UNIVERSIDAD NACIONAL

PEDRO RUIZ GALLO

PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD
ANTIBIÓTICA

DOCENTE:
• MSc. Mario C. Moreno Mantilla
•

INTEGRANTES:
• Avalos Mendo Miguel Stefano
• Banda Crisanto Lisbeth Noemi
• Chávez Yrigoyen Isaías
• Farias Rodríguez Breyder Joshua
• Vargas Llanos Angie Jacqueline

LAMBAYEQUE - 2022
 FACULTAD CIENCIAS BIOLÓGICAS

PRÁCTICA N° 07

PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIBIÓTICA

➢ INTRODUCCIÓN:

Vásquez (2020), menciona que las pruebas de sensibilidad o antibiogramas tienden a

determinar la susceptibilidad de un microorganismo frente a los medicamentos
antimicrobianos, a partir de la exposición de una concentración estandarizada del germen
a estos fármacos. Por otra parte, el estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los
antimicrobianos es una de las funciones más importantes de los laboratorios de
microbiología clínica. Su realización se desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad o
antibiograma, cuya finalidad es evaluar en el laboratorio la respuesta de un
microorganismo a uno o varios antimicrobianos, traduciendo, en una primera
aproximación, su resultado como factor predictivo de la eficacia clínica.

El antibiograma define la actividad in vitro de un antibiótico frente a un microorganismo

determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una bacteria o población
bacteriana. No obstante, dichas pruebas de sensibilidad no tienen en cuenta numerosos
factores que afectan al fármaco in vivo (p. ej., la farmacodinámica y la farmacocinética,
las concentraciones del medicamento en el sitio de acción, el estado inmunitario del
huésped, las defensas específicas de sitio) y que influyen en el éxito de un tratamiento,
por ello, las pruebas de sensibilidad no siempre predicen los resultados de la terapia
(Bernal & Guzman, 1984)

Las pruebas de sensibilidad pueden hacerse para bacterias, hongos o virus. Para algunos
microorganismos, los resultados obtenidos con un fármaco permiten predecir los
resultados que se obtendrán con fármacos similares. Así, no todos los medicamentos
potencialmente útiles necesitan probarse (Herrera, 1999).

En la presente práctica se recogen los métodos básicos más utilizados y aceptados para el
estudio de la sensibilidad, así como los criterios para su interpretación y control.

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➢ OBJETIVOS:
✓ Conocer la importancia de un antibiograma.
✓ Conocer pruebas de susceptibilidad para agentes micóticos.
➢ CUESTIONARIO:

a)¿Qué es el nefelómetro de Mac Farland y cuál es su composición química?

En microbiología, los estándares de turbidez de McFarland se usan como referencia en

suspensiones bacteriológicas para saber que el número de bacterias por mililitro, o más bien
en UFC según una escala que va de 0.5 a 10. Estos estándares son creados al mezclar
soluciones de cloruro de bario al 1% con ácido sulfúrico al 1% en volúmenes específicos,1
para asegurar la densidad correcta se puede controlar usando espectofotometros.

Los estándares pueden ser visualmente comparados con suspensiones de bacterias en salina
estéril o en caldos. Si la suspensión es demasiado turbia, puede añadirse diluyente, y si no es
lo suficiente turbia, se puede agregar más bacterias. La ventaja es que no es necesario incubar
ni usar equipo especial para estimar el número de bacterias.3 La desventaja de este método
es que no discrimina a las bacterias vivas de las muertas en la solución, por lo que se puede
sobreestimar la población de bacterias.

Casos específicos en los que se usa es en el de antibiogramas o pruebas de sensibilidad, donde

es necesario para estandarizar el método y se eviten falsos positivos o negativos.

Tubos de McFarland 0.5, 1 y 2

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b)¿Qué factores pueden alterar el resultado de un antibiograma?

De acuerdo con Herrera & Campos, (2005) los factores que pueden alterar el resultado de
un antibiograma pueden ser los siguientes:

• Una muestra no representativa del proceso infeccioso.

• La selección de un lugar incorrecto de donde se obtiene la muestra, uso de técnicas
inapropiadas y el empleo de instrumentos inapropiados para su obtención.
• El uso de un volumen inapropiado de muestra.
• El derrame de la muestra.
• La colocación de la muestra en un recipiente inadecuado para su transporte, ya que
no asegura la sobrevivencia del posible agente infeccioso.
• Para el agar Mueller-Hinton, empleado como medio de soporte para realizar la
prueba de susceptibilidad por el método de difusión en agar (Método de Bauer and
Kirby), el control de calidad debe extenderse hacia la determinación de las
concentraciones de timina/timidina, la concentración de cationes, así como en
medir la profundidad del agar y que ésta sea igual en todo el plato de agar.
• Las pruebas básicas de control de calidad de los medios preparados para el empleo
en antibiogramas deben incluir: medición del pH, pruebas de esterilidad, capacidad
de crecimiento y reacción, aspecto, dureza y profundidad del agar.

c) Qué son las Betalactamasas y Carbapenemasas? ¿Cuál es su importancia clínica ?

Son un un grupo de enzimas conocidas como betalactamasas de espectro extendido (BLEE)

que otorgan resistencia a una amplia gama de antibióticos beta-lactámicos, generan
resistencia frente a penicilinas, a monobactámicos y a cefalosporinas de primera, segunda y
tercera generación. No afectan a los carbapenémicos. Las producen diversos
microorganismos gram-negativos siendo E. coli el más frecuente.

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Las BLEE se forman por una serie de mutaciones originadas a partir de otras beta-lactamasas
menos activas y se transmiten por trasferencia horizontal de genes, lo cual ayuda a su rápida
dispersión

Su importancia clínica radica en que son muy frecuentes en infecciones nosocomiales, y, a

menudo aparecen junto con otro tipo de beta-lactamasas, las carbapenemasas, complicando
el tratamiento efectivo, puesto que estas últimas confieren resistencia a antibióticos de
“último recurso”, contribuyendo así a la aparición de cepas multirresistentes (García Vela,
2018)Las carbapenemasas son enzimas producidas por bacterias gram-negativas que
hidrolizan a los carbapenémicos y que confieren, en la mayoría de las ocasiones, resistencia
a los mismos y a todos los beta-lactámicos.

Se ha producido un rápido aumento en la presencia de estas bacterias multirresistentes

principalmente por sus dos vías de dispersión, en muchas ocasiones coexistentes: la rápida
diseminación vertical de los clones productores de estas enzimas y la diseminación horizontal
de los genes que las codifican.

Las infecciones nosocomiales causadas por bacterias Gram negativas multirresistentes son
la principal causa de preocupación en hospitales. Entre las bacterias Gram negativas que
producen estas infecciones destacan las de la familia Enterobacteriaceae y, algunos
microorganismos multirresistentes, entre ellos, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter
baumannii y enterobacteriaceas productoras de β-lactamasas de espectro extendido o de
carbapenemasas

Desde un punto de vista clínico, los principales factores de riesgo para la colonización e
infección por estas cepas son la estancia en la UCI, la administración de antibioterapia de
amplio espectro de forma prolongada, la cirugía, los procedimientos instrumentales invasivos
y la inmunosupresión (Muro de Zaro Alcalá, 2018)

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d)¿Cómo se realiza el antibiograma para hongos levaduriformes?

Se inocula el microorganismo en la superficie del agar y se deposita un disco con una

concentración conocida de antimicrobiano. Después de incubar a una temperatura adecuada,
se produce una zona de inhibición del crecimiento del microorganismo alrededor del disco.
Dependiendo del tamaño de la zona, se puede determinar si el microorganismo es sensible,
intermedio, indeterminado o resistente al antimicrobiano ya que los diámetros tienen una
relación inversa con la CIM. La principal ventaja de la difusión con disco es el bajo costo
unido a la simplicidad de la técnica y esto incluye desde la realización, la lectura y en la
mayoría de las ocasiones, la interpretación. (Picazo, 2000)

a) Fundamento del método (MINSA, 2017)

El método de disco difusión consiste en depositar en la superficie de una placa de agar

Mueller Hinton II modificado (MHm) previamente inoculada con la cepa Candida spp.,
discos de papel de filtro impregnados con los diferentes antifúngicos fluconazol (25 µg) y
voriconazol (1 µg). Tan pronto el disco impregnado en antifúngico se pone en contacto con
la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antifúngico difunde por el agar,
formándose un gradiente de concentración. Transcurridas 24 a 48 h de incubación, los discos
pueden, o no, aparecer rodeados por una zona de inhibición de crecimiento de Candida spp.

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b) Tipo de muestra

Las muestras son cepas Candida spp. que provienen de aislamientos de muestras clínicas

c) Equipos requeridos

a. Vórtex.

b. Incubadora.

c. Autoclave

d) Insumos requeridos

Materiales

a. Fluconazol (Cartucho por 50).

b. Voriconazol (Cartucho por 50).
c. Solución salina estéril.
d. Placas Petri de 90 mm.
e. Tubos de vidrio con tapa rosca.
f. Pinzas planas estériles.
g. Asa de siembra.
h. Reglas de 30 cm.
i. Hisopos estériles.
j. Gradillas para tubos 13X100 mm.
k. Mecheros de alcohol.
l. Guantes.
m. Respirador N95.
n. Gorros descartables.

Medios de cultivo

a. Mueller-Hinton.

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b. Agar Sabouraud glucosa.

Reactivos

a. Azul de metileno (0,1 g).

b. Glucosa (20 g).

c. Escala Mc Farland 0,5.

Material de referencia

a. Candida krusei ATCC 6258.

b. Candida parapsilosis ATCC 22019.

c. Candida albicans ATCC 90028.

d. Candida tropicales ATCC 750

e) Condiciones previas

a. Preparar los medios de cultivo agar Sabouraud dextrosa (ASD) con cloranfenicol y
Mueller-Hinton.

b. Ver: Ficha de bioseguridad Candida spp

c. Formulario de control de calidad: FOR-002 Control de Calidad Medios de Cultivo y FOR-

012 Control Calidad Interno y Reporte de Resultado del Método Difusión en Discos para la
Determinación de Susceptibilidad Antifúngica de Hongos Levaduriforme Candida spp.

f) Procedimiento

a. Preparación del inóculo y siembra

● Se parte de un cultivo puro con 24 h de incubación a 37 ºC.

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● Se toma con la punta del asa de siembra la cepa y se la resuspende en un tubo con 5 mL de
SSE.

● Homogeneizar con vórtex y ajustar la turbidez a 0,5 en la escala Mc Farland (equivale a

1x106 – 5x106 UFC/mL). Este inóculo suspendido usarlo inmediatamente.

● Colocar el hisopo dentro del tubo que contiene la suspensión del inóculo. Embeber y rotar
contra las paredes del tubo para eliminar el exceso de líquido.

● Sembrar cuidadosamente (sin presionar el hisopo) la placa de MuellerHinton II modificado

(MHm) en tres direcciones, para obtener crecimiento uniforme en toda la superficie de la
misma.

● Colocar la placa con la tapa hacia arriba a temperatura ambiente durante 10-15 min, para
que se absorba la humedad. Evitar tiempos más prolongados de secado.

● Colocar inmediatamente el disco de fluconazol y voriconazol en placas Petri

correspondiente de forma equidistante.

b. Colocación de los discos e incubación

● Dejar a temperatura ambiente el frasco con los discos durante 5-10 min.

● Extraer el disco del frasco con una pinza estéril de punta fina.

● Apoyar el disco en la superficie del agar, de la placa previamente inoculada por el método
de hisopado y presionar suavemente en el centro del disco con la punta de la pinza.

● Distribuir los discos de modo que queden a 20 mm del borde de la placa, y separados
entre sí por 40 mm.

● Dejar la placa con la tapa hacia arriba a temperatura ambiente durante 10 a 15 min antes
de ser colocado en la incubadora.

● Colocar la placa invertida en la incubadora a 37 ºC durante 24 h.

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● Si transcurridas las 24 h de incubación, los halos no son claramente distinguibles,

prolongar la incubación 24 h más para dar lugar al crecimiento de especies de desarrollo
más lento.

g) Resultados

● Medir el diámetro del halo externo de la zona de inhibición con una regla o caliper.

● La zona a medir es la definida por las colonias con desarrollo confluyente. Dentro de la
zona de inhibición pueden desarrollar colonias con crecimiento inhibido que muestran un
diámetro menor al de las colonias externas. Estas colonias deben ser consideradas dentro
del halo de inhibición.

h)Interpretación de resultados

● Para la interpretación de los resultados se tendrá como referencia los puntos de corte
establecidos para los discos de fluconazol (25 µg) y voriconazol (1 µg), utilizados con
Candida spp. (MINSA, 2017)

i) Control de calidad interno

a. Material de referencia

● Se emplearán como control de calidad las cepas de Candida parapsilosis ATCC 22019,
Candida krusei ATCC 6258, Candida albicans ATCC 90028 y Candida tropicales ATCC

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750; ya que poseen estabilidad genética y su concentración mínima inhibitoria (CMI), ha

sido determinada repetidamente. En la siguiente tabla se muestra los rangos de aceptación.

b. Mantenimiento

● Mantener el vial en agua destilada estéril a temperatura ambiente, entre 15 °C a 25 °C. ●

Reactivar cada 06 meses en el medio de cultivo especializado.

c. Frecuencia de uso

● Utilizar cada vez que se realiza el método de ensayo.

d. Criterio de control

● Aceptación

- Debe cumplir: con el 100% de concordancia dentro de los RANGOS DE ACEPTACION

establecidos para la cepas referenciales Cándida krusei ATCC 6258; Cándida parapsilosis
ATCC 22019; Cándida albicans ATCC 90028 y Cándida tropicales ATCC 750.

- Debe cumplir: con la turbidez a la escala 0,5 de Mac Farland (equivale a 1x106 – 5x106
UFC/mL)

- Debe cumplir: con la distribución de los discos, según puntos equidistantes,

correspondientes a los diferentes antifúngicos.

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e. En caso no se cumpla con los criterios del control interno

● Repetir el ensayo.

f. Registro

● Registrar en Formulario Control de Calidad según corresponda: FOR012 Control Calidad

Interno y Reporte de Resultado del Método Difusión en Discos para la Determinación de
Susceptibilidad Antifúngica de Hongos Levaduriforme Candida spp. (MINSA, 2017)

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➢ CONCLSUIONES:

✓ Se conoció que un antibiograma es importante para determinar la susceptibilidad

(sensibilidad o resistencia) de una bacteria frente a un grupo de antibióticos, esto con
la finalidad de elegir una terapia antibiótica correcta para el tratamiento de las
distintas enfermedades.
✓ Se logro conocer que el antibiograma para hongos levaduriformes es una de las
pruebas de susceptibilidad para agentes micóticos, estas a su vez son necesarias de
implementar para un laboratorio clínico que maneje pacientes inmunosupresores.

➢ REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

Bernal, M., & Guzman, M. (1984). El antibiograma de discos Normalización de la técnica

de Kirby- Bauer. Biomédica, 4(3). Obtenido de
file:///C:/Users/intel/Downloads/1891-
Texto%20del%20manuscrito%20completo%20(cuadros%20y%20figuras%20insert
os)-7206-1-10-20130814.pdf

García Vela, S. (2018). CARBAPENEMASAS. MECANISMOS DE RESISTENCIA Y

MÉTODOS FENOTÍPICOS DE DETECCIÓN. Universidad de Salamanca. Obtenido
de
https://gredos.usal.es/bitstream/handle/10366/138727/GARC%CDA%20VELA_SA
RA_18TFG322.pdf

Herrera, M. (1999). Pruebas de sensibilidad antimicrobiana Metodología de laboratorio.

Rev. méd. Hosp. Nac. Niños, 34(1). Obtenido de
https://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1017-
85461999000100010#16

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MINSA. (2017). MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS PARA EL

DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO. Obtenido de
http://bvs.minsa.gob.pe/local/MINSA/4533.pdf

Muro de Zaro Alcalá, M. (2018). CARBAPENEMASAS: UN MECANISMO DE

RESISTENCIA BACTERIANA FRENTE LAS CARBAPENEMAS, ANTIBIÓTICOS
DE ÚLTIMO RECURSO. UNIVERSIDAD COMPLUTENSE. Obtenido de
http://147.96.70.122/Web/TFG/TFG/Memoria/MANUELA%20MURO%20DE%20
ZARO%20ALCALA.pdf

Picazo, J. J. (2000). Procedimientos en Microbiología Clínica. Obtenido de

https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiol
ogia/seimc-procedimientomicrobiologia11.pdf

Vazquez, M. (2020). Pruebas de sensibilidad o antibiogramas. Obtenido de

https://www.msdmanuals.com/es-pe/professional/enfermedades-
infecciosas/diagn%C3%B3stico-de-laboratorio-de-las-enfermedades-
infecciosas/pruebas-de-sensibilidad-o-antibiogramas

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