UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS
E.A.P Biología-Microbiología

INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO NO 03

“ANTIBIOGRAMA Y ESPECTRO ANTIBIÓTICO”

Curso: Microbiología Clínica

Estudiantes:

- Alfredo Jesús Quispe Zanga 2018-118001

Tacna – Perú

2022
 ““ANTIBIOGRAMA Y ESPECTRO ANTIBIÓTICO”

I. OBJETIVOS

 Conocer y realizar las pruebas de sensibilidad antimicrobiana por el método de

difusión en agar.
 Determinar la resistencia o sensibilidad de una bacteria frente a antimicrobianos.

II. MARCO TEORICO:

El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las

funciones más importantes de los laboratorios de microbiología clínica. Su realización se

desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo principal objetivo es

evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o varios

antimicrobianos, traduciendo, en una primera aproximación, su resultado como factor

predictivo de la eficacia clínica. El antibiograma define la actividad in vitro de un

antibiótico frente a un microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el

crecimiento de una bacteria o población bacteriana. Su resultado, la farmacología del

antimicrobiano, en particular en el lugar de la infección, y los aspectos clínicos del

paciente y de su infección, sustentan la elección de los antimicrobianos en el tratamiento

de las enfermedades infecciosas. Asimismo, ofrece, en su conjunto, elementos objetivos

de actuación en los tratamientos empíricos. El panorama actual de las resistencias de los

microorganismos a los antimicrobianos hace ineludible su determinación, incluso en

aquellos casos en los que la sensibilidad se considera universal y no se han descrito, por el

momento, mecanismos de resistencia. Cada laboratorio de microbiología establecerá

según su estructura, demanda asistencial y Política de Antibióticos un esquema de

organización y técnicas de trabajo que aseguren la realización e información posterior de

los antibiogramas. Los ensayos de sensibilidad han de estar convenientemente

 normalizados y sujetos a procesos de control que aseguren su reproducibilidad. Por el

momento no existe un método universal que reproduzca las condiciones en las que se

encuentra un microorganismo produciendo una infección y, por tanto, la situación ideal

en las que deben desarrollarse las pruebas de sensibilidad

III. MATERIALES Y METODO:

• Mechero

• Asa bacteriológica

• Placa Petri con agar Mueller Hinton

• Pinzas metálicas

• Autoclave

• Incubadora

• Hisopos estériles

• Tubos de ensayo con caldo tripticasa soya o solución salina fisiológica

• Muestra: Cepa bacteriana de Staphylococcus aureus

• Discos comerciales de Antibióticos: considerar el siguiente grupo de antibióticos para el

análisis de los resultados:

Grupo I:

o Oxacilina

o Penicilina

o Eritromicina

o Clindamicina

o Cotrimoxazol (Trimetoprim/Sulfametoxazol)
 o Vancomicina

o Gentamicina

o Ciprofloxacina

Grupo II:

o Cloramfenicol.

o Rifampicina.

o Tetraciclina.

o Teicoplanina

PROCEDIMIENTO

a. Preparación del Agar Mueller Hinton

• Preparar el medio a partir de la base deshidratada de acuerdo a las indicaciones del fabricante.

• Autoclavar y dejar enfriar en baño de agua hasta que alcance los 45°C - 50°C.

• Una vez esterilizado y solidificado, medir el pH del agar . El valor del mismo debe encontrarse

entre 7,2 y 7,4 a temperatura ambiente.

• Repartir el medio en placas Petri (60 ml – 70 ml o 25 ml – 30 ml, para placas de 150 mm o 100

mm de diámetro interno respectivamente), de manera que el grosor del agar en la placa sea de

4 mm.

b. Preparación del estándar (0,5 Mc. Farland) para el inóculo

• Para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato de bario (0,5 de la

escala de Mac Farland) como estándar.

• La Preparación del estándar de turbidez se hace de la siguiente manera:

a. Agregar 0,5 ml de una solución de BaCl2 0,048 M (BaCl22H2O al 1,175% P/V) a 99,5 mL de una

solución de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1% V/V) en constante movimiento para mantener la

suspensión.

b. Verificar la densidad correcta del estándar usando un espectrofotómetro, cuya absorbancia a

625 nm es 0,08 a 0,10 para el estándar 0,5 de Mc. Farland.

c. Distribuir de 4 ml a 6 ml en tubos con tapa de rosca o tapón de jebe, similares a los que se

usarán para preparar el inóculo.

d. Ajustar bien las tapas o tapones y conservarlos en la oscuridad a temperatura ambiente y

anotar la fecha de preparación.

e. Antes de ser usado agitar vigorosamente dicho estándar de preferencia, en un agitador

mecánico.

f. Verificar mensualmente la densidad de los estándares de sulfato de bario, y si hay alguna

alteración reemplazarlo.

c. Preparación del inoculo

• Seleccionar cuatro a cinco colonias (UFC) bien aisladas, del mismo tipo morfológico, de un

cultivo en placa.

• Tocar la superficie de cada colonia con una asa de siembra y transferirlo a un tubo que

contiene de 4 a 5 mL de caldo apropiado (Ej. Caldo Tripticasa soya, solución salina fisiológica

estéril

• Incubar el caldo a una temperatura entre 35°C a 37°C, hasta que alcance o exceda la turbidez

del estándar 0,5 de la escala de Mc. Farland (por lo general de 2 a 6 horas).

• Se prepara el inóculo con ajuste a la turbidez Mc Farland 0,5 que corresponde a un diámetro

de 1.5 x 10 UFC/mL, directo en el caldo de colonias frescas en agar no selectivo d. Siembra en la

placa Agar de Mueller Hinton

• Introducir un hisopo estéril en el tubo que contiene el inoculo.

• Por las paredes del tubo presionar en hisopo tratando de eliminar en exceso de muestra. Con

el hisopo sembrar en la placa de Agar Mueller Hinton, pasándolo uniformemente por toda la

superficie del agar en diferentes direcciones.

• Colocar los discos de antibióticos sobre la superficie del agar utilizando unas pinzas estériles y

apretándolos suavemente sobre la superficie del agar. Los discos deben estar distribuidos

uniformemente, de modo que estén a una distancia mínima de 25 mm uno del otro ( diámetro

de los discos según las normas de la OMS). Dejar las placas 15 minutos a temperatura ambiente

para que comiencen a difundir los antibióticos.

• Incubar la placa en posición invertida a 37ºC durante 18-24 horas.

• Medir los diámetros de los halos de inhibición usando una regla o un calibrador.

e. Interpretación de los resultados

• Los diámetros de los halos de inhibición se traducen a las categorías de resistente (R),

intermedio (I) o sensible (S).

IV. RESULTADOS:
Antibiogramas (agar Müeller Hinton). Fuente: Dr Graham Beards at en. wikipedia

Medición del halo de inhibición. Fuente: USCDCP, Pixnio.com

Expresión fenotípica de producción de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) en
una cepa de Escherichia coli. Fuente: Foto tomada por la autora MSc. Marielsa Gil

Las escalas de McFarland se preparan mezclando varios volúmenes de soluciones de ácido sulfúrico al 1%
y cloruro de bario al 1% para obtener diversos grados de turbidez que representan diferentes densidades
bacterianas. Después de mezclar estas soluciones, se forma un precipitado fino de sulfato de bario
causando turbidez en la solución final que es visualmente comparable a una suspensión bacteriana de
concentración conocida.
V. COMENTARIO:

Todo estudiante de biología sabe que la prueba de sensibilidad antimicrobiana es una de

las tantas armas con las que contamos en el laboratorio para controlar los procesos
infecciosos que se desarrollan en los pacientes

Pero para poder desarrollar todo el potencial con que se cuenta hay que cumplir con un
requisito fundamental: es necesario lograr el aislamiento del agente productor del
cuadro clínico mediante los cultivos correspondientes.

CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la importancia clínica del antibiograma?

El antibiograma es la prueba microbiológica que se realiza para determinar la

susceptibilidad de una bacteria de ser tratada con determinados antibióticos.
Ello reviste mucha importancia por cuanto es estas pruebas de sensibilidad
determinarán la eficacia que el antibiótico indicado tiene para combatir la
infección.

2. ¿Qué concentración de bacterias aproximada tiene la suspensión de bacterias que

se inocula para hacer un antibiograma por el método de disco-difusión?

aproxime a 5 x 105 UFC/mL

3. ¿Qué otros métodos se utilizan para realizar antibiogramas?

Para ello hay tres métodos: el de difusión, el de dilución y la microtitulación

4. Enumere las recomendaciones a tener en cuenta en un antibiograma.
o Utilizar las cepas control recomendadas para verificar que la prueba de
sensibilidad está correctamente realizada (ver tablas EUCAST Quality Control).
o Para confirmar la capacidad de la prueba para detectar mecanismos de resistencia
pueden utilizarse las cepas de control de calidad con mecanismos de resistencia
definidos
o Deben hacerse controles diarios, al menos de aquellos antimicrobianos que están
incluidos en los paneles de rutina.
o Cada día que se realicen controles de calidad, los resultados deben compararse
con los obtenidos en los 20 últimos controles consecutivos anteriores.