UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUA, MANAGUA

FACULTAD REGIONAL MULTIDISCIPLINARIA DE CARAZO

DEPARTAMENTO DOCENTE DE MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA
CARRERA DE MEDICINA
UNAN-FAREM-CARAZO
‘2021: Año del Bicentenario de la Independencia de Centroamérica ¨´

Tema: Montaje, lectura e interpretación de la Prueba de Susceptibilidad antimicrobiana “Método

Kirby-Bauer”
Objetivo:
1. Aplicar correctamente los procedimientos técnicos al realizar la prueba de difusión por disco.
2. Hacer una adecuada selección de los antibióticos a testar según agente infeccioso.
3. Realizar lectura de los halos de inhibición utilizando una regla milimetrada.
4.Interpretar las zonas de inhibición como sensible, intermedio o resistente para los agentes
antimicrobianos según las recomendaciones de las normas CLSI.
5. Conocer los factores que interfieren y las recomendaciones de importancia que se deben tomar en
cuenta al realizar susceptibilidad antimicrobiana
Introducción
El antibiograma es la prueba microbiológica que se realiza para determinar la susceptibilidad
(sensibilidad o resistencia) de una bacteria a un grupo de antibióticos. Las técnicas de antibiograma
son las utilizadas en el laboratorio de microbiología para estudiar la actividad de los
antimicrobianos frente a los microorganismos responsables de las infecciones.
Se considera como antimicrobiano cualquier sustancia con capacidad de matar o al menos de inhibir
el crecimiento de los microorganismos y que sea susceptible de utilización como tratamiento en los
pacientes. Pueden ser naturales, sintéticos o semisintéticos. Todos los antibióticos no son eficaces
contra todas las bacterias y el antibiograma nos permite, determinar la resistencia o grado de
sensibilidad de los microorganismos frente a los distintos antimicrobianos, tratan de reproducir las
condiciones en que se encuentra el agente infeccioso dentro de los tejidos orgánicos. Es necesario
Cuando no se puede prever o se desconoce la sensibilidad a los antimicrobianos de uso frecuente de
un microorganismo aislado como vigilancia epidemiológica, en infecciones microbianas graves,
cuadro clínico no responde al tratamiento clásico. El Objetivo: es determinar la importancia del
antibiograma para una adecuada elección terapéutica.
Clasificación:
Estos métodos pueden clasificarse en métodos cuantitativos y cualitativos.
Métodos cuantitativos: Son aquellos procedimientos que permiten determinar la concentración
inhibitoria mínima (CIM). Se define CIM como la mínima concentración de antibiótico que en un
período de tiempo predeterminado, es capaz de inhibir el crecimiento in vitro de un inóculo
bacteriano previamente estandarizado (concentración conocida de gérmenes). Esta puede realizarse
por micro o macro dilución en caldo, dilución en Agar o E-test (marca comercial).
Métodos cualitativos (disco difusión) Son aquellos procedimientos que permiten clasificar
directamente a un microorganismo como sensible, intermedio o resistente. Este es uno de los
métodos más utilizados en la práctica diaria y es el que los estudiantes podrán realizar durante esta
práctica.

Susceptibilidad antimicrobiana por difusión en Agar método kirby-Bauer:

El método Kirby-Bauer (método de difusión en agar) es empleado para determinar la sensibilidad
de un agente microbiano frente a un antibiótico o quimioterápicos. Este método comprende lo que
se denomina un antibiograma o prueba de susceptibilidad bacteriana frente a drogas específicas.

El método Kirby-Bauer esta estandarizado para los siguientes microorganismos:

1. Todas las Enterobacterias.
2. Pseudomona y Acinetobacter spp.
3. Staphylococcus ssp.
4. Enterococcus spp.
5. Haemophylus spp.
6. Neisseria gonorrea.
7. Streptococcus pneumoniae.
8. Streptococcus spp.
9. Vibrión cholera.
Otras bacterias que no aparezcan en la lista se hacen por CIM. : Neisseria meningitidis, Lysterias y
Campylobacter spp.
Categorías de interpretación:
Sensible (S): Esta categoría implica que los aislamientos son inhibidos por la concentración
usualmente alcanzada por los ATBS cuando son usados en la dosis recomendada para el Sitio de
infección.
Intermedio (I): Esta categoría incluye cepas que pueden ser inhibidas por concentraciones de
antibióticos más elevadas, siempre que las dosis usadas pueden ser aumentadas.

Resistente (R): Las cepas resistentes no son inhibidas por las concentraciones séricas normalmente
alcanzadas a dosis habituales y/o caen en el rango donde son comunes mecanismos específicos de
resistencia microbiana (por ejemplo Betalactamasas) y la eficacia clínica no ha sido comprobada.

Medio para el test de difusión por disco:

De los medios disponibles se considera al Agar Mueller Hinton, el mejor para las pruebas de
sensibilidad de rutina dado que:
1. Su fórmula es la más cercana a los criterios para un medio reproducible.
2. Es el medio recomendado por la CLSI para realizar la prueba de susceptibilidad Kirby-Bauer.
3. Contiene bajos niveles de Timina, Timidina, y niveles controlados de Calcio, Magnesio y Zinc.
4. Es adecuado para el desarrollo de la mayoría de las bacterias patógenas.

Procedimiento para la realización del test de difusión por disco:

1. Todas las sensibilidades deben derivar de una sola UFC tomada del plato original. Seleccionar
una UFC y pasarla a TSI, LIA y TSA.
2. Con un asa recta seleccione 1 ó 2 colonias bien aisladas a partir de un TSA de 18-24 hrs de
incubación. (Suspensión directa).
3. Tome 1 ó 2 colonia de MacConkey y suspender en un caldo de BHI e incubar por 2 hrs. (fase 4.
logarítmica, se aplica a cultivos que tengan más de 24 hrs).
4. Ajuste la turbidez del inóculo con solución salina estéril al 0.85% hasta el tubo
0.5 de la escala McFarland, por comparación visual con el estándar. Para ello,
mire los tubos contra un fondo blanco con una línea negra como contraste. Esta
suspensión contendrá aproximadamente 1 a 2 x108 UFC/ml.

5. Dentro de los 15 minutos después de ajustado el inóculo siembre las placas

de M. Hinton con un hisopo estéril. Presione el hisopo contra las paredes del
tubo a fin de escurrir el exceso del inoculo.

6. Inocule la superficie seca del Mueller Hinton por hisopado en tres direcciones para
asegurar una completa distribución del inóculo. Las zonas de inhibición serán
uniformemente circulares y el desarrollo confluente o casi confluente.

7. Espere de 3 a 5 minutos, pero no más de 15 min. Antes de aplicar los discos para que el
exceso de humedad superficial sea absorbido.

8. Colocar los discos sobre la superficie del Agar inoculada con pinza estéril aplicando
una ligera presión a una distancia no menor a 24 mm desde un centro al otro.

9. Incubar las placas invertidas a 35°c dentro de los 15 min. Posteriores a que los discos
fueron aplicados.
10. Después de 16 a 18 horas de incubación examine cada placa y mida los diámetros de
las zonas de inhibición los cuales deben ser uniformemente circulares y con desarrollo confluente.

11. Los tamaños de las zonas de inhibición serán interpretados con las tablas presentadas por las
normas CLSI.

Factores que alteran la susceptibilidad:

1. Composición del Agar: los medios que contienen excesiva cantidad de Timina o Timidina
pueden revertir los efectos inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprim, produciendo así zonas
más pequeñas, dando como resultado un informe de falsa resistencia. La variación en cationes
divalentes principalmente Ca++ y Mg++ afectarán los resultados con tetraciclina y aminoglucósido.
Un excesivo contenido de cationes reducirá la zona de inhibición, mientras que las bajas
concentraciones de cationes resultaran en zonas de inhibición mayores que las esperadas.
2. Profundidad del Agar 4mm (25 ml): Menos (ml) inducen halos más grandes; mayores (ml)
inducen halos más pequeños.
3. Densidad del inóculo 0.5 McFarland: Menos inóculo mayor halo; mayor inóculo menor halo.
 4. Influencia del Ph 7.2-7.4: Si el Ph es demasiado bajo, ciertas drogas (P.e: Aminoglucósidos,
Quinolonas y Macrólidos) parecerán menos activas, mientras otras P.e: Tetraciclinas parecerán
tener mayor actividad. Si el Ph es demasiado alto se podrían esperar los efectos opuestos.
5. Humedad: las placas deberán estar húmedas pero no mostrar gotas sobre la superficie del medio.
6. Retardo en la colocación de los discos: Más de 15 minutos producen halos más pequeños.
7. Temperaturas de incubación 35°C: mayores a 35°C, darán como resultado halos de menor
tamaño.
8. Tiempo de incubación 16-18 hrs: mayor o menor del recomendado por la técnica inducen halos
pequeños.
Recomendaciones de importancia que se deben tomar en cuenta al realizar sensibilidad
antimicrobiana:
1. Los tubos para preparar el inóculo deben ser del mismo diámetro que el que contiene la solución
estándar de McFarland.
2. El patrón de turbidez deberá mantenerse sellado a temperatura ambiente y en la oscuridad.
3. El Ph del Mueller Himton debe estar entre 7.2 - 7.4 y la profundidad del Agar en el plato debe
ser de 4mm.
4. El Agar Mueller Himton debe conservarse en refrigeración de 4-8°c, pero para realizar el
antibiograma debe usarse a temperatura ambiente.
5. La superficie del Agar a la hora de ser inoculada, debe tener humedad adecuada sin gotas de agua
de condensación, porque pueden reducir la potencia del antibiótico.
6. Los discos de sensibilidad, deben estar envueltos en paquetes herméticos, con desecante, para
protegerlos de la humedad.
7. Se deben verificar las fechas de vencimiento de los discos y mantenerlos a 8°C excepto los
betalactámicos que deben almacenarse de –20 a –70°C y ponerlos a temperatura ambiente 1-2 horas
antes de usarlos.
8. No deben ponerse más discos que los indicados para cada tipo de plato para evitar que las zonas
de inhibición se superpongan.
9. No mover los discos una vez han hecho contacto con el Agar, porque el antibiótico comienza a
difundirse de forma inmediata.

Lectura de las zonas de inhibición en el antibiograma:

Previo a las lecturas de las zonas de inhibición (ZI), debe asegurarse que el
crecimiento del germen haya sido el adecuado garantizando que este sea
confluente y que dichas ZI, deben ser uniformes y circulares.

1. Para medir las ZI, sostener la placa invertida a unos

pocos centímetros de altura contra un fondo oscuro;
utilizando una luz directamente desde arriba mida la ZI
con la regla o cáliper sosteniéndola sobre la placa.
 2. Para la lectura de las placas de MH suplementadas con sangre, modifique el
procedimiento: primero quite la tapa de la placa, luego usando luz reflejada mida las ZI
sobre la superficie del Agar. Es importante tener precaución cuando se prueban bacterias
hemolíticas, de medir la ZI del crecimiento y no el halo de la hemólisis.
Situaciones que podemos encontrar en el antibiograma:
1. Las colonias individuales estén muy espaciadas unas de otras: En este caso las ZI son más
grandes de lo que sería un crecimiento apropiado llevando a resultados erróneos. La solución es
repetir la prueba con el inóculo estandarizado a la escala McFarland y realizando un estriado
homogéneo de la suspensión.
2. Colonias dentro de las ZI: Generalmente indican la presencia de un contaminante o bien la
presencia de una sub-población resistente. Se deben subcultivar, re-identificarlas y repetir el
antibiograma.
3. Superposición de las ZI: Este fenómeno ocurre porque la placa esta superpoblada de discos de
antibióticos. Probar menos discos o sino evitar colocar muy cerca discos que den ZI grandes.
4. Leve crecimiento de las ZI: Esto ocurre en algunas bacterias sensibles a los cotrimoxazol. Debido
a que el antibiótico es bacteriostático y las bacterias crecen por varias generaciones hasta que ejerce
su efecto inhibitorio. Medir el halo más obvio a simple vista. En el caso de Proteus, es de esperar la
invasión del halo, en este caso debe ignorarse la invasión dentro del halo de inhibición.
Preguntas de evaluación:

1. ¿Qué es y qué indican los halos de inhibición?

2. ¿Por qué se miden los halos de inhibición?

3. ¿Por qué para algunos microorganismos se utiliza Agar Mueller Himton suplementado con
sangre de carnero? Mencione algunos ejemplos.

4. ¿Uno de los problemas sanitarios más graves en la actualidad es la aparición de cepas bacterianas
resistentes a los antibióticos existentes? Se ha culpado de esto a la gran capacidad de mutación
costumbre de no terminar los tratamientos con antibióticos (5 días, generalmente) y suspenderlos
cuando se nota cierta mejoría. ¿Podrías explicar por qué esta conducta puede provocar la aparición
de resistencias?

5. Si los discos de antimicrobianos no se colocan en una placa de Agar Mueller Himton dentro de
los 15 min siguientes a la inoculación. ¿Qué es lo más posible que ocurra?

7. Está leyendo el tamaño de las zonas de inhibición en una placa Mueller Himton. El crecimiento
se observa homogéneo, pero Usted nota colonias dentro de la zona. ¿Qué podría causar este patrón
de crecimiento?

8. ¿Cómo se esperan los halos de inhibición de un microorganismo cuyo patrón de turbidez es de

5.0 McFarland?

9. ¿Por qué es importante que el Agar Mueller Himton tenga un grosor de 4mm?

10.¿Por qué el Agar Mueller Himton debe estar libre de humedad a la hora de ser inoculado?

11.¿Qué pasaría si al colocar un antimicrobiano, accidentalmente cae en posición inadecuada?

¿Regresaría el antimicrobiano a su lugar?