UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

Silenciamiento génico para el control del

hongo causal de escoba de bruja

Ana Cristina Caribé dos Santos, DSc

Guayaquil
25 a 28 de agosto, 2014
 QUE ES RNAi
Conjunto de procesos mediados por pequeños
RNAs regulatorios conservado entre eucariotas

Protege el genoma de patógenos y

transposones

Regula el programa celular de expresión

génica y desenvolvimiento

Previene el acumulo de mRNAs não

funcionales
COMO FUNCIONA
APLICACIONES DE RNAi EN LA
CIENCIA

Estudio funcional de genes

Defensa contra patógenos

Control de la expresión génica

experimentalmente
 POR QUE UTILIZAR RNAi -
VENTAJAS

PTGS

Degradación del mRNA, por tanto,

no altera la estructura del gen
endógeno
Su eficiencia no es comprometida
por la presencia de núcleos no
transformados o de genes
 POR QUE UTILIZAR
RNAi - VENTAJAS
Silenciamiento
de alta especificidad

Silenciamiento simultáneo
de secuencias conservadas
(familias multigénicas)
POR QUE UTILIZAR RNAi - VENTAJAS

Silenciamiento sistémico

Plamodesmatas Diliporo Proteínas transmembranas

Plantas Basidiomicetos C. elegans
POR QUE UTILIZAR RNAi - VENTAJAS
Amplificación del silenciamiento
 LO QUE YÁ HICIMOS

Determinación de la
operacionalidad del
silenciamiento génico
por RNAi en
M. perniciosa, usando o
gen gfp, como modelo
PROYECTO DE SECUENCIAMIENTO DEL GENOMA DE Moniliophthora perniciosa
(http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura)
Cerca de 39 Mbp y 14.000 genes predichos

Secuencias identificadas en el banco de dados del genoma de

M. perniciosa que tienen homología con genes vinculados al
mecanismo de RNAi

Gene Organismo c/ Proteína Valor E

homologia
Qde-1 N. crassa RdRP 2e-04
QDE3 N. crassa qde-3 6e-15
(RecQ DNAhelicase)

CAF Arabidopsis CAF 3e-12

(endoribonuclease dicer homolog)

SDE3 Arabdopsis RNA helicase 4e-24

 Producción de una linaje transgénica de M. perniciosa
que expresa el gen heterólogo gfp

Vector usado en la transformación

de M. perniciosa

hph
pHSP70-SG (Spellig et al. 1996)

Dra. Regine Kahmann, Munchen, Germany

 Transfixión del vector pHSP70-SG para protoplastos de M.
perniciosa por el método PEG/CaCl2

A B

C D E

A. Protoplastos, micrografía de fase de contraste 400X. B Hifa parecida con

tubo de germinación saliendo directamente de una simple célula esférica. C e
D. Algunos protoplastos agregados en el proceso de regeneración,
contribuyendo para la formación de micelio. E. Desenvolvimiento de hifas en
un estado mas avanzado.
Transformación de M. perniciosa con el gen repórter gfp

Expresión de gfp - linajes control y transformante

Transformación de M. perniciosa con el gen repórter gfp

Expresión de gfp – linaje transformante

Transformación de M. perniciosa con el gen
repórter gfp

Expresión de gfp – linaje transformante

 SILENCIAMIENTO DEL GEN gfp POR RNAi
Estrategia para síntesis de dsRNAs

lacZ ddt gfp sense ddt T7 promoter

NcoI
MCS EcoRI MCS

lacZ ddt gfp antisense ddt T7 promoter

MCS EcoRI NcoI MCS

Plasmid Template - Estrategia para obtención de gfp (Plasmid Template)
en las orientaciones senso y antisenso para síntesis de gfpdsRNAs,
usando o MEGAscript RNAi Kit transcription reaction.
 Silenciamiento del gen repórter gfp por RNAi

CT T1
.
B

T2 T3.

T4 T5. T6
Diagnóstico del silenciamiento usando RT-qPCR. Expresión relativa de gfp
en linajes transgénicas de M. perniciosa tratadas con gfpdsRNA (51 – 97%).
 LO QUE YÁ HICIMOS

Silenciamiento de genes
endógenos de M. perniciosa
por RNAi, visando análisis
funcional
 SILENCIAMIENTO DEL GEN MpHyD DE M.
perniciosa POR RNAi PARA ESTUDIO FUNCIONAL
 SILENCIAMIENTO DEL GEN MpHyd
Estrategia para síntesis de dsRNAs

lacZ T7 promoter MpHYD3 antisense Sp6

SalI SalI
MCS SalI MCS
SalI

lacZ T7 promoter MpHYD3 sense Sp6

SalI
MCS SalI MCS

Plasmid Template - Estrategia para obtención de MpHyd en las orienta-

ciones senso y antisenso para la síntesis de MpHyddsRNAs usando o
MEGAscript RNAi Kit transcription reaction.
 SILENCIAMIENTO DEL GEN MpHyd
Expresión relativa de MpHyd en linajes control y tratadas con
MpHyddsRNA vía PEG/CaCl2 (18 a 97%)
2,0

1,5
RQ

1,0

0,5

0,0
Hd1
Hd1
Hd1
Hd1
Hd1

Hd2
Hd2
Hd2
Hd2
Hd2

Hd4
Hd4
Hd4
Hd4
Hd4

Hd5
Hd5
Hd5
Hd5
Hd5
CT T1 T2 T3 T10 CT T1 T2 T3 T10 CT T1 T2 T3 T10 CP T1 T2 H3T10
Lines M. perniciosa
 SILENCIAMENTO DO GENE MpHyd
2,0

1,5
RQ

1,0

0,5

0,0
Hd1
Hd1
Hd1
Hd1
Hd2
Hd2
Hd2
Hd2
Hd4
Hd4
Hd4
Hd4
Hd5
Hd5
Hd5
Hd5
CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6
Lines M. perniciosa
Expresión relativa de MpHyd en
linajes control y tratadas con
Fenotipo
MpHyddsRNA vía electroporación
(89 a 97%)
 SILENCIAMENTO DO GENE MpPrix1 POR RNAi
Estrategia para síntesis de dsRNAs

T7 MpPRIX1 sense

PDNR-LIB MpPRIX1 PDNR-LIB

MpPRIX1 antisense T7

Estrategia para obtener MpPrix1 (PCR Template) en las

orientaciones senso y antisenso para síntesis de
MpPrix1dsRNAs, usando MEGAscript RNAi Kit transcrip-
tion reaction.
 Silenciamiento del gen MpPrix1 por RNAi

Expresión relativa de MpPrix1 en linajes

control y tratadas con MpPrix1dsRNA (23
a 87%).

Curva de sobrevivencia de linajes con-

Actividad de la enzima 1 cys-peroxidase en trol y tratadas con MpPrix1dsRNA ex-
linajes control y tratadas con MpPrix1dsRNA puestas a H2O2
 LO QUE ESTAMOS HACIENDO

Proyecto “Rede Cacau Renorbio – Vassoura de Bruxa”

 Proyecto interinstitucional (FINEP, FUNPAB, CEPLAC,
UESC, CENA-USP, CENERGEN-EMBRAPA, UNICAMP)
Coordinador: Dr. José Luis Pires (CEPLAC)
Vice-coordinador: Dr. Raúl René Valle (CEPLAC)
 Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopa-
tógeno Moniliophthora perniciosa por RNAi
Coordinadora: Dra. Ana Cristina Caribé (UESC)
Investigadores:
Dres. Raúl René Valle (CEPLAC), Carlos Pirovani (UESC);
Dras. Karina Gramacho (CEPLAC), Acássia Pires (UESC),
Virginia Soares (UESC), Fátima Alvim (UESC)
Sub-proyecto: Silenciamiento génico y
control del fitopa-tógeno Moniliophthora
perniciosa por RNAi

Producir biofungicida a base de moléculas

de RNA duplo filamento (dsRNAs)
homólogos a genes esenciales a procesos
relacionados al desenvolvimiento y
patogenicidad de M. perniciosa
 Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopató-
geno Moniliophthora perniciosa por RNAi
Acción de Pesquisa 1. Realizar identificación y silenciamiento por RNAi
de genes de M. perniciosa esenciales a: infección, crecimiento, nutrición,
reproducción y patogenicidad
Genes candidatos a silenciamiento por el método dsRNA.
Gen Organismos Función probable
Síntesis de quitina - pared
Sintase de quitina (CHS3) Pleurotus, Agaricus
celular de fungos
Septina (SEP/CDC/SPR) Laccaria, Coprinopsis Formación de septos
Trehalose fosfato sintase Síntesis de trehalose - azúcar
Pleurotus, Grifola
(TPS1/TPS2) que regula turgencia.
Previene la acumulación de
Catalasa (CTA1/CTT1) Aspergillus
niveles tóxicos de H2O2
Moniliolisinas (Mp-AaPri1
Pleurotus, Agrocybe Formación del hongo
e MpPri2)
Glucanasa (EGT) Coprinopsis, Postia Degradación de celulosa
Formación de película
Coprinopsis,
Hidrofobinas (CoH1) hidrofóbica en la superficie
Lentinula
de hifas
 Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopató-
geno Moniliophthora perniciosa por RNAi

Acción de Pesquisa 2. Síntesis de vehículos para protección y

entrega de dsRNAi en el hongo Moniliophthora perniciosa, in vivo

1. Síntesis de microesferas de quitosana:

Síntesis de microesferas de quitosana utilizando el
método de coacervación (ARAL et al., 2000; BERTHOLD et al.,
1996).

2. Síntesis de liposomas:
Síntesis de vesículas unilamelares grandes (LUVs), a
partir de la extrusión de la dispersión lipídica del lipidio
catiónico bromato de dioctadecildimetilamonio
(DODAB) en solución acuosa conteniendo el dsRNA
albo.
 Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopató-
geno Moniliophthora perniciosa por RNAi
Acción de Pesquisa 2. Síntesis de vehículos para protección y
entrega de dsRNAi en el hongo Moniliophthora perniciosa, in vivo

3. Síntesis de cápsides virales: técnica de VIGS

(vírus-induced gene silencing)

Vectores virales - El genoma viral será modificado

removiendo genes de patogenicidad y insiriendo genes o
secuencias que codifiquen moléculas de dsRNA
correspondientes a los albos a ser silenciados
 Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopató-
geno Moniliophthora perniciosa por RNAi
Acción de Pesquisa 3. Elaborar biofungicida a base de dsRNAs
homólogos a genes esenciales al desenvolvimiento o patogeni-
cidad de M. perniciosa

 Producción de la formulación del biofungi-

cida, suspensión concentrada(SC)

 Establecimiento del procedimiento para apli-

cación del biofungicida a base de dsRNAs:
por aspersión o inyección (concentración del
fungicida; equipo para aplicación; período y
condiciones climáticas para aplicación, etc.)
Acción de Pesquisa 3. Elaborar biofungicida a base de
dsRNAs homólogos a genes esenciales al desenvolvimiento
o patogenicidad de M. perniciosa

 Prueba de eficiencia del fungicida en inverna-

dero con clones de cacao con padrones de
resistencia y susceptibilidad e inoculados con
basiodiosporas de M. perniciosa (1,0X105 basio-
diosporas viables/mL)

 Observación y análisis del desenvolvimiento

del hongo y síntomas producidos
GRACIAS