Microbiología clínica

y sanitaria
Dr. Gabriel E. Cabrejos Chilge
Tecnología Médica: Laboratorio clínico y anatomía patológica
Sesión N° 1 – Semana 2
Unidad didáctica I: MECANISMOS DE PATOGENICIDAD
MICROBIANA Y RESISTENCIA ANTIBIOTICA
Tema:
Pruebas de susceptibilidad antibiótica.
Mecanismo de acción de los antibióticos
Mecanismos de resistencia, Multiresistencia
 Objetivos
• Conocer los procedimientos para la evaluación de las pruebas
de sensibilidad.
• Conocer el mecanismo de acción de los antimicrobianos mas
importantes.
• Conocer los mecanismos de resistencia a los antimicrobianos
y aprender a detectarlos
 Prueba de sensibilidad antimicrobiana
• Son métodos in vitro que determinan la sensibilidad
antimicrobiana, las cuales deben reunir condiciones de
laboratorio específicas y estandarizadas
• Están indicados para cultivos bacterianos clínicamente
relevantes (por ejemplo: fluidos normalmente estériles o
sitios clínicamente infectados) cuando la susceptibilidad no
puede ser predicha.
• Enterobacterias, Pseudomonas, Acinetobacter, Estafilococos,
Enterococos, Neumococos y Neisserias.
 Antibiograma
El antibiograma tiene como objetivo evaluar en el laboratorio la
respuesta de un microorganismo a uno o a varios antimicrobianos,
y traducir, en una primera aproximación, su resultado como factor
predictivo de la eficacia clínica

Es una de las funciones más importantes de los laboratorios de microbiología clínica.

 Prueba de sensibilidad antimicrobiana
Clasificación según el resultado obtenido:
• MÉTODOS CUANTITATIVOS
Son aquellos procedimientos que permiten determinar la concentración
inhibitoria mínima (CIM) y la concentración bactericida mínima (CBM).

• MÉTODO CUALITATIVOS

Son aquellos procedimientos que permiten clasificar directamente a un

microorganismo como sensible o resistente.
 Método de macrodilución

CONTROL 0.8µg/ml
0.2µg/ml 0.4µg/ml
1.6µg/ml 3.1µg/ml 6.3µg/ml 12.5µg/ml 25µg/ml 50µg/ml

CIM: 1.6 µg/ml

Incremento de la concentración de la droga

CIM: Concentración mínima de antimicrobiano que inhibe el crecimiento bacteriano

Capacidad del antimicrobiano para inhibir el crecimiento de las bacterias (µg/ml)
 Relación entre el CIM y CBM

CIM: 2 µg/ml

32 16 8 4 2 1 0.5 µg/ml

CBM: 8 µg/ml
32 16 8 4 2
CBM: Concentración mínima de antimicrobiano capaz de matar un 99.9% de la población
bacteriana inicial – Refleja la posible actividad bactericida del antimicrobiano
Método de automatizados con microdilución

VITEK® 2 Compact MicroScan WalkAway System

(bioMerieux-Vitek) BD Phoenix™System (Beckman Coulter)
(BD Diagnostic Systems)
 Método Disco Difusión
• Método Disco Difusión: Prueba de Kirby-Bauer
• Disco filtro impregnado con antibiótico.
• Prueba de susceptibilidad para mas de un antibiótico
midiendo el tamaño de la “zona de inhibición”.
• 1949: Bondi y col. disco de papel
• 1966: Kirby, Bauer, Sherris, y Tuck
• Demostraron que los resultados cualitativos del método disco
difusión correlaciona bien con resultados cuantitativos de las
pruebas de MIC.
• 1975: NCLSS (CLSI) adoptaron los pasos en el manual
M02
 Historia
A
Redish ( 1928 )
- Uso de pocillos en el agar para antisépticos.

Vincent & Vincent – 1944

– Uso de discos (papel filtro) impregnados con penicilina
 Historia

Ericsson, H. Hogman K. y Wickman K. Bauer, Kirby, Sherris y Turch,

“A paper disk method for determination of bacterial “Antibiotic susceptibility testing by standardized
sensitivity to chemotherapeutic and antibiotic single disk method.” Am J Clin Pathol
agents“ Scand. J. Clin. Lab. Invest.., 1954; 6:21 1966;45:493-496.
Procedimiento actual
Procedimiento del metodo disco difusion
• Prepara el inoculo del cultivo de la placa primaria, tocando con una
asa o hisopo 3 a 5 colonias, de apariencia similar del microorganismo
a probar.
Selección de colonias y preparación del inoculo
Procedimiento del metodo disco difusion
• Transferir este crecimiento a un tubo con solución salina. Luego
comparar el tubo con la escala de Mc Farland 0.5 y ajustar la turbidez
adicionando mas bacterias o mas solución salina estéril.
PATRON DE TURBIDEZ:
• Agregar 0,5 ml de una solución de BaCl2
0,048 M (BaCl2.2H2O al 1,175% P/V) a 99,5
mL de una solución de H2SO4 0,18 M (0,36 N)
(1% V/V).
• Verificar la densidad usando un
espectrofotómetro, cuya absorbancia a 625
nm es 0,08 a 0,10.
• Distribuir de 4 ml a 6 ml en tubos con tapa
rosca o tapón de jebe, similares a los que se
usarán para preparar el inóculo.
• Guardar a temperatura ambiente, protegido
de la luz (duración 6 meses).
Procedimiento del metodo disco difusion
Escala 0,5 Macfarlán (1,5 x 108 UFC/ml)

Tubo Problema Tubo Patrón Absorbancia 0,08 – 0,10

a 625 nm
 Procedimiento del metodo disco difusion
• Inocular la placa introduciendo el hisopo en el inoculo (remover el
exceso en la pared del tubo). Estriar el hisopo sobre la superficie del
medio 3 veces rotando la placa un ángulo de 60°.

Estriamos en 3 Direcciones
Retirar el exceso de muestra “Suspensión uniforme”
Procedimiento del metodo disco difusion
• Los discos de antibióticos pueden ser colocados sobre la placa
inoculada usando: pinzas estériles, una plantilla o un dispensador de
discos de antibióticos.
Procedimiento del metodo disco difusion
• Las placas deberían ser colocadas en la incubadora (en ambiente o en
campana con CO2) dentro de los 30 minutos de su preparación.

Bacterias fastidiosas requieren el uso de medios enriquecidos y

de condiciones propias para su posterior interpretación.
Procedimiento del metodo disco difusion
Medidas de la zona de
inhibición:
• Usando una regla: medir bajo
la superficie de la placa
conteniendo el medio
transparente.
• Usando un Vernier (pie de
rey): medir sobre la superficie
de la placa conteniendo el
medio opaco.
Procedimiento del metodo disco difusion

Luz transmitida Luz reflejada

Interpretacion del antibograma
 Factores que influyen en el tamaño de la
zona de inhibición
• Medio de cultivo
• Composición
• Profundidad
• pH
• Cationes
• El inoculo
• Temperatura de incubación
• Tamaño y carga del disco
 Profundidad del Medio de cultivo

4 mm

2 mm

6 mm

Profundidad aceptable: 4 ± 0,5 mm

Calculo del volumen de la placa
OJO: “Diferentes marcas de placas,
diferentes diámetros”

Vol = π . r2 . h
Vol agar = 3.14 x ( r )2 x 0.4 cm
Si ϴ = 9 cm » 25.4 ml
r = radio de la placa Petri Si ϴ= 10 cm » 31.4 ml
Si ϴ = 15 cm » 70.6 ml

Tolerancia: ± 0.5 cm (3.5 – 4.5)

 pH del Medio de cultivo

pH aceptable: 7.2 – 7.4 Medición en el agar

Densidad del Inoculo bacteriano

Escala de Mc Farland 0.5

 Densidad del Inoculo bacteriano

Mc farland 1.0 Mc farland 0.5 Mc farland 0.3

Control de calidad en el antibiograma: disco difusión
• El uso correcto y exacto del
antibiograma es dependiente de un
buen control de calidad.
• Control de calidad: reactivos, medio,
procedimiento y competencia del
personal.
• Resultados del paciente no deberían
ser entregados si los resultados de las
cepas de control de calidad están
fuera de las especificaciones.
Determinación de puntos de corte para la
interpretación del antibiograma
Comité de Expertos
Datos Datos Datos
Microbiológicos Farmacológicos Clínicos

PUNTOS DE CORTE

SENSIBLE INTERMEDIO RESISTENTE

Agente Contenido Diámetro (mm) MIC (µg/ml)

antimicrobiano del disco R I S R S

Ampicilina 10 µg  13 14 - 16  17  32 8
 Comité de Expertos
• Metodologías estandarizadas (Europa)

• Swedish Reference Group for Antibiotics (Suecia)

• Deutsches Institut für Normung (Alemania)

• Werkgroep Richtlijnen Gevoeligheidsbepalingen (Holanda)

• British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC)

• Societé Française de Microbiologie (Francia)

Interpretación del Antibiograma
• SENSIBLE:
Cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro por una concentración de un
antimicrobiano que se asocia a una alta probabilidad con el éxito terapéutico.
• INTERMEDIO:
Cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro por una concentración de un
antimicrobiano que se asocia a un efecto terapéutico incierto.
• RESISTENTE:
Cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro por una concentración de un
antimicrobiano que se asocia a una alta probabilidad con el fracaso
terapéutico.
Mecanismo de acción de los antimicrobianos
 HISTORIA

Sir. Alexander Fleming El hongo Penicillium notatum impide el

Penicilina (1928) crecimiento de Staphylococcus aureus...
Premio Nobel Medicina 1945:
Fleming – Chain - Florey
 Antimicrobiano
“Sustancia capaz de actuar sobre los microorganismos,
inhibiendo su crecimiento o destruyéndolos”

Quimioterapéutico
“Sustancia producida de manera
sintética que posee la propiedad de
inhibir el crecimiento o destruir
microorganismos”.
Antibiótico
“Sustancia producida por el metabolismo de
organismos vivos, principalmente hongos
microscópicos y bacterias, que posee la propiedad de
inhibir el crecimiento o destruir microorganismos”.

Penicilina

Prontosilo
 Postulados de Erlich

Un ANTIMICROBIANO debe ser:

• Muy activo frente a microorganismos.
• Fácilmente absorbible por el organismo humano.
• Activo en presencia de tejido o fluidos corporales.
• Bajo grado de toxicidad, alto índice terapéutico.
• No inducir desarrollo de resistencias.
 Clasificación por su efecto
• Bactericidas: producen la muerte
del microorganismo responsable
del proceso infeccioso.
• Bacteriostáticos: bloquean el
crecimiento y multiplicación celular
quedando el microorganismo
viable, de manera que, cuando se
suspende el tratamiento, puede
volver a recuperase y multiplicarse
 Clasificación por su Mecanismo de acción
1. Interfieren en la biosíntesis de PARED
CELULAR
2. Inhiben la SINTESIS DE PROTEINAS
3. Actúan sobre la síntesis de ACIDOS
NUCLEICOS
4. Actúan sobre VIAS METABÓLICAS
5. Actúan sobre la MEMBRANA
CELULAR
 Síntesis de pared celular
Consta de 4 etapas:
1. Síntesis de precursores
solubles en el citoplasma.
2. Transferencia de precursores a
transportador lipidico .
3. Unidades disacarídicas se
polimerizan en cadenas
lineales fuera de la membrana
4. Unión del polímero lineal así
formado al peptidoglucano
preexistente en la pared
celular(entrecruzamiento)
 Inhibidores de la síntesis de la
pared celular
• β-lactámicos: Penicilinas, Cefalosporinas,Carbapenemes,
Monobactamas.
• Inhibidor de la reacción de transglucosidación:
Glucopeptidos (vancomicina).
• Inhibidor de la condensación reductora del UDP-NAG con
el PEP para dar UDP-NAM: Fosfomicina.
• Inhibidor de la reentrada del undecaprenil-P en el ciclo
biosintético del PG (bactoprenol): Bacitracina A.
NAG = N-acetilglucosamina, PEP = Fosfoenolpiruvato, NAM = N-acetilmurámico
 β-lactámicos
• Todos los antibioticos β-lactamicos son bactericidas sobre
bacterias en crecimiento.
• Inhiben irreversiblemente el sistema enzimático implicado
en la reacción de transpeptidación. (PBP: Penicillin Binding
Proteins o transpeptidasa)
• Procesos que promueven:
• Acumulación de precursores del PG, sin ensamblar.
• Activación de autolisinas (amidasas, glucosidasas), que hidrilozan
el PG maduro.
Mecanismo de acción de los β-lactamicos
Estructura química de los β-lactámicos
 Inhibidores de la síntesis de la
pared celular: NO -lactámicos
Que se combinan con sustratos de la pared
Glucopéptidos: forma un complejo con los residuos de D-alanina, impide la
transferencia de los precursores desde el carrier lipídico
Que inhiben enzimas biosintéticas
Fosfomicina: bloquea la formación del ácido N-acetilmurámico.
Cicloserina: inhibe la incorporación de D-alanil-D-alanina al PG.
Que se combinan con moléculas “carrier”
Bacitracina: se une al Bactoprenol, molécula lipídica de membrana que
transporta las subunidades de peptidoglicano hacia la cara externa de la
membrana.
 Inhibición de la síntesis proteica
Los antibióticos que Subunidad 30S:
interfieren en la síntesis de
proteínas son muy variados Aminoglicósidos
y abundantes, y la mayoría Tetraciclinas.
de ellos funcionan Subunidad 50S:
interfiriendo con el Lincosamidas
ribosoma, se unen a
Macrólidos
proteínas ribosómicas o a
alguno de los ARN Oxazolidinonas
ribosómicos. Estreptograminas
 Inhibición de la síntesis proteica
Podemos agruparlos según la fase concreta de la
elongación sobre la que actúan:
1. Inhibidores de la fase inicial de la elongación:
tetraciclinas (30s)
2. Inductores de errores en la lectura del ARNm:
aminoglucósidos (30s)
3. Inhibidores de la translocación: macrólidos (50s)
4. Inhibidores de la transcripción de las eubacterias:
rifamicinas
 Polipéptido en
crecimiento Polipéptido en crecimiento
Sitio de
síntesis de Cloranfenicol
proteínas
Se une a la porción 50S e
inhibe la formación de
enlace peptídico

Sitio de síntesis de proteínas

(a) Detalle tridimensional del sitio de Macrólidos

la síntesis de proteínas que muestra Se une a la porción 50S, impide
las partes de la subunidad 30S y 50S el movimiento de translocación a
del ribosoma procariota 70S lo largo del ribosoma ARNm
RNA
mensajero
Dirección del movimiento del ribosoma

Aminoglucósido Tetraciclinas
70S Ribosoma
Cambia de forma de la porción 30S, procariota Interfiriere con la unión del
haciendo que el código de ARNm ARNt al complejo ARNm-
sea leído de forma incorrecta Traducción ribosoma

(b) Diagrama que indica los diferentes puntos que cloranfenicol, las
tetraciclinas, macrólidos y aminoglucosidos ejercen sus actividades
Inhibición de la síntesis de Ácidos Nucleicos:
Quinolonas
• A principios de la década de los años 60, Lescher descubre
de forma fortuita la primera quinolona (ácido nalidíxico).
• En 1984, se introduce átomos de fluor en el núcleo básico y
aparecen las primeras fluorquinolonas, tambien llamadas
Quinolonas de Segunda Generación encabezada por la
norfloxacina, ciprofloxacina, todas con una importante
actividad contra Gram negativas y escasa contra Gram
positivas (excepto Estafilococos)
Inhibición de la síntesis de Ácidos Nucleicos:
Quinolonas
 Inhibición de la síntesis de Ácidos Nucleicos:
Quinolonas
L a s q u i n o l o n a s b l o q u e a n l a
topoisomerasas tipo II (ADN- girasa),
uniéndose a la subunidad de tipo A.
El bloqueo de las quinolonas sobre
la girasa supone que ésta queda
“congelada” en la fase en que el
ADN está unido al enzima. Ello
provoca la acumulación de roturas
de doble cadena, lo que conduce a
la muerte de la bacteria.
 Acción sobre vías metabólicas:
Sulfonamidas y Trimetoprim
Su estructura es similar al ácido para-
aminobenzoico (PABA), un factor
requerido por las bacterias para la
síntesis del ácido fólico
Bacteriostáticos sintéticos de amplio
espectro, eficaces contra la mayoría de
las bacterias Gram positivas y muchas
bacterias Gram negativas.
Los efectos colaterales incluyen
alteraciones del tracto gastrointestinal
e hipersensibilidad.
 Antibióticos que desorganizan la membrana:
Polomixinas (Polipeptidos)
• Actúan sobre la membrana celular de las
bacterias Gram negativas. Las Gram positivas
son resistentes a las polimixinas.
• Se unen por enlace covalente a los residuos
del lipopolisacárido de membrana (LPS): el
fragmento policatiónico de la Polimixina
desplaza a los cationes Ca+2 y Mg+2 que
estabilizan al LPS en la cara externa de la
membrana celular.
• La permeabilidad selectiva de la membrana
celular se altera, desencadenándose la lisis de
la bacteria.
Sitio de acción de los antimicrobianos
Resistencia bacteriana

• Capacidad de una cepa

bacteriana de resistir la
acción de cierto
antibiótico
¿Como ocurre la resistencia bacteriana?
¿Cómo se propaga la resistencia?
Resistencia bacteriana
Resistencia intrínseca o natural
La bacteria no tiene la molécula/reacción enzimática que es el
blanco del antibiótico.
 El antibiótico no puede ingresar al interior de la bacteria.
...es específica del género y/o especie...
Resistencia adquirida
 Se debe a la adquisición de genes que codifican para resistencia.
O a la mutación de algunos genes (generalmente genes de las
proteínas blanco).
...es una propiedad específica de cada cepa (no todas las bacterias
son transformables)...
Resistencia adquirida
Depende de...
el agente antimicrobiano
la bacteria
el mecanismo de resistencia
Se puede cuantificar como un valor de concentración inhibitoria mínima (CIM)
El valor de CIM puede aumentar entre 3 y 100 veces
Cromosómica Extracromosómica

“Cuando la resistencia se adquiere por

“Cuando la resistencia se adquiere por transferencia horizontal de genes la
mutación la CIM aumenta de 3 a 5 CIM aumenta por lo general entre 50 y
veces.” 100 veces”
Expresión de la resistencia
Mecanismos de transferencia

1. Transducción
2. Conjugación
3. Transposición
4. Transformación
5. Transferencia por vesículas
Mecanismos de Resistencia
1. Modificación del sitio blanco
2. Disminución de la disponibilidad intracelular del antibiótico
(impermeabilidad)
a. Se impide la entrada (perdida de porinas)
b. Aumenta la salida (bomba de eflujo)
3. Inactivación enzimática
4. Establecimiento de una ruta metabólica alternativa
1. Modificación del sitio blanco

• Modificación de sitios
específicos de la bacteria:
• Pared Celular: cambios
(mutaciones) en PBP, disminuye
la afinidad
• Ribosomas: macrólidos (50S)
• ADN: mutación Sub A Girasa
• ARN: mutación Sub  ARN
polimerasa
2. Disminución de la disponibilidad intracelular del
antibiótico (impermeabilidad)

• Disminución de la captación por cambios en la

permeabilidad: ej. perdida de porinas

• Mediante un mecanismo de transporte activo, expulsión

del antibiótico
Perdida de porinas
• Porinas: canales proteicos de
la membrana externa BGN,
que participan en el
transporte de moléculas
hidrofílicas.
• Este transporte presenta
algún grado de selectividad y
especificidad, no son sólo
agujeros de la membrana
externa
 Bomba de Eflujo
• Son complejos proteicos de membrana
que expulsan de la bacteria sustancias
toxicas.
• Los capaces de expulsar antibióticos se
dividen en :
 la superfamilia mayor facilitador (MFS),
 la familia cassette de unión-ATP (ABC),
 la familia de resistencia-nodulación-
división (RND),
la familia pequeña multidroga resistentes
(SMR)
la familia de expulsión de componentes
tóxicos y multidrogas (MATE).
3. Inactivación enzimática
a) Un huésped susceptible con un
objetivo que se inhibe de
manera eficiente
b) Adquisición y producción de
una enzima que destruye el
antibiótico (ej. betalactamasas)
c) Adquisición y la producción de
una enzima que modifica la
estructura del antibiótico (ej.
enzimas modificadores de
aminoglucósido)
3. Inactivación enzimática
Gram (+) Gram (–)
Extracelulares Periplasmáticas
Inducibles -lactamasas Constitutivas
Penicilinas > Cefalosporinas Penicilinas = Cefalosporinas
Clasificación de las
betalactamasas
4. Establecimiento de una ruta metabólica alternativa
Es un tipo de resistencia mediada por cambios en la molécula blanco.
En este caso cambian varias enzimas de la ruta metabólica haciendo
que el antibiótico no pueda actuar.
Ej.: Sulfas y Trimetoprim
Trimetoprim