Universidad de

UNIVERSIDAD DE CORDOBA Córdoba,

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD comprometida
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE LA SALUD
BACTERIOLOGIA con el desarrollo
PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA regional

NIT 891080031-3

ASIGNATURA: BACTERIOLOGÍA II
Código: 504129
Horas semanales: 3
Componente: Teórico-Práctico
Ubicación: III Semestre
Requisitos: Introducción a Microbiología, Biología, Bacteriología
Docentes: Margarita Díaz Durango – Renata Parodi Rodríguez

GUÍA Nº6
DETERMINACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD DE LAS BACTERIAS A LOS ANTIMICROBIANOS
(ANTIBIOGRAMA)

INTRODUCCIÓN

La resistencia de las bacterias a los antibióticos es el principal obstáculo para la eficacia terapéutica
antimicrobiana, pues no sólo puede anular la acción curativa si se manifiesta en el curso del tratamiento,
sino que tiene a la larga consecuencias todavía más graves para el conjunto de la población, ya que
provoca la desaparición de las cepas susceptibles y la propagación de las resistentes. Ese es el motivo
por el cual la determinación de la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos haya adquirido tanta
importancia y sea indispensable para hacer de los antibióticos un uso racional y para preservar la eficacia
de este grupo tan valioso de agentes terapéuticos.

El conocimiento de la sensibilidad a los antibióticos, del microorganismo causante de una enfermedad, no

es sólo importante para hacer la selección inicial del agente terapéutico correspondiente, sino que
además en aquellos casos en los cuales el paciente presente intolerancia a determinado fármaco, permite
seleccionar el más adecuado para ese paciente en particular.

Los antibiogramas son métodos in vitro que determinan la susceptibilidad de un microorganismo frente a
una variedad de agentes antimicrobianos, bajo condiciones de laboratorio especificadas y estandarizadas.
La meta principal del estudio de susceptibilidad es proveer al clínico algunas recomendaciones sobre la
terapia que puede ser más apropiada en pacientes con una infección específica. No obstante, la
correlación exacta entre los resultados in vitro y la respuesta clínica es muchas veces difícil de predecir,
ya que existen numerosos factores que influencian la interacción de los agentes antimicrobianos y los
microorganismos en un determinado paciente. Entre los factores podemos resaltar:

Factores del agente antimicrobiano o Farmacocinética

 Unión a proteínas del plasma
 Vías de administración
 Acción bacteriostática o bactericida
 Concentración en el sitio de la infección

Factores del huésped

  Enfermedad
 Estado inmunológico
 Formación de absceso
 Presencia de cuerpo extraño
 Función renal y hepática
 Cumplimiento del tratamiento

Factores del microorganismo

 Virulencia
 Alta concentración de microorganismos
 Infección mixta
 Desarrollo de resistencia durante el tratamiento

La metodología usada para realizar el antibiograma toma en consideración algunos de estos factores para
determinar más eficientemente cómo un microorganismo podría responder in vivo a un determinado
antibiótico.
Existen diversos métodos para determinar la susceptibilidad bacteriana a los antibióticos, presentando
además cada uno de estos métodos, múltiples variantes.

Cualquiera que sea el método seleccionado, el medio de cultivo a emplear ha de ser aquel que permita un
buen desarrollo del microorganismo cuya susceptibilidad se determina y además no debe ejercer ningún
efecto inhibidor sobre la actividad antibacteriana de los antibióticos o quimioterápicos ensayados.
Usualmente se utiliza el agar de Mueller-Hinton en las pruebas de susceptibilidad de microorganismos
aeróbicos de rápido crecimiento. Cuando se trata de estreptococos u otros microorganismos exigentes, se
le añade al Mueller-Hinton, 5% de sangre desfibrinada.

De los métodos existentes, el más popular es el del disco de papel. La variante más utilizada de este
método es la de Kirby Bauer, la cual consiste en utilizar una sola concentración de antibiótico y medir el
tamaño de la zona de inhibición.

FUNDAMENTO

En el método de Kirby Bauer, el microorganismo es inoculado en la superficie de una placa de agar, sobre
el cual se colocan discos impregnados con una concentración conocida del antibiótico. Las placas se
incuban por 16-18 horas a 35- 37°C. Durante la incubación, el antibiótico difunde radialmente desde el
disco a través del agar, por lo que su concentración va disminuyendo a medida que se aleja del disco. En
un punto determinado, la concentración del antibiótico en el medio es incapaz de inhibir al germen en
estudio. El diámetro del área de inhibición alrededor del disco puede ser convertido a las categorías de
sensible, intermedio o resistente (S, I, o R) de acuerdo a tablas publicadas por los organismos
encargados del control de tales métodos, por ejemplo por el Laboratorio Internacional de Referencia:
National Committee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS).

NECESIDAD
Adquirir los conocimientos necesarios para la determinación de la susceptibilidad antimicrobiana mediante
el método de Kirby Bauer.

OBJETO DE ESTUDIO
Antibiograma

OBJETIVOS
  Realizar un ensayo de susceptibilidad a los antibióticos a partir de un cultivo bacteriano, usando
el método de Kirby Bauer.
 Analizar los resultados obtenidos y elaborar un informe escrito.

MATERIALES

 Elementos de protección personal (Bata, guantes, gorros, tapabocas y gafas de seguridad)

 Marcador de vidrio (por grupo de trabajo)
 Encendedor
 Cinta de enmascarar
 Agar Mueller Hinton
 Diferentes sensidiscos de antibióticos
 Dispensador de antibióticos
 Pinzas estériles
 Tubos tapa rosca estériles
 Escobillones estériles
 Agua estéril
 Escala de Mc Farland
 Cepas de colonias bacterianas
 Reglas milimétricas
 Incubadora
 Papel kraf
 Descartadores

COMPETENCIAS

 Adquirir conocimientos microbiológicos básicos sobre el antibiograma

 Conocer y aplicar los fundamentos para la realización del antibiograma.
 Adquirir destrezas para el desarrollo de la técnica de Kirby Bauer

PROCEDIMIENTO

Una vez que se han aislado colonias, de un microorganismo que ha sido identificado como patógeno
potencial, es necesario proceder de la siguiente manera para realizar la prueba de susceptibilidad.

1. Seleccionar las colonias

Es uno de los pasos más importantes en el proceso de la prueba, es la preparación del inóculo.
Primero, seleccione varias colonias del organismo que esté analizando. Seleccionar entre 3–5 colonias,
de igual morfología que estén en cultivo puro.
Nota: Utilizando un asa de inoculación (o un hisopo de algodón) recoja de la placa sólo colonias bien
aisladas para evitar pruebas de cultivo mixto.

Si no dispone de colonias bien aisladas, haga un subcultivo de la bacteria en una nueva placa. Utilice las
últimas colonias del cultivo, ya que estas se encuentran más aisladas.
 Figura1. Selección de colonias

2. Preparar y estandarizar la suspensión bacteriana o el inóculo

Existen dos métodos para la preparación de inóculo:
 Suspensión directa de colonias
 Fase logarítmica de crecimiento.

Sólo el método de suspensión directa de colonias proveerá resultados precisos para ciertos
microorganismos. En ambos métodos, la turbidez de la suspensión debe ser estandarizada (para que
sea igual) al estándar 0,5 de McFarland (corresponde a aproximadamente 1,5 X 108 UFC/ml).
Las suspensiones así ajustadas deben utilizarse como inóculo dentro de los 15’ siguientes.

Para el método de suspensión directa de colonias, las colonias no deben sobrepasar las 18–24 horas de
aislamiento. Estandarice el inóculo al mismo tiempo que prepara la suspensión. Suspenda las colonias en
solución salina o caldo (eje. Mueller Hinton o tripticasa de soya). Luego, ajuste el inóculo a una turbidez
equivalente al estándar 0,5 de McFarland.

Puede comparar la turbidez de las suspensiones poniendo los tubos frente a un papel blanco o una tarjeta
de archivo con líneas negras. Use suspensión directa de colonias para los siguientes microorganismos:
Todos los estafilococos, estreptococos, enterobacterias (consultar las guías de La CLSI).

El método de fase logarítmica se usa con la mayoría de organismos que crecen rápidamente excepto
estafilococos. Una vez que se han inoculado las colonias en un caldo, incube a 35 ºC para lograr un
crecimiento en fase logarítmica. El crecimiento de fase logarítmica ocurre después de 2–8 horas de
incubación. Después de la incubación, ajuste la turbidez para que sea igual al estándar 0,5 de McFarland.

3. Inocular la placa de Mueller Hinton

Depositar 100 µl de la suspensión bacteriana en cada una de las cajas de Petri, dejando caer la
suspensión en forma vertical sobre la caja de Petri. Con un aplicador estéril, distribuir la suspensión
empezando en la parte superior de la placa MHA, inocule toda la superficie con el hisopo (figura 2). Cubra
toda la placa frotando de ida y vuelta de un borde al otro. Rote la placa aproximadamente 60º y repita el
procedimiento de frotado. Rote otra vez la placa 60º y frote toda la placa por tercera vez. Esto garantizará
que el inóculo sea distribuido homogéneamente.

Sugerencia técnica: Incube la placa dentro de los 15 minutos siguientes después de haber estandarizado
el inóculo.

NOTA: Después de preparada la suspensión bacteriana, si no se tienen pipetas automáticas, se puede

escurrir el aplicador por las paredes del tubo como lo muestra la figura 3. La metodología de las 100µl es
mucho más precisa.
 Figura 2. Inoculación en MHA Figura 3. Toma del inóculo con hisopo

4. Colocar discos de antimicrobiano

Coloque los discos con los agentes antimicrobianos dentro de los 15 minutos siguientes a la inoculación
de la placa MHA, con unas pinzas, que puede pasarlas rápidamente sobre la llama del mechero entre
disco y disco, dejándola enfriar, para evitar contaminación. También se puede hacer uso de un
dispensador de sensidiscos para este procedimiento. Se pueden colocar 7 discos en una placa de 100
mm (figura 4). Presione cada disco firmemente para asegurar el contacto completo con la superficie de
agar. No se olvide de este paso o los discos pueden terminar en la tapa de la placa después de la
incubación.

Puntos que hay que recordar sobre los discos de antimicrobianos:

 No use discos después de su fecha de caducidad.

 No almacene discos en un congelador libre de escarcha.
 Use productos aprobados por la FDA.
 Use discos con el contenido especificado en los estándares de la CLSI.
 No reubique un disco una vez que éste ha tocado la superficie del agar

Figura 4. Esquema de distribución de los sensidiscos sobre el MHA

5. Incubar la placa

Invierta las placas e incúbelas a 35°C por 16–18 horas atmósfera de aerobiosis para bacterias no
fastidiosas. Para la prueba de difusión por disco de bacterias exigentes, use las condiciones de
incubación recomendadas por el CLSI, como se muestra en el siguiente cuadro.
Bacteria Medio Incubación

Tiempo (h) Atmosfera

Haemophilus spp. Medio de Prueba para 16–18 18 CO2 (5%)

Haemophilus
Neisseria gonorrhoeae Agar base GC _ 1% 20–24 CO2 (5%)
suplementado
Streptococcus spp MHA-5% sangre de cordero 20–24 CO2 (5%)

6. Medir las Zonas de Inhibición – Luz Reflejada

Después de retirar la placa de la incubadora:

Examine detenidamente la placa para verificar que el crecimiento sea uniforme y confluente de tal modo
que pueda identificar zonas sin crecimiento bacteriano.
La medida del diámetro de la zona de inhibición se hace preferentemente desde el exterior de la placa, sin
quitar la tapa, esto puede hacerse con una regla milimetrada, un vernier o cualquier otro Instrumento
similar (figura 5).

Figura 5. Medida de zonas de inhibición

7. Interpretar los resultados

Se hará lectura de los halos de inhibición.

Se reportará la susceptibilidad como: sensible, resistente e intermedio, de acuerdo al antibiótico y bacteria
analizada (Tabla 1); según las normas estandarizadas (CLSI)
Anexo 1. GUÍA ACTUALIZADA PARA REPORTE DE ANTIBIOTICOS SEGÚN TIPO DE MUESTRA

Bacilos Gram negativos en otras muestras diferentes a orina.

Ciprofloxacina
Gentamicina
Trimetoprim Sulfa
Amikacina
Ceftriaxona
Ceftazidime
Aztreonam
Imipenem
Meropenem
Piperacilina tazobactam si hay mucha resistencia
Cefepime
Gram negativos orina
1ª línea
Ampicilina
Ciprofloxacina
Gentamicina
Nitrofurantoína
Acido nalidíxico
Trimetoprim Sulfa
Si hay resistencia en 3 o más de 3 drogas de la primera línea se reportan todos los de la segunda línea.

Gram negativos orina

2ª línea
Amikacina
Ceftazidime
Ceftriaxona
 Reportar ampicilina sulbactam cuando ampicilina esta resistente, Amikacina se reporta cuando
Gentamicina esta resistente.
 Clínica reportar siempre ceftriaxona.
 Si es paciente de pediatría pasar siempre Amikacina independiente del resultado de la
Gentamicina.
 Anotar en la carpeta: Aztreonam, pero no se informa, al igual que ceftazidime

Staphylococcus saprophyticus
Nitrofurantoína
Norfloxacina
Trimetoprim Sulfa
Cocos en orina tipo Staphylococcus
Nitrofurantoína
Norfloxacina
Trimetoprim Sulfa
Oxacilina -En Micrococcus no realizar antibiograma
Vancomicina: reportarla si Oxacilina esta resistente
Enterococcus orina: - Si BLEE esta positiva informo CRO, ATM como resistente
Ampicilina
Norfloxacina - Cuando se aisle Staphylococcus diferente a S. aureus
Nitrofurantoína reportar crecimiento de Staphylococcus coagulasa
Tetraciclina negativa y el nombre

-Se anota BLEE cuando CEFTAZIDIME Y CEFTRIAXONE esta

Resistente o intermedio
Enterococcus en otras muestras:
Ampicilina
Penicilina
Gentamicina de alto nivel
Estreptomicina de alto nivel
Vancomicina

Cocos en otras muestras tipo Staphylococcus

Ciprofloxacina
Clindamicina
Eritromicina
Gentamicina
Trimetoprim Sulfa
Oxacilina
Tetraciclina
Penicilina
Rifampicina
Vancomicina reportarla si Oxacilina es resistente
Lectura test D: con el fin de ver resistencia inducible o constitutiva
Lectura de cefoxitin: para confirmar lectura de Oxacilina

Pseudomona aeruginosa en orina

No reportar meropenem, Piperacilina tazobactam, Cefepime, solo a las cepas multirresistente se les
monta meropenem

Pseudomona aeruginosa en otras muestras

Ciprofloxacina
Gentamicina
Amikacina
Ceftazidime
Ceftriaxona
Aztreonam
Imipenem
Meropenem
Piperacilina tazobactam
Cefepime

*solo informar S a penicilina a Streptococcus agalactiae grupo B, a los demás Streptococcus no se les
monta ni informa nada
* En embarazadas reportar en muestras de orina: cefalotina o Cefazolina

Haemophilus
Ampicilina
Trimetoprim Sulfa
Cefotaxime
Ciprofloxacina

Salmonella y Shigella
Ciprofloxacina
Ampicilina
Ceftazidime
Ceftriaxona
Trimetoprim Sulfa
Acido nalidíxico
 Tabla 1. Reporte de resultados

PRE-LABORATORIO
1. ¿Investigue el fundamento de otros métodos empleados en la determinación de la susceptibilidad
antimicrobiana?
2. ¿Qué son cepas productoras de BLEE?
3. ¿Para qué es útil un Antibiograma?
4. Según los siguientes microorganismos investigue los antimicrobianos a los que son sensibles: S.
pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa, K. pneumoniae, Enterobacter
cloacae, Escherichia coli, S. aureus.

POST-LABORATORIO
1. Desde el punto de vista médico explique que importancia tiene la MIC y la MBC
2. Clasifique los antimicrobianos usados en la práctica de acuerdo a su estructura química y
mecanismo de acción en la estructura celular.
3. ¿Cuándo decimos que un microorganismo es sensible a un antimicrobiano?
4. ¿Cuál es el medio de cultivo más utilizado para realizar un antibiograma?

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS (disponibles en la biblioteca de la Universidad de Córdoba)

 Murray Patrick. 6da Edición. 2009. Harcourt Brace. Microbiología Médica.

 T Stuart Walter. Mac Graw Hill. México, 2000. Editores S.A Microbiología
 El laboratorio en el diagnóstico clínico. Jhon Bernard Henry. Editorial Marban. 20° edición 2005
 B.A Freeman. Microbiología Burrows. Interamericana Mac Graw Hill. México 1997.
 Diagnóstico Microbiológico. Bailey y Scott. Editorial Panamericana
 Koneman, Diagnóstico microbiológico, Panamericana.