martes, 4 de septiembre de 2018

Ingeniería de proteínas
MATERIA: BIOTECNOLOGÍA
DOCENTE: MARCELA GONZÁLEZ MONTOYA
INTEGRANTES: LILIAN PÉREZ, ALAN MARTÍNEZ, SAÚL DÍAZ, ALFONSO VALDIVIESO, GALO
BLANCO

ESTRUCTURA DE LAS PROTEINAS

La estructura de las proteínas está jerarquizada por varios niveles, los cuales son:

 Estructura primaria: que corresponde a la secuencia de aminoácidos.

 Estructura secundaria: que provoca la aparición de motivos estructurales mediante puentes
de hidrogeno.
 Estructura terciaria: que define la estructura de las proteínas compuestas por un sólo
polipéptido.
 Estructura cuaternaria: unión de dos o más proteínas (hemoglobina)

ESTRUCTURA PRIMARIA
 Combinación lineal de los aminoácidos mediante un tipo de enlace peptídico

ESTRUCTURA SECUNDARIA
 Formación de puentes de hidrógeno
 ∝ Hélice: Cada aminoácido supone un giro de unos 100° en la hélice
 Lámina beta Plegada: Se forma por el posicionamiento paralelo de dos cadenas de
aminoácidos dentro de la misma proteína
 martes, 4 de septiembre de 2018

ESTRUCTURA TERCIARIA
 Los aminoácidos apolares se sitúan hacia el interior y los polares hacia el exterior en medios
acuosos

ESTRUCTURA CUATERNARIA
 Cada una de estas cadenas polipeptídicas recibe el nombre de protómero.
 martes, 4 de septiembre de 2018

INGENIERIA GENÉTICA
La ingeniería genética es una ciencia que manipula directamente el genoma de un organismo, por
medio de un conjunto de técnicas que aíslan, multiplican y modifican los genes del individuo con
el fin de su estudio y beneficio.
Por otra parte, el solo contar con un gen y la capacidad de introducirlo a una célula capaz de
expresarlo, no implica que se disponga de un sistema de reproducción eficiente de la proteína
respectiva, ya que existen diversas variables que pueden afectar los niveles de expresión de una
proteína dada.

Las proteínas no solo son el producto de la expresión de un gen, sino que de igual manera
intervienen de manera directa en la realización de varias de las reacciones biológicas.
Las proteínas pueden tener funciones estructurales de síntesis, y degradación de compuestos
(enzimas), señalización (hormonas), defensa (anticuerpos), etc.
 martes, 4 de septiembre de 2018

INGENIERIA DE PROTEÍNAS
El concepto de ingeniería de proteínas constituye un enfoque experimental donde se analiza la
información de que se dispone acerca de una proteína de interés, desde su secuencia de
aminoácidos y la secuencia de otras proteínas relacionadas evolutivamente, hasta la función
descrita por la misma, las condiciones en que se funciona, la estructura tridimensional de la
misma, la identidad y posición en la secuencia de aminoácidos que tienen un papel importante en
la función de esta.

Con esta información se genera una hipótesis sobre el papel que puede ocasionar un cambio de
algún aminoácido en la proteína; se introduce el cambio diseñado en el gen que codifica para la
proteína.
 martes, 4 de septiembre de 2018

PROTEÍNAS RECOMBINANTES
El primer caso de proteínas recombinantes se data del ´82 donde por medio de la ingeniería
genética se logró biosintetizar insulina humana con bacterias y levaduras por la empresa
Genentech.
En la actualidad se utiliza principalmente a E. coli debido a casi las mismas razones por las que
es utilizado con los vectores de clonación, el conocimiento amplio de su genoma, diferentes
vectores de producción de proteínas y su fácil proliferación.

Sin embargo para lograr algo como lo anterior es necesario diseñar un vector especifico tal como
un plásmido que genere muchas copias asumiendo que un alto número de copias del plásmido
resultare en un alto número de copias del gen de interés.

INGENIERÍA METABÓLICA APLICADA A PROTEÍNAS RECOMBINANTES:

Debido a que no siempre se tiene el hospedero ideal para la producción de PR se han ideado formas
de incrementar o modificar las capacidades celulares de este, en el caso de E. coli la bacteria no es
 martes, 4 de septiembre de 2018

capaz de hacer modificaciones post–traduccionales específicas, y se buscan introducir vías

metabólicas para lograr esto; Otra modificación útil es el transporte de la PR al espacio
periplasmático.
Posteriormente es necesario lisar la célula y extraer solamente las proteínas recombinantes. Para esto
se busca purificar las proteínas debido a que este proceso puede formar cuerpos ajenos al producto
deseado.

PURIFICACION DE PROTEÍNAS
La cromatografía de intercambio iónico es un proceso que permite la separación de iones y moléculas
polares basado en las propiedades de carga de las moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo
de molécula cargada, incluyendo proteínas grandes y nucleótidos y aminoácidos pequeños. La
solución que debe inyectarse normalmente se denomina "muestra", y los componentes separados
individualmente se llaman analitos. Se emplea a menudo en purificación de proteínas, análisis del
agua o control de calidad.
Por otro lado, la cromatografía de afinidad se basa en la unión específica y reversible de una proteína
a un ligando unido a la matriz. El ligando puede unirse de manera directa a la proteína de interés o a
una etiqueta molecular que se encuentre ligada a la proteína. La cromatografía de afinidad es, en
general, la técnica de purificación más robusta y típicamente se utiliza en los pasos tempranos del
esquema de purificación. La purificación por cromatografía de afinidad puede ser el único paso
requerido para lograr un grado de pureza adecuado, dependiendo de la aplicación que se le quiera dar
a la proteína.

“PROTEIN ENGINEERING OF CYTOCHROME P450CAM (CYP101) FOR THE OXIDATION

OF POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS”
 Autores: Harford-Cross, C. F., Carmichael, A. B., Allan, F. K., England, P. A., Rouch, D. A.,
& Wong, L. L.
 Revista: Protein engineering, design and selection.
 FI: 2.283
En este artículo se realizaron diversas mutaciones dentro del citocromo P450cam (CyP101) aislado de
la bacteria Pseudomonas putida para observar las reacciones de oxidación que esta es capaz de
realizar ante un grupo de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP). Las mutaciones fueron
realizadas en dos partes, en la primera parte se realizaron dos mutaciones que fueron dadas en el
aminoácido número 96 (tirosina), en el primer caso la sustituyeron por alanina (Y96A) y en el
segundo por fenilalanina (Y96F). En la segunda parte, realizaron dos mutaciones dobles, ambos con
la mutación Y96F presente, en el primer caso sustituyeron el aminoácido 87 (fenilalanina) por alanina
(F87A-Y96F) y en el segundo caso por leucina (F87L-Y96F). Estas mutaciones demostraron mejorar
en gran medida la oxidación de los HAP fenantreno, fluoranteno y pireno. Los citocromos mutados
fueron expuestos a los HAPs ya mencionados, junto con un grupo control con el CYP101 sin
modificaciones (WT), sin embargo, este WT tuvo una actividad mínima (<3.16%) ante estos
sustratos. El fenantreno se oxidó a 1-,2-,3- y 4-fenantrol, teniendo un mayor rendimiento con la
 martes, 4 de septiembre de 2018

mutación F87L-Y96F (75% para 1-fenantrol). Este es el único caso donde la enzima WT tuvo una
actividad oxidativa mayor a 0.5% con un rendimiento del 9%. Por otro lado, el fluoranteno fue
oxidado principalmente a 3-fluorantol teniendo una mayor actividad la variante Y96A con un
rendimiento del 85%, cabe mencionar que en este caso la enzima WT ni siquiera mostró actividad.
En el último caso, el pireno fue oxidado principalmente a 1-pirenol por la mutación Y96A. El estudio
de la oxidación de los HAPs es de mucha importancia para futuras investigaciones en el ámbito de la
biorremediación, debido a que estos hidrocarburos son muy difíciles de degradar y suponen un gran
riesgo para la contaminación ambiental.

BIBLIOGRAFÍA
 Harford-Cross, C. F., Carmichael, A. B., Allan, F. K., England, P. A., Rouch, D. A., & Wong,
L. L. (2000). Protein engineering of cytochrome P450cam (CYP101) for the oxidation of
polycyclic aromatic hydrocarbons. Protein engineering, 13(2), 121-128.
 Schlichting, I., Berendzen, J., Chu, K., Stock, A. M., Maves, S. A., Benson, D. E,& Sligar,
S. G. (2000). The catalytic pathway of cytochrome P450cam at atomic
resolution. Science, 287(5458), 1615-1622.
 Keller, R. M., Wüthrich, K., & Debrunner, P. G. (1972). Proton magnetic resonance reveals
high-spin iron (II) in ferrous cytochrome P450cam from Pseudomonas putida. Proceedings
of the National Academy of Sciences, 69(8), 2073-2075.