UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SANTO DOMINGO

Primada de América

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

Cátedra de Microbiología

UNIDAD VI

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 ASIGNATURA
Microbiología Especial.

CLAVE: MIP - 2120

CARRERAS

Bioanálisis

CREDITOS: 04

HORAS TEÓRICAS: 2 HT

HORAS PRÁCTICAS: 4 HP

PREREQUISITOS: MIP -1110

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 EVALUACION IN VITRO DE LA
SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA
 Contenidos
• Definición de Antibiograma y discos de sensibilidad
• Método de siembra del Antibiograma
• Control de calidad de la prueba disco – difusión Kirby – Bauer
• Objetivo del control
• factores que influyen en los parámetros de control de las pruebas de sensibilidad
antibiótica por disco-difusión
• Densidad del inoculo
• Patrón de turbidez de Mac Farland
• Control y aplicación de los discos
• Medida de zonas de inhibición, interpretación de los resultados
• Resistencia a los antimicrobianos y su vigilancia
 Objetivos de la Unidad

Objetivo General:
• Determinar la importancia clínica y microbiológica de las pruebas de susceptibilidad.

Objetivos Específicos:
• Elaborar correctamente un antibiograma de acuerdo al método de difusión del disco.

• Conocer los criterios que permiten la escogencia adecuada de los discos de antibióticos a
probar en un antibiograma.

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 Introducción

• El tratamiento adecuado de un proceso infeccioso esta relacionado con tres premisas

esenciales:
1) El foco o sitio de localización de la infección.
2) El conocimiento adecuado del agente etiológico.
3) La susceptibilidad de tal agente a las drogas antimicrobianas que puedan alcanzar niveles
terapéuticos en el sitio de la infección.
Las dos últimas premisas deben ser desarrolladas por el laboratorio de microbiología, el cual debe
proveer información útil, a tiempo para que el proceso infeccioso no siga evolucionando con
riesgo para la vida del paciente.

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 Definición de Antibiograma y Discos de sensibilidad

• Es el estudio en el laboratorio de la actividad de diversos antimicrobianos frente a una bacteria.

• A través del antibiograma podemos determinar frente a cuales antimicrobianos las bacterias
son sensibles o resistentes (categoría clínica). Así, ante una infección determinada en la que
hayamos aislado el microorganismo causal, podremos determinar cuales antimicrobianos serán
eficaces para tratar la infección.

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 Fuentes de error mas comunes en la
realización de un antibiograma
• Falta del control de calidad de los medios de cultivo a utilizar, patrón de McFarland y los
discos de antibióticos.
• Trabajar con cepas bacterianas que no están puras.
• Inadecuada estandarización de la concentración del inoculo.
• Utilización de un numero excesivo de discos de antibióticos por placa.
• Utilización de medios de cultivo no aptos para las pruebas de susceptibilidad.
• Lectura prematura o extemporánea de las pruebas de susceptibilidad.
• Medición incorrecta de los halos de inhibición por una iluminación deficiente o reglilla
inadecuada.
• Incubación en atmosfera inadecuada.
• Error en la transcripción de los resultados en la hoja de reporte.
Discos de sensibilidad
 Discos de sensibilidad

• Son antimicrobianos en forma de discos de papel de filtro, impregnados con el

antibiótico a una determinada concentración que puede correlacionarse a la
concentración que puede alcanzar dicho antibiótico en los líquidos orgánicos (sangre,
LCR, orina).

• Los discos para antibiograma son obtenidos comercialmente y deben ser conservados en
refrigeración y en recipientes libres de humedad.
• Los discos de sensibilidad de algunos antibióticos como Penicilina y Cefalosporinas deben
permanecer congelados para asegurar la conservación de su concentración, con
excepción de una pequeña cantidad para uso diario que debe conservarse en
refrigeración, por un tiempo no mayor de 8 días.

• La conservación adecuada de los discos para antibiograma es esencial si se quiere confiar

en los resultados obtenidos. Antes de ser utilizados, los discos deben dejarse a
temperatura ambiente por un tiempo mínimo de una hora.
Métodos de siembra para el antibiograma y Métodos de
prueba
Métodos de siembra para el antibiograma y Métodos de
prueba

• El aislamiento e identificación de un agente infeccioso a partir de una muestra clínica

proveniente de un paciente no es suficiente para impartir una terapia anti - infecciosa
adecuada. Actualmente, numerosos microorganismos han desarrollado múltiples
mecanismos que les permiten resistir a la acción de los mas nuevos y potentes agentes
antimicrobianos.

• Como no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias a los antimicrobianos, en la

actualidad se dispone de varios métodos para determinar el patrón de susceptibilidad de
una bacteria a los antibióticos.
• El método utilizado con mayor frecuencia para evaluar la sensibilidad de las bacterias a los
agentes antimicrobianos es la denominada prueba de difusión de disco. Esta técnica fue
estandarizada por Kirby y Bauer en 1966.

• Es un método sencillo y fácil de realizar en los laboratorios de rutina que solo brinda
información cualitativa o semicualitativa de un microorganismo a un antibiótico
determinado.

• Sin embargo, los resultados obtenidos son de gran valor clínico para iniciar, mantener o
modificar una antibioterapia.

• Otro método para la realización del antibiograma es el de Dilución: Procedimiento que

permite cuantificar la sensibilidad del microorganismo frente a diferentes concentraciones
del antibiótico determinando la concentración mínima que inhibe el crecimiento
bacteriano.
• A pesar de que no es un método que se realice de rutina, es importante en procesos
infecciosos donde se hace necesario un esquema de dosificación, cuando los resultados
del antibiograma por difusión son de dudosa interpretación, para evidenciar sinergismo o
antagonismo entre agentes antimicrobianos contra algún microorganismo en particular o
para determinar la sensibilidad bacteriana de lento crecimiento.

• Actualmente se dispone de un sistema basado en el método de difusión que permite la

difusión de las CMI en la mayoría de los microorganismos de una manera sencilla. Es el
denominado E-test (Épsilon-test) que utiliza unas tiras impregnadas con concentraciones
descendientes del antimicrobiano.

• La CMI viene determinada por la menor cantidad del antimicrobiano que detiene el
crecimiento de la bacteria.
Control de calidad Disco – difusión Kirby – Bauer
 Control de calidad Disco – difusión Kirby – Bauer

• Con el fin de asegurar un buen resultado en lo referente a pruebas de sensibilidad

bacteriana, es necesario monitorear y controlar periódicamente los medios de cultivo, los
discos de sensibilidad y metodología utilizada como un control de calidad interno,
utilizando cepas de referencia para las cuales los halos de inhibición son conocidos frente a
los antimicrobianos de uso rutinario.

• Este patrón de inhibición debe ser reproducido por cada laboratorio, asegurando esto que
la metodología y los elementos utilizados estén operando en optimas condiciones. Las
cepas llamadas control son Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli
(ATCC25922) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853). El diámetro de la zona de inhibición
de ellas debe estar incluido en el rango indicado en la siguiente tabla.
 Objetivo del control

• Interpretar y elaborar correctamente el reporte de un antibiograma.

factores que influyen en los parámetros de control de las
pruebas de sensibilidad antibiótica por disco-difusión
 Densidad del inoculo

• Transferir con asa bacteriológica de 3 a 5 colonias del microorganismo en estudio a un tubo

con 3 – 5 ml de caldo tripticasa de soya o solución salina estéril y hacer una suspensión de
bacteria. Si la suspensión obtenida tiene una turbidez similar al tubo patrón (tubo 0.5 de la
escala MacFarland) no es necesario una incubación ulterior; de lo contrario, los tubos
inoculados se incuban a 37°C por un tiempo prudencial de 2 horas hasta lograr la turbidez
requerida.

• Si es necesario diluir para igualar la suspensión a la del tubo patrón, puede utilizarse caldo
de cultivo o solución salina estéril.
Patrón de turbidez de MacFarland
 Patrón de turbidez de MacFarland

• La turbidez mas utilizada es la de 0.5 que corresponde aproximadamente a 1.5x108

microorganismos viables/ml.

• Se prepara mezclando 0.5 ml de Bacl con 99.5 ml de H2SO4 0.36 N (al 1%); se agita
suavemente y se distribuyen 6 – 8 ml en tubos de tapa rosca de 13x100, se cierran
herméticamente los tubos y se conservan a temperatura ambiente protegidos de la luz.
Debe prepararse cada 6 meses.
Control y aplicación de los discos
 Control y aplicación de los discos

• Colocar los discos con los dispensadores o manualmente con pinzas estériles. Debe
asegurase que contacten perfectamente con la superficie del agar, por lo que deben
presionarse ligeramente sobre la superficie del agar. No deben situarse a menos de 15 mm
del borde de la placa, y han de estar distribuidos de forma que no se produzca
superposición de los halos de inhibición. Para placas de 150 mm no se emplearán más de
12 discos y para las de 100 mm no más de 6 discos.

• Incubar las placas invertidas (agar en la parte superior), en grupos no superiores a 5 placas,
a 35°C en atmósfera aeróbica antes de que transcurran 15 minutos.
Medidas de la zona de inhibición, interpretación de los
resultados
 Medidas de la zona de inhibición, interpretación de los
resultados
• Lectura de la zona de inhibición: no deben efectuarse lecturas de los antibiogramas
basándose solo en la presencia o ausencia del halo de inhibición; deben tenerse en cuenta
los diámetros de los halos, pues estos varían según el grado de difusión del disco de
antibiótico.

• Para medir los halos puede emplearse una regla de medición común; la lectura puede
hacerse por observación visual, incluyendo el diámetro total que se observa en el tamaño
del disco que es de 6mm. De esta manera, la ausencia total de inhibición corresponde a
6mm de lectura.

• Una vez medidos los tamaños de la zona de inhibición para cada antibiótico, se debe
concluir si el microorganismo es sensible, resistente o de sensibilidad intermedia de
acuerdo a la tabla de CLSI.
Resistencia a los antimicrobianos y su vigilancia
 Resistencia a los antimicrobianos y su vigilancia

• Se denomina resistencia clínica de una bacteria a un antimicrobiano cuando este es incapaz

de curar una infección causada por un determinado microorganismo.

• La resistencia puede ser natural: cuando ciertas especies de bacterias siempre son
resistentes a un tipo de antimicrobiano Ej.: Todas las bacterias anaerobias son resistentes a
los aminoglucosidos y Pseudomonas aeruginosa a las penicilinas.

• Adquirida: es cuando un microorganismo que originalmente era sensible a un

antimicrobiano, se hace resistente a el debido al uso masivo del mismo.
• Los microorganismos pueden desarrollar resistencia para diversos mecanismos, como
son:

1) Producción de enzimas inactivantes que destruyen el antimicrobiano. Ej.: Enzimas

betalactamasas que destruyen los antimicrobianos betalactamicos.

2) Alteración de la pared o membrana que impida la penetración del antibiótico.

3) Alteraciones de la diana sobre la que actúan los antimicrobianos.

• La aparición de resistencia en un microorganismo también puede ser consecuencia de

una mutación en su ADN y sus descendientes suelen heredar esta característica y con el
tiempo, esta resistencia se difunde ampliamente entre todas las bacterias de la misma
especie.
• Resistencia transmisible: es cuando los microorganismos que se han hecho resistentes,
pueden transmitir esa resistencia a otros microorganismos sin necesidad de que estos
sean sus descendientes, utilizando mecanismos de transferencia del material genético.

• Multirresistente: es cuando las bacterias se hacen simultáneamente resistentes a

muchos antimicrobianos.

• La multirresistencia puede ocurrir de dos formas:

a) Resistencia cruzada homologa: es cuando la resistencia aparece frente a un grupo de

antimicrobianos de estructura química semejante, por ej.: frente a todos los
betalactamicos (Staphylococcus aureus resistentes a todos los betalactamicos por una
mutación que determina un cambio en su diana de la pared celular.
• b) Resistencia cruzada heterologa: es cuando la resistencia se produce frente a
antimicrobianos de estructura química diferente pero que comparten el mismo sistema
de transporte al interior de la bacteria o el mismo mecanismo de acción. Ej.: la
Betalactamasa de espectro extendido BLEE que es un tipo especial de resistencia, difícil
de detectar y causa fracaso terapéutico importante; además puede provocar resistencia
a un gran numero de antibióticos betalactamicos, incluyendo las modernas
cefalosporinas.

• Esta resistencia se transmite por elementos genéticos móviles denominados plásmidos,

que pueden transmitir resistencia a otra familia de antimicrobianos como son los
aminoglucosidos, etc.
 Bibliografía

• Koneman, E.; Allen, S.; Willian M. J. (2001) Diagnostico microbiológico, texto y

atlas a color. 5ta. Edicion. España: Editora Medica Panamericana S.A.

• De la Rosa M. Prieto P. J. (2011), Microbiologia en Ciencias de la Salud, Conceptos

y Aplicaciones. España 3ra Edicion

• Jawetz E, Melnick JL, Adelberg EA, Brooks GF, Butel JS, Ornston LN. (2005).
Microbiologia Medica. Mexico

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