Taller- Práctica de laboratorio Farmacognosia

Práctica N°3. Evaluación de la actividad antimicrobiana de extractos vegetales

INTRODUCCIÓN:

Los antibióticos son metabolitos producidos por microorganismos capaces de matar otros microorganismos
(bactericidas) o de inhibir el crecimiento (bacteriostáticos). Desde los años 40 Se purificaron y sintetizaron
antibióticos para el tratamiento de enfermedades causadas por una variedad de microorganismos
patógenos. La sensibilidad de los microorganismos a los antibióticos varía y lo que se ha observado en los
últimos años es que algunas cepas han desarrollado resistencia debido principalmente al uso
indiscriminado de antibióticos.

La prueba de sensibilidad a agentes antimicrobianos se puede realizar in vitro mediante la prueba de

difusión en discos o en pozos o antibiograma. Con este método se pueden probar las sustancias o
antibióticos al mismo tiempo con una bacteria sobre una caja con agar, por lo tanto, es más sencillo de
realizar y además se obtienen resultados con mayor rapidez.

Para el antibiograma se debe realizar una siembra masiva de la bacteria a evaluar en agar que permita el
crecimiento del microorganismo. Se realizan pozos sobre el agar de aproximadamente 6 mm de diámetro.
En los pozos se colocan las sustancias a probar y éstas se empiezan a difundirse por el agar. Con la
incubación de las cajas, se produce la multiplicación de las bacterias y luego se observa si hay o no
inhibición porque alrededor del pozo una zona de no crecimiento, correspondiente a la zona donde las
concentraciones de antibiótico son inhibitorias seguida de una zona de crecimiento masivo. Mientras más
sensible la bacteria a la sustancia probada más grande será el halo de inhibición.

METODOLOGÍA

En la evaluación de los extractos etanólicos en un ensayo de actividad antimicrobiana se incluyen varias

etapas. Preparación de una solución del microorganismo o inóculo, de la solución del extracto a evaluar, la
realización del ensayo y finalmente, la lectura y análisis de los resultados.

Para una mejor comprensión del procedimiento que se realiza en el laboratorio revisar los siguientes
videos:
https://www.youtube.com/watch?v=TLaY6rFwIJA
https://www.youtube.com/watch?v=hejV-wmuZio
https://www.youtube.com/watch?v=Fnx5CkGRBEM
https://www.youtube.com/watch?v=Ra69MLrsl2g

A continuación, se describen los procedimientos para la realización del ensayo:

1 PREPARACIÓN DEL ESTANDAR 0,5 DE McFARLAND

Este estándar se prepara como una referencia para la preparación del inóculo. El estándar de McFarland es
una solución que presenta una turbiedad que se relaciona con una concentración en suspensión de
microorganismo equivalente a 1,5 x 108 células por mL.

El procedimiento de preparación es:

a. Mezcle 9,95 mL de la solución de H2SO4 (0,18 M) con 0,050 mL de BaCl2 (0,048 M) en un tubo de
ensayo.
b. Tape el tubo con la tapa y agite bien y permita que se dé la reacción.
c. Al mezclar las dos soluciones se formará BaSO4 que se precipitará
d. Este patrón de McFarland se utiliza como patón de turbidez en la preparación de suspensiones de
microorganismos. El patrón 0.5 tiene una aplicación especial en la preparación de inóculos bacterianos
para la realización de pruebas de sensibilidad antimicrobiana y corresponde aproximadamente a una
suspensión homogénea del microorganismo de 1,5 x 108 CFU/mL.
e. Comparar contra este patrón la preparación de inóculos normalizados para el ensayo de actividad
antimicrobiana.

2 PREPARACIÓN EL INÓCULO

a. El área debe estar desinfectada con alcohol al 70%

b. Encienda el mechero de alcohol en el mesón de trabajo para evitar contaminación y déjelo todo el tiempo
de la prueba.
c. Esterilice la punta del asa en la llama del mechero
d. Abra la caja de la bacteria cerca al mechero y con el asa tome colonias de la bacteria y sumerja la punta
del asa en la solución salina.
e. Compare la suspensión de la bacteria con el patrón de McFarland a la luz, si es menor la turbiedad de la
solución bacteriana repetir el procedimiento hasta que coincida la turbiedad con el patrón. Se debe ser
cuidadoso para no dejar la solución muy concentrada con el microorganismo

3 SIEMBRA DEL INÓCULO EN EL MEDIO DE CULTIVO

a. Realizar la siembra masiva del microorganismo en el agar, para ello tome un escobillón sumérjalo en el
inóculo, elimine el exceso de solución y luego aplique la solución por toda la caja. Realice este
procedimiento en tres cajas Petri.
b. Luego de la siembra se debe dejar secar por 5 a 10 min.

4 REALIZACIÓN DE LOS POZOS

a. Los pozos se realizan de tal forma que queden distribuidos por toda la caja para lo cual se recomienda
tener una hoja con el diagrama de la caja y marcar la posición de los pozos para que queden lo más
distribuidos por la caja.
b. Los pozos se pueden realizar con un sacabocados o una pipeta pasteur de vidrio y luego de perforado el
agar se retira el agar para que quede el espacio libre de agar

5 PRUEBA DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

Las sustancias que se van a ser aplicadas en los diferentes pozos son la muestra o extracto, control positivo
o antibiótico, control negativo (no afecta el crecimiento del microorganismo). Las soluciones se preparan
de la siguiente manera:

Control positivo: pesar 30 mg del antibiótico en un eppendorf y disolver en 1 mL de DMSO

Control negativo: DMSO
Extracto vegetal: pesar 30 mg del extracto en el tubo eppendorf y disolverlo en 1 mL de DMSO

a. Cada una de las sustancias se va a aplicar en el pozo para lo cual se tomarán 20 uL con una micropipeta
 Sustancia para probar
control positivo 20 uL de antibiótico
control negativo 20 uL de DMSO
extractos para analizar 20 uL extracto vegetal a evaluar

b. Una vez se coloque todas las sustancias en los respectivos pozos, dejarla por unos minutos para que las
sustancias se difundan por el agar. Realice esta prueba por triplicado.
c. Finalmente, sellar las cajas con parafilm o vinilpel y llevar a las cajas a incubación a 35±2 °C por 18 a 24
h.
d. Luego de este tiempo realizar la lectura de los halos de inhibición.

6 DATOS PARA SER ANALIZADOS

Los datos que se presentan a continuación se obtuvieron siguiendo el anterior procedimiento. El ensayo de
realizó por triplicado. Las imágenes de las cajas Petri corresponden al tamaño real de 10 cm de diámetro.

La información de los extractos evaluados fue:

• C+: control positivo, cloranfenicol

• C-: control negativo, DMSO
• 1: extracto etanólico de hojas de Retrophyllum rospigliosii (Pilg.) C.N
• 2: extracto etanólico de tallos de Weinmannia pubescens Kunth
• 2: extracto etanólico de hojas de Weinmannia pubescens Kunth

El microrganismo evaluado fue Staphylococcus aureus

Ensayo 1
Ensayo 2

Ensayo 3
 7 LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS

Este en un ensayo cualitativo que permite clasificar a la bacteria en estudio como sensible, moderadamente
sensible, intermedia (indeterminada) o resistente. El tamaño de la zona de inhibición depende de la rata de
difusión de la sustancia por lo que es recomendable dejar la caja una vez se aplican las sustancias en los pozos
por lo menos de un día para otro en nevera a 4°C para permitir la difusión de las muestras en el agar para
obtener resultados más repetibles.

Para determinar el porcentaje de inhibición para los diferentes extractos:

a. Mida los halos de inhibición para cada una de las muestras aplicadas en los pozos y de los controles en
los 3 ensayos. Mida con una regla el diámetro del halo en mm y reste lo correspondiente al pozo.
Puede realizar mas de una medición y calcular el promedio.
b. Calcule el porcentaje de inhibición con la siguiente fórmula:

%Inhibición = Halo del extracto – halo del control negativo

Halo del control positivo – halo del control negativo

c. Tabule los datos y evalúe el promedio, desviación estándar y el coeficiente de variación para
determinar la repetibilidad del ensayo.

MATERIAL Promedio halo, Porcentaje

No. halo de inhibición (mm) S CV
VEGETAL mm inhibición, %

1
2
3

d. Tenga presente el número de cifras significativas a reportar

e. Compare los datos obtenidos con la literatura.

8 BILBIOGRAFÍA

Akinsulire, O. R., Aibin, I. E., Adenipekun, T., Adelowotan, T., & Odugbemi, T. (2007). In vitro antimicrobial
activity of crude extracts from plants Bryophyllum pinnatum and Kalanchoe crenata. African Journal of
Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 4(3), 338-344.

Balouiri, M., Sadiki, M., & Ibnsouda, S. K. (2016). Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A
review. Journal of pharmaceutical analysis, 6(2), 71-79.

Ncube, N. S., Afolayan, A. J., & Okoh, A. I. (2008). Assessment techniques of antimicrobial properties of natural
compounds of plant origin: current methods and future trends. African journal of biotechnology, 7(12).

Doris Gutiérrez Hernández