Tema 3.

Procesamiento de RNA y coordinación de los procesos

co-transcripcionales

• Corte y poliadenilación de RNA (procesamiento 3´de RNA).

• Eliminación de intrones (RNA splicing).

• Auto-splicing, RNA con capacidad catalítica.

• Procesamiento de RNA ribosómico y transferente.

Bibliografía:
Lodish, Meistner, , Lewin, Luque y Herráez ..todos incluyen información del tema
-Material preparado por M.Freire:
-Información específica de la presentación y de trabajos de investigación del grupo.ó
extraída de artículos específicos que se citan en las correspondientes diapositivas.
-Enlaces en cada tema a páginas web
MFP
Terminación no es = procesamiento 3´

Terminación

(Luo et al., 2006)

Procesamiento 3´de RNA

MFP
Procesamiento 3´de RNAs: corte y poliadenilación Repaso
Secuencias determinantes del corte y la poliadenilación del pre-mRNA

En mamíferos altamente conservado

Py(A) 30 nt
10-30 nt

TAA AAUAAA CA U/UG-Rich

3´-UTR (3´-UnTRanslated Region)

3´-no traducida
MFP
Procesamiento 3´de RNAs: corte y poliadenilación

Elementos cis en levaduras (Ejemplo de variabilidad en otras especies)

- En levaduras las secuencias 3´son mas complejas y menos conservadas

que en mamíferos.
- Intervienen en la selección del punto de corte y poliadenilación y en la
eficiencia del procesamiento.

Punto de corte y poliadenilación

TAA e1 e2 e3 e4
UAUAUA AAUAAA UUUUUU UUUUUU
UAUGUA AAAAAA UUUUCU UUUUCU
UACAUA AAGAAA
5-10nt

10-30nt
5-15nt

30-70nt
(Graber JH, 2003) MFP
Procesamiento 3´de RNAs: corte y poliadenilación

Elementos trans

- La maquinaria de procesamiento 3´ está formada por

varios complejos.
- Conservada en gran medida entre mamíferos y levaduras.

CPSF:Cleavage and polyadenylation specific factor

CstF: Cleavage stimulation Specific factor
Complejos: CFI y CFII Cleavage factors
PAP: Poly (A) polimerasa
PABP: Poly (A) Binding Protein (proteina de unión a polyA

MFP
Procesamiento 3´de RNAs: corte y poliadenilación

Ejemplo de complejidad y conservación

Complejo Subunidades Homólogos en mamíferos
CFIA  RNA14 CstF-77 (24%)
Cleavage Factor  RNA15 CstF-64 (43%)
 PCFC11
 CLP1

CFIB  HRP1/NAB4
Cleavage Factor

CPF  CFT1/YHH1 CPSF-160 (24%)

 CFT2/YDH1 CPSF-100 (24%)
Cleavage and
 BRR5/YSH1 CPSF-73 (53%)
Polyadenylation
 PTA1
Factor
 PFS1
 PFS2
 FIP1
 YTH1 CPSF-30 (40%)
 Desconocida (90kDa)
(Zhao J et al., 1999; Kyburz A et al. 2003)
MFP
Corte y poliadenilación 3’ ó procesamiento 3´de RNAs

Las interacciones entre sub-complejos se conocen gracias a diferentes

análisis genéticos y bioquímicos
HOLO-CPF
CPF
APT= associated with Pta1
APT Mpe1
Cft1 Yth1
Swd2 Syc1
Ref2 Pti1 Pta1 Cft2 Pap1
Glc7
Ssu72 Ysh1
Fip1
Pfs2

CFII
PFI

Nedea et al., 2003; He et al., 2003.

MFP
Corte y poliadenilación 3’ ó procesamiento 3´de RNAs

CFT1
CFT2
CPF BRR5
PTA1

CPF

(Zhao J et al., 1999; Kyburz A et al. 2003)

Enzimas que catalizan la reacción de poliadenilación
PAP1: cataliza la reacción de adición de adeninas.
PAB1: controla la longitud de la cola poly (A).
PAN: responsable del acortamiento de la cola poly (A).

MFP
Corte y poliadenilación 3’ ó procesamiento 3´de RNAs

Posicionamiento de la
maquinaria de procesamiento 3´

poliadenilación
Corte
endonucleolítico
del RNA

MFP
Corte y poliadenilación 3’ ó procesamiento 3´de RNAs

La cola Poly (A ) en crecimiento

está protegida por PABP

PABP= PolyA Binding Protein

MFP
Ensayos de corte y poliadenilación Ejemplo de interpretación de datos
Ensayos de transcripción in vitro, con extractos de levaduras (salvajes ó mutantes)
y [α-32P]UTP, Como molde se utilizan plásmidos linearizados (Zhao et al 1999).

Tras la síntesis in vitro,

el RNA precursor (Pre) Corte y poliadenilación
estará marcado.

Adición de la cola
Poly (A)
En este caso el precursor
Es el de menor
peso molecular
He et al., 2003
MFP
 DNA-Loop
DNA
Aproximando y cohesionando
Promotor (P) y terminador (T)
en genes transcripcionalmente
activos.

Tras la primera ronda de trancripción permi

reciclar la polimerasa al promotor

Factores específicos como Pta1, Ssu72 ó TFIIB

Son necesarios para estabilizar esta estructura
SOLO COMENTAR mRNA
Ansari and Hampsey 2003
MFP
 PDB: 3O2Q
Humanos

Symplekin

Ssu72

MFP
 Poliadenilación alternativa (también puede ser múltiple)
permite obtener 2 (ó más) isoformas transcritas de un gen con diferentes 3´-UTR

REGION CODIFICADORA AAAAAAAAAAAA

REGION CODIFICADORA AAAAAAAAAAAA

Estas regiones 3´-UTR confieren diferentes características que afectan a la capacidad de

factores para unirse a secuencias diana que medien la estabilidad, transporte al
citosol, etc.
mRNAs alternativos
5´

5´

MFP
Procesamiento 5´de RNA y eliminación de intrones

-Procesamiento 5´- guanosilación del extremo 5´-

Adición de CAP

-Eliminación de intrones.

-Auto-splicing, RNA con capacidad catalítica.

MFP
Adición del extremo 5´-Cap Guanosilación
Esta modificacion 5’ se inicia cuando el RNA que se está sintetizando tiene una
longitud de pocos nucleótidos

CBC=Cap Binding Complex

Se une al 5’-cap
y será necesario para los
posteriores procesos de splicing
poliadenilación y
transporte al citosol.

Variantes de Cap 0, 1 y 2
SAM= S-adenosil metionina

http://www.icampus.ucl.ac.be/SBIM2520/document/genemol/biomolespa/transcripcion/transcripcion.html

MFP
Formación del extremo 5´-Cap, reacciones y enzimas implicadas

(GTP)

Extremo
RNA

S-adenosil-metionina

S-adenosil-homocisteina

MFP
Influencia del “Código CTD” en la reacción de adición de 5´-CAP

Las enzimas para la adición de 5´-cap son reclutadas por el extremo CTD de la RNA polimerasa II

MFP
 Enzimas necesarias para la formación del 5´-cap, y pasos siguientes

1º

2º

3º

1 y 2º

3º

MFP
Eliminación de Intrones Repaso

Ver tutorial de splicing en el moodle

Las secuencias determinantes del corte y empalme están altamente conservadas

MFP
Mecanismo de la reacción Repaso
2 reacciones de transesterificación

Intrón en forma de
Lazo (lariant intron)

MFP
 Repaso

Transesterificación

Ataque nucleofílico

MFP
Posicionamiento de la maquinaria de splicing
Repaso

U1=snRNA
Spliceosoma
al menos
snRNPs=small nuclear 70 proteínas
ribonucleo proteins

MFP
 Grupos de intrones Repaso

Grupo I Grupo II Grupo III

Mitocondrias y Núcleo
rRNA
cloroplastos
mRNAs

MFP
 Comparación de las estructuras secundarias en dos tipos de intrones
Auto-splicing
Intrón del grupo II U snRNAs en el espliceosoma

Exones Lodish
MFP
Splicing alternativo y obtención de variantes de inmunoglobulinas

splicing

MFP
Transcripción y procesamiento de RNA ribosómicos eucariotas
Espaciador no
5.8S transcrito 5.8S
18S
DNA 18S 28S 28S

Repeticiones en Tandem RNA polimerasa I

de rRNA y 45S transcripción

Pre-rRNA

Procesamiento de
rRNA (varios pasos)

30 proteínas 30 proteínas

Subunidades ribosómicas

Separación por corte con enzimas específicas

MFP