UNIVERSIDAD ANÁHUAC MAYAB

Escuela de medicina

Laboratorio de Ecología Humana
Prof. Pedro R. Aquino Hernández

Practica No. 4 Determinación de la sensibilidad antibacteriana Método de Kirby-Bauer. Antibiograma.

Grupo 2B Daniel Sánchez López Nikita L. Tejero Tun Pablo Noh Flores

Miércoles 23 de Marzo de 2011

Objetivo. 10 2 . 3 Pág. 7 Pág. 8 Pág. Métodos y procedimientos. Análisis y Discusión. Bibliografía. Pág. Presentación de resultados. Planteamiento del problema. 10 Pág.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 ÍNDICE Resumen. 7 Pág. Marco Teórico. 3 Pág. 8 Pág.

es capaz de inhibir el crecimiento in vitro de un inóculo bacteriano previamente estandarizado (concentración conocida de gérmenes). y en el 35. Resumen. Métodos cuantitativos son aquellos procedimientos que permiten determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración bactericida mínima (CBM). En este capítulo intentaremos desarrollar los diferentes métodos de estudio y las bases de la interpretación de los resultados obtenidos in vitro. procedimos a colocar en el agar las bacterias que se nos indicaron. y el microbiólogo que entre las suyas tiene las placas con el microorganismo responsable de una infección. El estudio de la sensibilidad bacteriana a los antibióticos es una de las funciones más importantes de los laboratorios de microbiología clínica. Antibiograma. las extendimos en el mismo y procedimos a colocarles el multisensidisco que contenía los antibióticos que se iban a probar en las bacterias. tanto a nivel hospitalario como comunitario Pero la determinación de la sensibilidad a antimicrobianos no implica solo realizar un conjunto de técnicas y medir los resultados. finalmente fue colocado en la incubadora para esperar que el antibiótico reaccionara con la bacteri. lo cual implica hablar el mismo idioma. al dia siguiente continuamos con la medición de los diámetros de las zonas de inhibición que nos indican que tan efectivo es uno u otro antibiótico. Clasificación Estos métodos pueden clasificarse en métodos cuantitativos y cualitativos. Se define CIM como la mínima concentración de antibiótico que en un período de tiempo predeterminado. Se define como CBM la mínima concentración de un antibiótico que en un período de tiempo predeterminado. es capaz de inducir la muerte in vitro del 99. Marco Teórico. Método de Kirby-Bauer. Es necesario saber interpretar los mismos y darles el significado que realmente tienen. cada vez más involucran información proveniente de ambos lados: el paciente y el microorganismo. Dentro de los beneficios que presenta se encuentran: ‡ Dirigir la terapéutica una vez que el germen es conocido ‡ Generar una base de datos que permita seleccionar los antibióticos a utilizar en un tratamiento empírico (aquel en que no conocemos el agente causal) ‡ Desarrollar políticas de uso de antimicrobianos ‡ Vigilar la aparición de nuevos mecanismos de resistencia ‡ Detectar precozmente la diseminación epidémica de una cepa.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 Determinación de la sensibilidad antibacteriana. Entre el médico clínico que tiene en sus manos un paciente. las diferentes estrategias bacterianas de supervivencia. debe haber buena comunicación.9% de una población bacteriana previamente 3 . Despues de la explicación del profesor sobre el procedimiendo adecuado que se debía seguir. Los parámetros que determinan los resultados de sensibilidad o resistencia. En el capítulo 34 se consideraron las características farmacocinéticas y farmacodinámicas para los principales grupos de antibióticos.

Si el pH es más alto se podrán esperar los resultados opuestos. La determinación de la CIM puede realizarse por micro o macro dilución en caldo. ya que no es lo mismo un microorganismo de crecimiento rápido que lento. b) Los medios de cultivo para realizar las pruebas. dilución en agar o E-test (marca comercial). etc. Para esto se considera que aquellas placas de 150 mm de diámetro deben llevar 60 a 70 ml del medio. exigente o no exigente. de manera de saber si nuestra metodología se realizó en forma correcta. de 4 . capaces de crecer en aerobiosis. también afecta los resultados de antibióticos como tetraciclinas. salvo que sean envueltas en bolsas de plástico para evitar la desecación. aminoglucósidos. Luego de preparado debe esterilizarse y cuando llega a una temperatura aproximada de 50° C debe ser repartido en las placas de Petri. produciendo alteraciones en las zonas de inhibición del crecimiento bacteriano en la placa. son adecuados para la mayoría de las bacterias patógenas en lo que a requerimientos nutricionales se refiere y existen suficientes datos recopilados que avalan su uso en las pruebas de sensibilidad. trimetoprim y tetraciclinas. Las placas deberán estar húmedas pero no mostrar gotas de agua en la superficie. y las que tienen 100 mm de diámetro deben llevar 25 a 30 ml. Describiremos aquí los métodos para el estudio de microorganismos no exigentes. El agar debe tener un pH 7. de manera que los resultados sean reproducibles y comparables. mientras otras como las tetraciclinas parecerán tener mayor actividad.2-7. son baratos. Dentro de los parámetros a estandarizar se encuentran los siguientes: a) El tipo de bacterias a estudiar. están estandarizados por el National Commitee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS). ‡ Humedad: si existe un exceso de humedad en la superficie del agar las placas deben ser incubadas a 35°C durante 10 a 30 minutos antes de utilizarse. Si el pH es demasiado bajo ciertas drogas como aminoglucósidos. De los medios disponibles se considera que tanto el agar como el caldo Mueller Hinton (MH) son los más apropiados para las pruebas de sensibilidad de rutina dado que muestran buena reproducibilidad entre los diferentes lotes comerciales. Estandarización Todos los métodos de estudio por nosotros utilizados. aerobio o anaerobio. Métodos cualitativos (disco difusión) son aquellos procedimientos que permiten clasificar directamente a un microorganismo como sensible o resistente. ‡ Efecto de la timina o timidina: los medios que contienen un exceso de timina o timidina pueden revertir los efectos inhibitorios de las sulfonamidas y triometoprim. El espesor del mismo debe oscilar entre 3 y 5 mm. aquellas con más de siete días de preparación no son adecuadas. algunos parámetros del medio se deben controlar en cada lote de uso. de crecimiento rápido. contienen bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas. como ser: ‡ pH: para cada lote debe ser controlado cuando se prepara el medio.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 estandarizada. quinolonas y macrólidos parecerán menos activas. El medio debe ser preparado según las indicaciones del fabricante.4 a temperatura ambiente. ‡ Cantidad de cationes divalentes: la variación de los cationes divalentes principalmente de Ca++ y Mg++. A pesar de estas cualidades. Las placas que no se usan en el día pueden mantenerse en el refrigerador. La realización de estos procedimientos requiere la utilización de cepas de control de calidad con resultados conocidos.

gradillas. Debemos fijarnos siempre en la fecha de vencimiento antes de usarlos. los discos pueden o no aparecer rodeados por una zona de inhibición de crecimiento bacteriano. Debemos controlar la esterilidad de cada lote incubando al menos una de sus placas 24 hs o más a 35°C. etc. el paciente no puede recibir dicha medicación (sensibilidad de S. aureus debe incubarse 24 horas completas. es uno de los métodos que el NCCLS recomienda para la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antibióticos. ‡ Cuando a pesar de conocerse la sensibilidad del germen a drogas altamente efectivas. Transcurridas 18 a 24 horas de incubación. es decir el operario puede controlar temperaturas. Deben ser sacados una o dos horas antes de su uso. Fundamento: el método de disco difusión consiste en depositar en la superficie de una placa de agar MH previamente inoculada con el microorganismo. Indicaciones: el antibiograma está indicado en las siguientes situaciones: ‡ Se aísla una bacteria responsable de un proceso infeccioso y no puede predecirse su sensibilidad. especialmente si se sabe que este tipo de bacteria puede presentar resistencia a los antimicrobianos más habituales. formándose un gradiente de concentración. Kirby y colaboradores. Partiendo de una muestra clínica siempre se debe realizar un cultivo puro para poder comenzar el estudio de la sensibilidad antibiótica. el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde por el agar. Materiales: suero fisiológico estéril o caldo de cultivo estéril. estados de los medios.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 lo contrario deben controlarse con los organismos de referencia. Para esto se utiliza la técnica de aislamiento en placas que contengan un medio adecuado para la cepa en estudio (al cual además se le deben otorgar las condiciones atmosféricas específicas de esa cepa). verificando si hay o no crecimiento de algún microorganismo contaminante. lo cual altera la velocidad de crecimiento bacteriano y su viabilidad. tiempos. aunque para la lectura de la meticilinorresistencia en S. d) La temperatura de incubación. A continuación destacaremos algunos de los métodos antes mencionados. ‡ En estudios epidemiológicos. Discos de antibióticos: los discos deben mantenerse en el freezer o en el refrigerador para mantener la actividad del antibiótico. aunque hasta el momento no se halla descrito mecanismos de resistencia para dicho organismo. Método de disco difusión Este es un método cualitativo. discos de papel de filtro impregnados con los diferentes antibióticos. pinzas estériles o dispensador. 5 . que se caracteriza por ser fácilmente estandarizable y que está indicado para microorganismos no exigentes de crecimiento rápido. ansa bacteriológica.. ‡ En el estudio de nuevos antibióticos. c) El tiempo de incubación: la mayoría de los resultados deben leerse entre 18 y 20 horas. Si bien estos parámetros pueden ser controlados físicamente. descartador. hisopos estériles. su fecha de vencimiento si se trata de discos. los controles de calidad se realizan utilizando cepas conocidas. pyogenes a eritromicina en pacientes alérgicos a la penicilina). estufa de 35°C. o su potencia si se trata de antibiótico como droga. e) El estado de los antibióticos. El antibiograma por disco difusión basado en el trabajo de Bauer. Tan pronto el disco impregnado en antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar.

barato y de fácil control y estandarización. Se toma con un asa bacteriológica tres o cuatro colonias morfológicamente similares y se suspenden en el tubo hasta alcanzar una turbidez comparable a la solución de Mc Farland 0. Procedimiento (como preparar el inóculo): existen dos formas básicamente de cómo preparar el inóculo. y en las placas de 100 mm no es aconsejable colocar más de 6.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 Patrón de turbidez: para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato de bario como estándar de turbidez que corresponde a un 0. ‡ Dejar secar 3 a 5 minutos antes de colocar los discos. lo que cambiaría las condiciones del medio y por lo tanto no serviría para la lectura de los halos. La densidad se corrobora con un espectrofotómetro. porque de lo contrario pueden haber problemas en la realización de las lectu.ras. En las placas de 150 mm no se colocarán más de 12 discos. Luego de preparado el patrón de turbidez se distribuye en tubos de ensayo (4 a 6 ml por cada tubo). Luego de preparado el inóculo bacteriano con la cepa en estudio se deben seguir los siguientes pasos: ‡ Introducir el hisopo estéril en el inóculo bacteriano preparado. Deben estar a más de 15 mm del borde de la placa y deben distribuírse de manera de que no haya superposición de los halos de inhibición. Método del medio de cultivo líquido o de Kirby-Bauer: con un asa bacteriológica se tocan cuatro o cinco colonias bien aisladas del mismo tipo morfológico y se inocula en 4 a 5 ml de caldo apropiado. Una ventaja 6 . Antes de retirarlo se debe escurrir sobre las paredes del tubo para retirar el exceso de líquido del mismo. Las placas deben colocarse en forma invertida para que el agua condensada no caiga sobre el agar. Luego se repite el procedimiento rotando la placa 60° en dos oportunidades más. Estos deben ser guardados a temperatura ambiente y protegidos de la luz. Para detectar la meticilinorresistencia las placas deben incubarse 24 hs completas. Ventajas: es un método sencillo.5 de Mc Farland). Luego de estar sobre el agar se debe presionar los discos levemente para que queden adheridos al mismo. Estos deben ser colocados con dispensador o pinza estéril. 2. como caldo MH. de manera de embeberlo completamente. ‡ Luego de colocados los discos las placas deben incubarse a 35ºC a 37°C en grupos no mayores a cinco placas durante 18 hs. para lo cual se estría con el hisopo en forma paralela y bien compacta abarcando toda la superficie de la misma. Medio: placas de agar MH. Deben extremarse los cuidados en sembrar las placas de borde a borde. Esta turbidez corresponde a 1. Método de suspensión directa de colonias o Kirby-Bauer modificado: se colocan entre 4 y 5 ml de suero fisiológico estéril en un tubo de ensayo. La turbidez se ajusta con suero fisiológico estéril o caldo para obtener una turbidez visualmente comparable a la de un estándar preparado previamente (llamado 0. Para ello se miran ambos tubos al mismo tiempo contra un fondo blanco con una línea negra como contraste Este método es recomendado cuando el cultivo tiene más de 24 hs de incubación.5 x 108 UFC/ml. Los cultivos de caldo se dejan incubar a 35°C hasta que aparece una turbidez ligeramente visible (generalmente 2 a 5 hs). 1. ‡ Colocar los discos. ‡ Sembrar la placa de MH de manera de obtener un crecimiento confluente.5 del nefelómetro de McFarland. Este estándar debe agitarse antes de usar y ser comparado en forma visual con el inóculo preparado.5.

Estos datos se encuentran en tablas de la NCCLS.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 Adicional del método y específicamente del medio. es que se le pueden realizar algunas modificaciones en cuanto a los requerimientos nutricionales para poder llevar a cabo el antibiograma con microorganismos exigentes o muy exigentes que necesitan más nutrientes que los que este medio les puede ofrecer. de lo contrario podremos concluir que existe alguna variable que está cambiando las condiciones en que debe ser realizado el procedimiento. se realiza para una cepa control. etc. Al igual que para las ATCC. Muchas veces estos agregados generan cambios conocidos en los halos de inhibición del crecimiento bacteriano. Se conocen y se han establecido los rangos de diámetros en el que debe estar la zona de inhibición de crecimiento bacteriano si las condiciones del procedimiento son las adecuadas.5 de la escala de Mc Farland). definen categorías de resistencia. Se debe verificar que los diámetros de inhibición del crecimiento bacteriano de los discos de antibióticos entren dentro de los establecidos en las tablas. una marca registrada (American Type Culture Collection). existen tablas proporcionadas por la NCCLS que según el diámetro del halo de inhibición de crecimiento bacteriano. Para llevar a cabo eficientemente este control de calidad al mismo tiempo que se realiza el procedimiento para la cepa en estudio. 7 . pneumoniae. Planteamiento del problema. microorganismo exigente para el cual se puede hacer un agregado de sangre de oveja desfibrinada en una concentración al 5%. Estas son cepas conocidas. Estas cepas son denominadas ATCC. Un ejemplo claro es S. de las cuales se sabe su patrón de resistencia o sensibilidad. c) alteraciones en más o en menos en el inóculo (patrón de turbidez 0. b) inadecuada composición y espesor del medio. Control de calidad Para proceder a la lectura de los antibiogramas debemos previamente asegurarnos que se cumpla un estricto control de calidad para supervisar la exactitud y fiabilidad de la metodología. para asi poder darle el mejor servicio de salud que podamos. Es muy importante como médicos conocer el mejor tratamiento disponible para nuestro paciente. sensibilidad y sensibilidad intermedia. Las cepas control utilizadas serán las recomendadas por la NCCLS. Es por esto que esta prueba es muy útil a la hora de preescribir un medicamento ya que es una fuente confiable sobre la eficacia del mismo sobre la enfermedad u organismo al que queremos atacar con el fármaco. d) problemas con el tiempo o temperatura de incubación. La lectura se realiza a través de la medición de los halos de inhibición. Esto se realiza debido a que existe un gran número de variables que pueden afectar los resultados dentro de las que se destacan: a) actividad de los discos (cuidar que no estén vencidos o que pierdan su carga por almacenamiento incorrecto). MEDICIÓN DE LOS HALOS E INTERPRETACIÓN DE LOS MISMOS Luego de corroborar que las cepas ATCC se encuentran en rango procedemos a realizar la lectura de los antibiogramas.

¿Cuáles fármacos inhiben el crecimiento de la colonia y en que medida?. 2. 3. procurando quitar el exceso de líquido oprimiéndole con las paredes del tubo. Después de 24 horas de incubación sacar las cajas de la estufa bacteriológica. 5. 6. Materiales y y y y y Solución salina normal o medio de nutrientes Placas de agar Muller Hinton Mechero tipo Fisher Multisensidisco para Gram positivos y Gram negativos Pinzas Método: 1. ¿Cuál es el efecto que ejerce cada fármaco sobre el crecimiento de la colonia?. 8 . puede aparecer un pequeño halo aun siendo resistente esto se debe a la alta concentración de antibiótico en el medio inmediato del disco. Utilizamos unas pinzas para poner los multidisco sobre el agar. Conocer el método más eficaz y usado actualmente en el ámbito de la medicina asi como reconocer la sensibilidad de ciertas bacterias hacia los antibióticos mas usados en el campo clínico. ¿la colonia es resistente a algún fármaco? Con las preguntas anteriores se plantean las dudas generales sobre la eficacia antibacteriana de los 12 farmacos puestos a prueba. observar el crecimiento bacteriano y medir los diámetros de las zonas de inhibición en mm. el tamaño del halo nos va a permitir conocer el grado de sensibilidad al antibiótico o si es resistente. Con el hisopo extendemos bien el inoculo por toda la superficie de la placa del agar muller hinton 4.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 -Se hizo una prueba de sensibilidad antibacteriana. Con el hisopo estéril tomamos una muestra. Objetivos. Métodos y procedimiento. contenida en un tubo de ensayo. Finalmente incubar 24 horas a 37C y en posición invertida tras la incubación va a parecer toda la superficie llena de colonias y alrededor de cada disco aparecerá o no un halo de inhibición dependiendo si el germen es sensible hacia ese antibiótico. Partimos de un cultivo puro de 48 horas tomamos una colonia con el asa bacteriológica y la disolvemos en 1 ml de solución salina normal o en un medio con nutrientes como el BHI.

AK AM LEV CF CTX CRO CL GE NET NF FEP SXT Amikacina Ampicilina Levofloxacina Cefalotina Cefotaxima Ceftriaxona Cloranfenicol Gentamicina Netilmicina Nitrofurantoina Cefepime Trimetropin sulfametoxazol 30 µg 10 µg 5 µg 30 µg 30 µg 30 µg 30 µg 10 µg 30 µg 300 µg 30 µg 25 µg Resistente ” 14 ” 13 ” 13 ” 14 ” 14 ” 13 ” 12 ” 12 ” 12 ” 14 ” 14 ” 10 Intermedio 15-16 14-16 14-16 15-17 15-22 14-20 13-17 13-14 13-14 15-16 15-17 11-15 Sensible • 17 • 17 • 17 • 18 • 23 • 21 • 18 • 15 • 15 • 17 • 18 • 16 17 mm 0 25 mm 0 30 mm 26 mm 20 mm 21 mm 17 mm 17 mm 28 mm 27 mm Sensible a 10 de los 12 antibioticos de los cuales el mas eficiente es el Levofloxacina ya que en pocas dosis causa un gran efecto inhibidor.9). se define como la mínima concentración de antimicrobiano que elimina a más del 99. La Salmonella es resistente a dos de los doce fármacos: a la Ampicilina y a Cefalotina en los cules el alo de crecimiento fue nulo.-¿Qué es la concentración bactericida mínima (CBM)? R= La Concentración Mínima Bactericida (CMB).-¿Qué se entiende por poder bactericida del suero? R= (PODER BACTERICIDA DEL SUERO) Es la mayor dilución de un ATB en el suero del paciente. Preguntas de revisión. 2. en microbiología. 1. La concentración mínima inhibitoria es importante en diagnósticos de laboratorio para confirmar la resistencia de microorganismos a un agente antimicrobiano y además para monitorizar la actividad de los nuevos agentes antimicrobianos.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 Presentación de resultados. 4.9 % 9 .9% de los microorganismos viables después de un tiempo determinado de incubación (generalmente 24 horas) (8. capaz de matar al inóculo en un 99.. es la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de su incubación. capaz de inhibir el desarrollo visible de un microorganismo.-¿Qué es el poder inhibitorio del suero (PIS)? R= (PODER INHIBITORIO DEL SUERO) Es la mayor dilución de un ATB en el suero del paciente. 3.¿Qué se entiende por concentración inhibitoria minima (CIM)? R=La Concentración mínima inhibitoria (CMI).

y R. V. y donde se puede definir alguna regla que permita la toma de decisiones rápida. Metodos de estudio de la sensibilidad antibiótica. Esta especie de Salmonela no es suseptible a las betalactamasas. en las cuales hay muchos factores involucrados. Según la pruebas del antibiograma la salmonella es resistente a la ampicilina y a la cefalotina siendo etas dos betalactamasas. se necesita tener en cuenta una amplia base de datos históricos. 10 . Vignoli. gracias a esta prueba se puede conocer con mayor seguridad el fármaco que actúa mejor sobre determinada bacteria para así dar un tratamiento adecuado a la hora de preinscribir algún fármaco para cierta patología. Seija. Conclusiones En esta práctica logramos observar la efectividad de algunos fármacos sobre una cierta bacteria especifica (en este caso la shigella) colocando un multidisco de sensibilidad para hacer el antibiograma.-¿Qué se entiende por ³SISTEMA EXPERTO´ en microbiología? R= Los Sistemas expertos sirven para resolver cuestiones complejas. R. Bibliografía. Análisis y discusión. Uruguay. Taroco. Al presentar una resistencia significativa este fármaco inhibió el crecimiento de la población de salmonela en el medio de cultivo.Laboratorio de Ecología Humana 23-Mar-11 5.

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