Facultad de Ciencias Químicas

UNAN- León
Carrera de FARMACIA

CONTROL MICROBIOLÓGICO
DE MEDICAMENTOS
PLAN 2019

Lic. Jorge Luis Celiz

 UNIDAD III

PRUEBA DE
ESTERILIDAD Y
ENDOTOXINAS
 COMPETENCIAS
1. Realiza análisis microbiológico a materias primas, medicamentos, fitofármacos,
material de reposición periódica, antisépticos, desinfectantes y productos biológicos
para verificar su calidad microbiológica, aplicando técnicas según métodos
farmacopeicos y normativas vigentes.

2. Interpreta y emite resultados de análisis microbiológicos con responsabilidad ética

y social, para evaluar la calidad de los medicamentos con rigor científico, cumpliendo
con los criterios establecidos en cada prueba y normativas vigentes.
 PRUEBA DE
ESTERILIDAD
MEDIOS PARA PENICILIAS Y CEFALOSPORINAS:
Cuando deban usarse medios de prueba de esterilidad en el método de
Inoculación Directa del Medio de Cultivo, modificar la preparación del Medio
Líquido de Tioglicolato y del Medio de Digerido de Caseína y Soja según se
indica a continuación:

Transferir asépticamente a los recipientes de cada medio una cantidad de β

-lactamasa suficiente para inactivar la cantidad de antibiótico presente en la
muestra de prueba. Determinar la cantidad de β -lactamasa requerida para
inactivar el antibiótico empleando una preparación de β -lactamasa cuyo
poder inactivante de penicilinas o cefalosporinas haya sido valorado
previamente.
 PRUEBA DE ESTERILIDAD
Observación e Interpretación de los resultados:
A intervalos durante el período de incubación, y al momento de su finalización,
examinar los medios en busca de evidencias macroscópicas de crecimiento microbiano.

• Si el material que se está evaluando enturbia el medio de modo que no puede

determinarse fácilmente la presencia o ausencia de crecimiento microbiano
mediante examen visual, transferir porciones de medio (no menores de 1 mL cada
una) 14 días después de comenzada la incubación, a recipientes nuevos con el
mismo medio y, a continuación, incubar el recipiente original y el de transferencia
durante no menos de 4 días.

• Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado cumple

con la prueba de esterilidad.

• Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano, el producto examinado no cumple

con la prueba de esterilidad, a menos que pueda demostrarse claramente que la
prueba resultó inválida por causas no relacionadas con el producto examinado.
 PRUEBA DE
ESTERILIDAD
La prueba puede considerarse inválida sólo si se cumplen una o más de las siguientes
condiciones:
a. Los datos de monitoreo microbiológico de las instalaciones para pruebas de esterilidad
demuestran una falla.

b. Una revisión del procedimiento analítico usado durante la prueba en cuestión revela un
error.
 PRUEBA DE
ESTERILIDAD
c. Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.

d. Después de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la prueba, el

crecimiento de esta especie (o especies) puede atribuirse de manera inequívoca a errores
con respecto al material o a la técnica usados al realizar el procedimiento de la prueba de
esterilidad.
 PRUEBA DE
ESTERILIDAD
• Si la prueba se declara inválida, se repetirá con el mismo número de unidades de la prueba
original.

• Si no se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto

examinado cumple con la prueba de esterilidad.

• Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto

examinado no cumple con la prueba de esterilidad.
 PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS <85>
¿QUÉ SON ENDOTOXINAS?
Las endotoxinas bacterianas son los pirógenos más frecuentes encontrados en
productos farmacéuticos. Estas sustancias se encuentran formando parte de la
membrana exterior de las bacterias Gram negativas y al producirse la lisis celular
en las bacterias se liberan al medio donde estas se encuentren.

En los mamíferos las endotoxinas bacterianas, que son moléculas de

lipopolisacáridos, causan diversos padecimientos que pueden llevar a
complicaciones tan graves como un shock séptico. Por esta razón es importante
contar con procedimientos fiables para la detección de endotoxinas bacterianas
tanto en la industria como en laboratorios de investigación.
 PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS <85>
La Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB) es una prueba para detectar o
cuantificar endotoxinas de bacterias gramnegativas usando un lisado de
amebocitos del cangrejo herradura (Limulus polyphemus o Tachypleus
tridentatus).

Hay tres técnicas para esta prueba:

• la técnica de coagulación (gel-clot), la cual está basada en la formación de
gel;
• la técnica turbidimétrica, basada en la producción de turbidez después de
la ruptura de uniones de un sustrato endógeno;
• y la técnica cromogénica que se basa en el desarrollo de color después de la
ruptura de un complejo sintético péptido-cromógeno.
 PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS <85>
Efectuar la prueba con cualquiera de las tres técnicas. En caso de duda o
controversia, la decisión final se toma basándose en la prueba de límite de
coagulación, a menos que se indique algo diferente en la monografía del
producto en análisis. La prueba se efectúa de forma tal que se evite la
contaminación por endotoxinas.
 PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS <85>
MATERIALES:
Eliminar los pirógenos de todo el material de vidrio y otros materiales
termoestables en un horno de aire caliente, mediante un proceso validado.
Habitualmente se usan 30 minutos a 250°C como tiempo y temperatura
mínimos. Si se emplean materiales de plástico, tales como microplacas y puntas
de pipetas para pipeteadores automáticos, usar los que han demostrado estar
exentos de endotoxinas detectables y no interferir con la prueba.
 PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS <85>
REACTIVOS Y SOLUCIONES:
Lisado de Amebocitos—Un producto liofilizado obtenido a partir de un
lisado de amebocitos (leucocitos) del cangrejo herradura (Limulus
polyphemus o Tachypleus tridentatus). Este reactivo se refiere sólo a un
producto fabricado de conformidad con las reglamentaciones de la
autoridad competente. El Lisado de Amebocitos reacciona con algunos β-
glucanos además de reaccionar con las endotoxinas. Existen
preparaciones que no reaccionan con los glucanos, se preparan retirando
o inhibiendo el factor G que reacciona con los glucanos.

Agua para Ensayo de Endotoxinas Bacterianas (EEB)— Usar agua para

inyección o agua producida por otros procedimientos que no reaccione
con el lisado empleado, en el límite de detección del reactivo.
 PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS <85>
REACTIVOS Y SOLUCIONES:
Reactivo LAL —Disolver con agitación suave el Lisado de Amebocitos en
Agua para EEB o en una solución amortiguadora recomendada por el
fabricante del lisado. Almacenar el lisado reconstituido, refrigerado o
congelado, de acuerdo con las especificaciones del fabricante. .
 PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS <85>
LIMITES DE ENDOTOXINAS:
El límite de endotoxinas para los medicamentos de administración
parenteral se especifica en la monografía individual en unidades como
UE/mL, UE/mg, UE/Unidad de actividad biológica, etc.
 PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS <85>
TÉCNICA TURBIDIMÉTRICA
Esta técnica es una valoración fotométrica que mide los incrementos en turbidez
del reactante. Dependiendo del principio empleado en la valoración, esta técnica
se puede clasificar como: valoración turbidimétrica de punto final o valoración
turbidimétrica cinética.
La valoración turbidimétrica de punto final se basa en la relación cuantitativa
entre la concentración de endotoxinas y la turbidez (absorbancia o transmisión)
de la mezcla de reacción al término de un período de incubación.
La valoración turbidimétrica cinética es un método para medir el tiempo
necesario para alcanzar una absorbancia o transmisión predeterminada de la
mezcla de reacción (tiempo de iniciación) o la velocidad de desarrollo de
turbidez. La prueba se efectúa a la temperatura de incubación recomendada por
el fabricante del lisado (por lo general 37 ± 1 ° C).
¡GRACIAS POR SU ATENCIÓN!