado en forma similar.

Informe

1.- Elaborar un cuadro comparativo de la actividad enzimática en el sobrena-

dante y el paquete celular antes y después de la extracción.

2.- Determinar el % de liberación de la enzima durante la extracción.

3.- Determinar la eficiencia de recuperación de la enzima durante la purifica-

ción.

4.- Determinar el grado de purificación relativo de la invertasa.

5.- Discusión y conclusiones.

Bibliografía.

1. Ahuatzi C. D. Extracción y purificación de la invertasa de Candida utilis Y-

900.1992 .Tesis. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. IPN. México
2. Castro B.F. & Romero F. F. 1984. Cinética de acumulación de invertasa de levadu-
ras cultivadas en distintos sistemas fermentativos. Tesis licenciatura. Escuela Na-
cional de Ciencias Biológicas. IPN. México
3. De la Vega. G. M. & Paneque, A. 1990. Purification and properties of an eaxtra-
cellualr invertase from Acetobacter chroococum. Eyme Microbial Technol.
13:2677-271.
4. Versall M. S. & Hudson M. J. 1987. Separations for Biotechnology. Society of chem-
ical industry. London.
5. Heineman B.W. 1992 Product recovery in bioprocess technology. Open univertiteit
Nederland.
6. Harrison G. R., Todd P., Rudge R.S. & Petrides P.D. 2003. Bioseparations Science
and Engineering. Oxford University. New York.

12
 PRACTICA. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS DE HONGOS

GRUPO_____________________________EQUIPO______________________________FECHA_________________________

EXTRACCIÓN DE LA ENZIMA (DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD)

Muestra Dil. Vol. Regu. Sacarosa T1 Mezcla T2 HCl As 540nm Actividad volumé-
trica

Cg (2 mM)

PURIFICACION DE LA ENZIMA (ACTIVIDAD Y PROTEINA)

ACTIVIDAD
Muestra Dil. Vol. Regu. Sac. T1 Mezcla T2 HCl As 540nm Actividad volu- Actividad
métrica específica

Cg (2 mM)

PROTEINA
Muestra Dil. Vol. Reac “C” T1 Reac “D” T2 As 500 nm Concentración

Calbum (0.5 mg/mL)

13
 BIOPROCESO PARA LA PRODUCCIÓN DE ETANOL

Introducción

Una de las fermentaciones industriales de mayor importancia económica y

quizás la más antigua producida por el hombre, es la fermentación alcohólica,
que es la base para la producción de etanol, el cual se puede emplear como
disolvente en la industria química, como agente antiséptico, como biocom-
bustible, o por destilación de un mosto fermentado producir aguardiente u
otro tipo de bebida alcohólica como el ron, brandy, vodka, etc.

La forma tradicional de producción es llevada a cabo desde hace décadas por

Saccharomyces cerevisiae, levadura que mediante glucólisis o vía metabólica
Embden-Meyerhof-Parnas se realizan las reacciones enzimáticas que con-
vierten una mol de glucosa en dos moles de piruvato. Bajo condiciones anae-
róbicas el piruvato, es aún más reducido a etanol con liberación de CO2.
La estequiometría de la fermentación alcohólica fue propuesta por primera
vez por Nicolás de Saussure en 1808 (Tauber, 1983), y según sus mediciones
100 partes de azúcar forman 51.34 partes de etanol; sin embargo, este rendi-
miento puede variar en función del microorganismo utilizado, así como de
las condiciones de producción. (Hernández-Villa, 2016). Por cada mol de glu-
cosa se obtienen 2 moles de alcohol y 2 moles de bióxido de carbono.
C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2

La fuente de carbono más común para la producción de etanol, son las mela-
zas de caña. También se pueden emplear frutos, granos, tubérculos y agaves.
El uso de una u otra materia prima dependerá del producto que se desea y de
un estudio económico.
A continuación, en la Tabla 1 se presenta el tipo de bebida alcohólica según
la materia prima que se utilice.
14
Tabla 1. Materia prima utilizada para producir diferentes tipos de
bebidas.
Materia prima Bebidas naturales Bebidas derivadas
I.- Frutas
Uvas a) Vinos generosos Licores (bebidas natu-
b) Coñac rales con ingredientes
c) Brandy y endulzadas).
Manzana a) Sidra
Durazno, zarzamora, a) Licores
naranja, etc.

II.- Caña de azúcar

Piloncillo a) Aguardiente Licores
b) Ron

Melazas a) Aguardiente Licores

b) Ron

III.- Granos
Maíz glucosa a) Whisky Vodka
Ginebra
Cebada, maltosa y glu- a) Cerveza
cosa b) Whisky
Arroz a) Sake

IV.- Tubérculos
Remolacha a) Aguardiente

Papa a) Aguardiente
b) Whisky

15
V.- Agaves
Agave atrovirens a) Pulque
Agave azul a) Tequila
Agave esperrima ja- a) Mezcal
cobi
Agave a) Sotol

Objetivo
Realizar el bioproceso de producción de etanol a partir de piloncillo.

Desarrollo experimental
La práctica se efectuará en dos sesiones experimentales, de acuerdo a la pro-
gramación que le será entregada por el profesor responsable de la práctica,
siendo necesario trabajo extra clase para toma de muestra.

I. Primera sesión:

1. Upstream

a) Calcular la cantidad de piloncillo necesario para preparar 5L de medio

de cultivo a 18 °Brix.

b) Acondicionamiento de la materia prima

Triturar y disolver el piloncillo en caliente empleando agua destilada.

c) Preparación del medio de cultivo

Adicionar al jarabe de sacarosa las sales que se muestran en la tabla 2

Tabla 2. Medio mínimo mineral

(NH4)2SO4 0.300 g/L

16
 (NH4)2HPO4 0.240 g/L
MgSO4.7H2O 0.024 g/L

Es necesario ajustar el pH del mosto entre 4.5 y 5 con ácido sulfúrico concen-
trado y determinar los °Brix obtenidos.

d) Preparación del inoculo

Pesar 2 g de levadura fresca o 1 g de levadura liofilizada por cada litro de
mosto, colocarla en 1.5 L del medio de cultivo y activar a la levadura suminis-
trando aire estéril por 45 minutos.

2.- Fermentación

Con la levadura activa se inocula el resto del medio de cultivo, se toma la

muestra inicial, se tapa el recipiente con una gasa y se incuba a temperatura
ambiente, el bioproceso se monitorea periódicamente tomando muestra
cada 12 h durante 5 días.

Las muestras se conservan en refrigeración para su posterior análisis que se

realizará en la segunda sesión experimental.
A cada una de las muestras se les determina azucares reductores, °Brix, con-
centración celular y °Gay Lussac.

II Segunda sesión:
Se realizará a todas las muestras obtenidas de la fermentación alcohólica, los
siguientes análisis:

Azúcares reductores: Tomar 5 mL de muestra en un matraz volumétrico

de 100 mL, agregar 20 mL de agua y 1 mL de ácido clorhídrico concentrado,
poner a ebullición durante 5 minutos, en seguida agregar 20 mL de agua des-
tilada y 1.5 mL de hidróxido de amonio concentrado y llevar a 100 mL con
agua destilada. Con esta solución titular “en caliente” el reactivo de Fehling
(5 mL de solución “A” más 5 mL de solución “B” más una gota de azul de

17
metileno al 1 %, adicionar 20 mL de agua destilada en un matraz Erlenme-
yer). Para cuantificar el azúcar presente es necesario conocer el factor de la
solución de Fehling y las diluciones que se hayan hecho.

Concentración celular: En un matraz aforado de 100 mL, colocar 5 mL

de muestra, agregar agua destilada hasta el aforo, colocar una gota de la sus-
pensión celular en la parte central de la cámara de Neubauer y realizar la
cuenta al microscopio. El resultado multiplicarlo por 20 que es la dilución.

3.- Downstream
Destilación simple
En un matraz balón de 1 L, colocar 100 mL de muestra (15° C o 20° C), más
100 mL de agua destilada. Destilar lentamente, recibiendo el destilado en
un matraz volumétrico de 100 mL, éste se sumerge en un recipiente con
hielo. Recoger el destilado hasta 2 mL antes del aforo, completar con agua
destilada, homogeneizar y medir el grado alcohólico con un densímetro Gay
- Lussac, y la temperatura (corregir por temperatura y referir la lectura Gay
– Lussac a 15° C).

Informe
1. Diagrama de bloques para el bioproceso que incluya las operaciones unita-
rias utilizadas a nivel industrial, mencionando las corrientes de salida y
subproductos.
2. Reportar en una tabla la concentración celular, concentración de sustrato
y la concentración de etanol, en función del tiempo.
3. En una gráfica reportar el comportamiento de la concentración celular, la
concentración de azucares residuales y la producción de etanol en función
del tiempo, en el cultivo por lote empleando S. cerevisiae.
4. Calcular el rendimiento experimental global de producción de etanol y
compararlo con el valor teórico.

18
5. Discusión y conclusiones

Bibliografía

1 Amerine, M.A. 1974. Análisis de vinos y mostos. Acribia. España.

2 Hernández-Villa. 2016. Int. J. Chem. React. Eng. 14(6): 1265-1275.
3 Pirt, S.J. 1975. Principles of microbial and cell cultivation. Blackwell Scientific Pub-
lications. London.
4 Madigan, M. T, Martinko, J. M. y Parker, J. 2004. Brock Biología de los microor-
ganismos, 10a Ed., Pearson educación, Madrid, España, 1064 pp.
5 Prescott, S.C. & Dunn C.G. 1962. Microbiología Industrial, 3ª edición Aguilar, Ma-
drid.
6 Tauber, H. 1983. Enzyme Technology. John Wiley and Sons Inc., New York. 282-
283
7 Varnam, A. & Sutherland, J. 1997. Bebidas, tecnología, química y microbiología.
Acribia. España.

19
 ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Introducción

Una esterilización adecuada del medio de cultivo es importante para garan-

tizar el éxito de muchas fermentaciones industriales. Para lograr este propó-
sito, se emplea cualquier método capaz de destruir o separar a los microor-
ganismos contaminantes indeseables. La técnica más común es la destruc-
ción de los microorganismos contaminantes. El término destrucción, en este
caso, significa la pérdida de viabilidad del microorganismo. La destrucción
de microorganismos se puede llevar a cabo por varios métodos:

a) Calor, ya sea seco o húmedo

b) Agentes químicos
c) Radiaciones
d) Vibraciones sónicas

El método más comúnmente utilizado para medios líquidos es el de calor hú-

medo, ya que es simple, confiable y económico.

I.- Cinética de muerte térmica de microorganismos.

1.1. Velocidad de muerte

Generalmente se clasifica la velocidad de muerte de los microorganismos en:

velocidad de muerte logarítmica y velocidad de muerte no logarítmica.

1.1.1. La velocidad de muerte logarítmica se puede expresar matemática-

mente mediante la ecuación:
dN
- _____ = kN (1)
Dt

20
 N
ln _____= -kt (2)
N0

N
____= exp (-kt) (3)
N0

La ecuación (3) se ilustra gráficamente en la figura (1) y describe apropiada-

mente la cinética de muerte térmica de células vegetativas.

1.1.2. Velocidad de muerte no logarítmica:

Este tipo de comportamiento de muerte térmica se encuentra a menudo en

esporas bacterianas. Se proponen varias explicaciones para esta conducta:
germinación de esporas, técnicas experimentales deficientes, impactos múl-
tiples para la inactivación y eventos secuenciales en la inducción de muerte.
El modelo de eventos secuenciales propone que la muerte ocurre de la si-
guiente manera:
kR kS
NR  NS  ND (4)

Se propone que una espora resistente NR sufre inactivación o muerte a un

estado final ND a través de un intermediario sensible NS.

Se establecen las ecuaciones diferenciales:

dNR
____ = - kR NR (5)
dt

dNS
_____ = kR NR – kS NS (6)
dt
La solución a estas ecuaciones diferenciales simultáneas es:

21
 N kR kS
____= ______ exp (kSt) ___ exp (- kRt) (7)
N0 kR - kS kR

Si se hace la gráfica de la ecuación (7) utilizando constantes cinéticas adecua-

das se obtiene una serie de curvas como las que se muestran en la figura 2.

1.2. Efecto de la temperatura sobre la cinética de muerte:

Considerando la muerte térmica de los microorganismos de manera similar

a las reacciones químicas, la relación entre las constantes cinéticas y la tem-
peratura presenta un comportamiento análogo. La teoría más frecuente-
mente empleada es la teoría de Arrhenius.

Esta relación se expresa matemáticamente como:

k = A exp (- E/RT) (8)

II.- Esterilización por lote

En el proceso de esterilización por lote, el medio se coloca en el fermentador

y el contenido se calienta a la temperatura de esterilización asignada. Para
establecer la relación entre el tiempo y temperatura se puede utilizar la ecua-
ción (1):

dN
- _____ = kN
dt

Sin embargo, k durante la esterilización por lote no es constante ya que la

temperatura durante el calentamiento y enfriamiento varían. Incorporando
el efecto de la temperatura establecido por la ecuación de Arrhenius la ecua-
ción queda:

22
 N0
total = ln ___ = A 0t exp (- E/RT) dt (9)
N

El símbolo  representa el criterio de diseño del proceso.

El ciclo de esterilización está formado por tres períodos:

a) Elevación de temperatura o calentamiento.

b) Mantenimiento de temperatura.
c) Descenso de temperatura o enfriamiento.

El perfil temperatura – tiempo durante la fase de calentamiento es función

de varios factores por ejemplo: la forma en que se lleva a cabo el calenta-
miento, ya sea inyección directa de vapor, calentamiento indirecto a la cha-
queta, mediante serpentines o eléctricamente.

Figura 1. Velocidad de muerte para células vegetativas de Escherichia coli

Este tipo de comportamiento se ilustra en la siguiente figura:

23
Figura 2. Velocidad de muerte en esporas bacterianas de B. stearothermophilus

24
TIPO DE TRANSFE- RELACIÓN DE
RENCIA DE CALOR TEMPERATURA – ayb
TIEMPO
hs
T=T0 1+ at a= -------------
Adición de vapor al 1+bt MT0 C
medio
(Hiperbólica) s
b= -----------
M

Calentamiento con T=T0 ( 1+at ) q

dispositivo eléctrico a = ------------
(Lineal) MT0C
Ua’
Calentamiento con T=TH ( 1+be-at ) A = --------------
vapor (Intercam- MC
biador de calor) (Exponencial)
T0 - TH
b=-----------------
TH

-Ua’

Enfriamiento (In- WC’ ( 1-e WC’ )

tercambiador de ca- T=TCO ( 1+be-at ) a= --------
lor) MC

T0 - TCO
b= ---------------
TCO

25
En la gráfica 3 se muestra el perfil típico temperatura – tiempo para un ciclo
de esterilización por lote.

Figura 3. Perfil temperatura – tiempo para un ciclo de esterilización por lote.

Con calentamiento de vapor a la chaqueta.

Objetivo

El alumno diseñará el ciclo de esterilización por lote adecuado para un medio

de cultivo determinado.

Desarrollo experimental y Metodología.

Material y equipo:

 Fermentador New Brunswick, con condensador.

 Cronómetro
 Cajas de Petri estériles
 Pipetas estériles

26
  tubos de dilución con agua estéril
 Agar nutritivo.
 Mechero
 Esporas de Bacillus subtilis

Desarrollo experimental

1. Una vez montado el vaso que contenga 20 litros de agua, inocular con
esporas de Bacillus subtilis.
2. Anotar los datos de tiempo y temperatura durante todo el ciclo de este-
rilización, en intervalos de un minuto.
3. Tomar cuatro muestras a diferentes tiempos, al principio del ciclo (N0),
al final del período de calentamiento (N1), al final del período de man-
tenimiento (N2), y al final del período de enfriamiento (N3).
4. Determinar las esporas inactivadas. De cada una de las muestras toma-
das, se hacen diluciones y se siembran por duplicado en cajas de Petri
utilizando la técnica de vaciado en placa. Se incuban a 30°C, hacer
cuenta de colonias cada 24 h, durante tres días.

Muestra Dilución
N0 10-1 10-5
N1 10-1 10-4
N2 10-1 10-3
N3 10-1 10-2

Informe

1. Trazar la curva de temperatura en función del tiempo para el ciclo de

esterilización.

27
 2. Con los valores N0, N1, N2 y N3 determinar el valor del criterio de di-
seño para el calentamiento, mantenimiento, enfriamiento y el valor
del criterio de diseño total.

3. En el período de mantenimiento donde k es constante, determinar el

valor de la energía de activación conociendo el valor de la constante
de Arrhenius A= 7.94 x 1038 min-1

4. Elaborar una tabla de valores de k en función del tiempo y trazar la

gráfica.

5. Obtener los valores de los criterios de diseño para el calentamiento,

mantenimiento, enfriamiento y el total por integración gráfica de la
curva anterior.

6. En caso de que la esterilización haya sido deficiente, recalcular el

tiempo de mantenimiento, suponiendo los criterios de diseño de ca-
lentamiento y enfriamiento constantes y una población final de mi-
croorganismos viables de 10-3 (probabilidad de que en mil fermenta-
dores, uno resulte contaminado).

7. Discusión y Conclusiones

Nomenclatura

a‘ – Área de transferencia de calor, 0.267 m2

A – Constante de Arrhenius, min-1
C – Calor específico del medio, kcal/kg C
C’ – Calor específico del elemento enfriador, kcal/kg C
E – Energía de activación, cal/g mol, kcal/kg mol
h – Entalpía relativa al medio, kcal/kg
k – Constante específica de velocidad de muerte, min-1
kR – Constante específica de inactivación de esporas resistentes
kS – Constante específica de intermediarios sensibles

28
M – Masa inicial de medio, kg
N – Concentración de microorganismos en el tiempo t
N0 – Concentración de microorganismos en el tiempo t0
N1 – Concentración de microorganismos en el tiempo t1
N2 – Concentración de microorganismos en el tiempo t2
N3 – Concentración de microorganismos en el tiempo t3
ND – Concentración de esporas inactivas
NR – Concentración de esporas resistentes
NS – Concentración de esporas sensibles
q – Velocidad de transferencia de calor, kcal/seg
R - Constante universal de los gases, 1.98 cal/g mol°K
s – Gasto masa de vapor, kg/seg, kg/h, kg/min.
t – Tiempo, min, h
T – Temperatura absoluta, °K
T0 – Temperatura inicial del medio, °K
TH – Temperatura de la fuente de calentamiento, °K
TCO – Temperatura de la fuente de enfriamiento, 293 °K
U – Coeficiente total de transferencia de calor, kcal/m2h°C
W – Gasto masa del elemento enfriador ( 20 L/min.)

Bibliografía.

1. Abbot, F.J. & Clamen, A. 1973. Biotechnol. Bioeng. 15: 117 – 127.
2. Bailey, J.E. & Ollas, D.F. 1977. Biochemical Engineering Fundamentals.
McGraw – Hill, Co. Inc.
3. Deindoerfer, F.H. & Humphery, A.E. 1959. Appl. Microbiol. 7: 256 –
264.
4. Richards, J.W. 1968. Introduction to industrial sterilization. Academic
Press. New York.
5. Wang, I.C.D. & col. 1979. Fermentation and Enzyme Techonology. John
Wiley, N. Y.

29
TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES INDUSTRIALES

Introducción

Las características de los efluentes industriales son muy variadas. El impacto

de las descargas industriales depende no sólo del contenido de sólidos en sus-
pensión y del valor de la demanda química de oxígeno (DQO), sino de la pre-
sencia de substancias específicas que deben ser eliminadas con tratamientos
particulares para cada tipo de contaminante químico.

Los contaminantes químicos, generados por la actividad industrial, al ser ver-

tidos al ambiente, generalmente deterioran la vida vegetal y animal y causan
daños a la salud humana. A pesar de su enorme variedad, los considerados
como contaminantes mayores son fundamentalmente: metales pesados, hi-
drocarburos aromáticos, disolventes orgánicos y compuestos organohalo-
genados.

En varios efluentes industriales, como es el proceso de cocción y blanqueo de

la pulpa de papel se producen aguas residuales con alto contenido de fenol y
clorofenoles. En la industria textil, específicamente en el proceso de tinción
de fibras sintéticas de tipo acrílico se emplean compuestos fenólicos en con-
junción con los tintes.

También se liberan aguas residuales con niveles importantes de compuestos

fenólicos en la industria de la piel, en la preservación de la madera, en la fa-
bricación y utilización de insecticidas o herbicidas y en la industria petroquí-
mica básica.

Las compañías destiladoras de alcohol, desechan residuos de la destilación

conocidos como vinazas, que representan un problema por su elevada carga
de contaminantes. Las vinazas usualmente contienen diversos compuestos
fenólicos que inhiben el proceso de biodegradación del efluente concentrado,
además de tener actividad antimicrobiana.

30
La ingestión de agua contaminada con fenol produce malestar, dolor, conmo-
ción e irritación renal y se han detectado como posibles compuestos carcino-
génicos y mutagénicos.

Estas características incrementan la peligrosidad de estos compuestos y por

lo tanto, el interés de implementar sistemas de tratamiento de aguas residua-
les que permitan disminuir el problema de contaminación de los cuerpos de
agua con estos compuestos.

Con el propósito de reducir el problema de contaminación y el costo del tra-

tamiento biológico de efluentes industriales es recomendable procesarlos in
situ, antes de que se mezclen con aguas de distinta composición, dificultando
la eliminación económica de sus componentes.

Los procesos para tratamientos de residuos fenólicos son básicamente fisico-

químicos y biológicos. Entre los primeros pueden citarse la oxidación con
ozono, peróxido de hidrógeno y bióxido de cloro. Una de las principales difi-
cultades para el tratamiento biológico de esta clase de efluentes es, además
de su elevada DQO, su toxicidad.

En general todos los microorganismos presentan un cierto grado de inhibi-

ción por fenoles, que también poseen propiedades bactericidas. La dosis letal
varía con cada especie, pero en general las especies microbianas presentes en
los lodos activados son muy sensibles, por lo que es recomendable el trata-
miento de estos efluentes in situ, esto es, en la propia planta donde se produ-
cen empleando microorganismos capaces de degradar estos compuestos fe-
nólicos.

La mayor parte de los microorganismos que degradan estos compuestos son

bacterias del género Pseudomonas, como P. picketti, P. aeruginosa, P. cepa-
cia, P.putida, bacterias del genero Ancylobacter, Methylobacterium, Rhodo-
coccus, hongos filamentosos como Geotrichum candidum, Tremeter versi-
color y levaduras como Candida tropicalis y C. maltosa.

31
Existe una gran variedad de sistemas para el tratamiento biológico de efluen-
tes, en donde se pretende mantener en el reactor una alta concentración de
biomasa reactiva (biocatalizador). De los reactores utilizados, se han prefe-
rido los conocidos como torres de contacto gas-líquido (TCGL) debido a su
economía de aireación (kmol O2/HP h). Aunque en general, en la torres de
contacto se obtienen valores inferiores del coeficiente volumétrico de trans-
ferencia de oxígeno (kla), su uso ha sido cada vez más extendido en el trata-
miento biológico de aguas residuales por la simplicidad de su diseño, opera-
ción sencilla y económica.

Objetivo

Evaluar la capacidad de C. tropicalis para degradar efluentes contaminados

con fenol.

Desarrollo experimental

Dado que esta levadura se separa fácilmente por flotación cuando se inyecta
aire al cultivo, se empleará un proceso por lote repetido usando una columna
de burbujeo, con una placa de vidrio poroso en la base del reactor y un tanque
para recepción y recirculación de la biomasa que se separa por espuma.

El reactor de 750 mL de volumen de operación se inoculará con una suspen-

sión de la levadura previamente cultivada en fenol y se iniciará el proceso
recirculando el medio del tanque de recirculación (de un volumen de opera-
ción de 350 mL). En la figura 1 se muestra un esquema del sistema utilizado.
Se toma una muestra inicial y después de cada hora para analizar la concen-
tración de fenol por el método de la 4-aminoantipirina y concentración celu-
lar por absorbencia a 600 nm y por peso seco.

Una vez agotado el fenol, se recambiará el medio agotado del tanque de re-
circulación por una nueva concentración inicial de fenol y se iniciará nueva-
mente el proceso.

32
 Venteo

Salida

Aire Venteo

Columna de burbu-
jeo

Recirculación
Agitador
Bomba magnético
peristáltica
Tanque de colección

Figura 1. Diagrama esquemático de una columna de burbujeo operando en un sistema por

lote repetido con recirculación externa.

Métodos analíticos
a) Determinación de peso seco.
Para cada muestra utilizar una membrana de fibra de vidrio (Whatman
GF/A) a peso constante.
A través de cada una de ellas se filtran 10 mL de la suspensión celular con
ayuda de una bomba de vacío. Las membranas con la biomasa se secan a 95
°C hasta peso constante y por diferencia de peso se obtiene la concentración
celular en mg/L.
b) Determinación de fenol
Reactivos.
A. Regulador de fosfatos 0.1 M, pH 7.6
B. Hidróxido de amonio 2N
C. 4-aminoantipirina al 2% . Preparar al momento de usarse
D. Ferricianuro de potasio al 2%. Preparar al momento de usarse

Procedimiento: Diluir las muestras convenientemente de acuerdo a la con-

centración inicial de fenol. Tomar 100 μL de la dilución adicionar 900 μL del
reactivo A, 40 μL del reactivo B, 20 μL del reactivo C y finalmente 40 μL del
reactivo D, agitar y llevar a un volumen final de 3 mL con agua destilada.

33
Leer el color desarrollado a 510 nm, ajustando el espectrofotómetro con un
blanco de reactivos empleando agua destilada en lugar de muestra. Paralela-
mente correr un control de concentración conocida de fenol (50 ppm)

Informe
1. Tabular los resultados obtenidos de concentración de biomasa y fenol
residual en mg/L (ppm)
2. Calcular los siguientes valores:
a) eficiencia de remoción de fenol
b) velocidad volumétrica global de remoción de fenol
c) rendimiento celular global
3. Graficar la concentración celular y concentración de fenol en función
del tiempo
4. Calcular la velocidad específica máxima de crecimiento.
5. Calcular los siguientes valores en función del tiempo:
a) velocidad específica de crecimiento (μ en h-1)
b) velocidad específica de consumo de sustrato (qs en mg fenol/mg
célula h)
6. Calcular la energía de mantenimiento (m) y el rendimiento celular ver-
dadero (Yg)
7. Discusión y conclusiones.

Bibliografía
1. Ahmed, A.M. 1995. Phenol degradation by Pseudomonas aeruginosa. J. Environ.
Sci. Health.30:99-103.
2. Joo. H.T., Jiang L.H. & Tay S.T.L. 2204. High-rate biodegradation of phenol by
aerobic grown microbial granules. J. Envir. Engrg.130:1415.1423.
3. Hernández M. E. 1986. Degradación de fenol por Candida tropicalis. Tesis Licen-
ciatura. ENCB.
4. Ruiz J. C. 1998. Biodegradación de fenol por Candida tropicalis en torres de con-
tacto gas-líquido de múltiple etapa. Tesis de maestría. ENCB.

Práctica: TRATAMIENTO DE EFLUENTES INDUSTRIALES

34
Equipo_____________Grupo__________Fecha________

Concentración celular:

Tiempo (h) Muestra Dilución As 600 nm X (mg/L)

Factor para convertir absorbencia a concentración____________

Concentración de fenol residual

Tiempo (h) Muestra Dilución As 510 nm s (mg/L)

35